專利名稱：截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌的微量培養(yǎng)方法和其高產(chǎn)菌的高通量篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌的微量培養(yǎng)方法和其高產(chǎn)菌的高通量篩選方法。
背景技術(shù)：
截短側(cè)耳素類衍生物有沃尼妙林、泰妙菌素等，主要作為預(yù)混劑添加于動(dòng)物飼料中，不僅有預(yù)防豬瘧疾和肺炎的作用，還可以增加肉豬產(chǎn)量。截短側(cè)耳素類抗生素在生產(chǎn)實(shí)踐中的作用日漸突出，其發(fā)酵研究也逐漸成為研究熱點(diǎn)，為了提高發(fā)酵產(chǎn)量，選育高產(chǎn)菌株是截短側(cè)耳素類抗生素應(yīng)用的突破點(diǎn)。目前高通量的微生物微量培養(yǎng)和檢測(cè)方法正逐步成為菌種篩選的主要方式，但各種微生物的微量培養(yǎng)方法不同，針對(duì)截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌的一類高等擔(dān)子真菌的微量培養(yǎng)方法還沒有被完善的建立起來；快速檢測(cè)技術(shù)主要是基于高通量的酶標(biāo)儀光學(xué)檢測(cè)，但有效、 快速、準(zhǔn)確的針對(duì)截短側(cè)耳素類抗生素等二萜烯類物質(zhì)的微量檢測(cè)方法也未見報(bào)道。將酶標(biāo)儀檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于高通量的高產(chǎn)菌種篩選的關(guān)鍵在于，產(chǎn)物出現(xiàn)穩(wěn)定的特征吸收峰以及產(chǎn)物高效的轉(zhuǎn)板問題。只有將微量培養(yǎng)和酶標(biāo)儀檢測(cè)相結(jié)合才能夠很好的解決這一問題，而目前的微量培養(yǎng)以及高通量檢測(cè)技術(shù)均不適用于截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌一類的高等擔(dān)子真菌，以及其特殊的二萜烯類結(jié)構(gòu)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌的微量培養(yǎng)方法，本發(fā)明還提供截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌的高通量篩選方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明提供一種截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌的微量培養(yǎng)方法，所述微量培養(yǎng)方法的步驟如下
1 )、將截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌稀釋成菌懸液，涂布于平板，培養(yǎng)后分離單菌落；
2)、配制固體發(fā)酵培養(yǎng)基以下為質(zhì)量百分含量葡萄糖5.7%、玉米漿4%、大豆油0. 4%、 MgSO4O. 04%、大豆蛋白胨1%、瓊脂粉1. 5%，其余為水；
3)、將步驟2)中的固體發(fā)酵培養(yǎng)基高壓滅菌后在無菌環(huán)境中將其加入酶標(biāo)板，每孔加入量為孔體積的1/3-2/3 ；
4)、將步驟1)中形成的截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌的單菌落菌絲體接種于步驟3)中制備的酶標(biāo)板中，于25°C培養(yǎng)7-9天，完成截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌的微量培養(yǎng)。進(jìn)一步地，步驟3)中所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基的每孔加入量為孔體積的1/2。本發(fā)明還提供一種截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，所述高通量篩選方法的步驟如下
1)將截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌稀釋成菌懸液，涂布于平板，培養(yǎng)后分離單菌落；
2)、配制固體發(fā)酵培養(yǎng)基以下為質(zhì)量百分含量葡萄糖5.7%、玉米漿4%、大豆油0. 4%、 MgSO4O. 04%、大豆蛋白胨1%、瓊脂粉1. 5%，其余為水；3)、將步驟2)中的固體發(fā)酵培養(yǎng)基高壓滅菌后在無菌環(huán)境中將其加入酶標(biāo)板，每孔加入量為孔體積的1/3-2/3 ；
4)、將步驟1)中形成的截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌的單菌落菌絲體接種于步驟3)中制備的酶標(biāo)板中，于25 °C培養(yǎng)7-9天；
5)、在步驟4)的每孔中加入50-100μ 1甲醇或乙醇提??；
6)、每孔吸取一定量提取液，轉(zhuǎn)板于另一酶標(biāo)板中；
7)、向每孔加入濃硫酸顯色，所述濃硫酸的體積大于等于提取液的體積；
8)、將每孔稀釋相同倍數(shù)，吸取稀釋液轉(zhuǎn)板于另一酶標(biāo)板中，在450nm-460nm波長(zhǎng)處進(jìn)行酶標(biāo)儀的紫外吸收測(cè)定，分析測(cè)定結(jié)果，得到篩選后的截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌。進(jìn)一步地，步驟3)中所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基的每孔加入量為孔體積的1/2。進(jìn)一步地，步驟7)中所述濃硫酸的體積與提取液的體積相同。此時(shí)可保證截短側(cè)耳素在顯色充分的同時(shí)濃硫酸用量最少。進(jìn)一步地，步驟8)中的稀釋倍數(shù)為10-100倍。此時(shí)可以保證稀釋后的提取液濃度在酶標(biāo)儀的檢測(cè)范圍內(nèi)。進(jìn)一步地，步驟8)中在455nm波長(zhǎng)處進(jìn)行酶標(biāo)儀的紫外吸收測(cè)定。進(jìn)一步地，步驟5)中提取時(shí)間為5-20分鐘。進(jìn)一步地，步驟5)中提取時(shí)間為10分鐘。本發(fā)明的技術(shù)方案的技術(shù)效果如下
1.提供了一種截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌的微量培養(yǎng)方法。由于高通量單菌落轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，各個(gè)孔間沒有交叉影響，并且菌落生長(zhǎng)環(huán)境高度一致，營(yíng)養(yǎng)條件受到制約，在這種情況下，產(chǎn)量高低完全取決于菌種本身的遺傳基因。2.由于采用固體發(fā)酵技術(shù)，發(fā)酵過程簡(jiǎn)化，靜止培養(yǎng)過程中不需要過多調(diào)整培養(yǎng)基等條件，使各個(gè)單菌落間培養(yǎng)條件在整個(gè)發(fā)酵過程中保持一致，減少了人為操作等處理帶來的誤差。固體發(fā)酵培養(yǎng)基的每孔加入量為孔體積的1/3-2/3時(shí)，既可以保證菌體足夠的生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)需要，又留有足夠的空間，保證氧氣供應(yīng)。3.由于采用多孔板培養(yǎng)，使原來的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)規(guī)模得到大大增加，采用96孔酶標(biāo)板培養(yǎng)，一人次可以轉(zhuǎn)接1000個(gè)菌株以上，每輪篩選效率提高了 100倍以上，并且能夠保證所有一次轉(zhuǎn)接菌株培養(yǎng)條件的一致性。4.由于采用固體發(fā)酵，簡(jiǎn)化了種子培養(yǎng)這一步驟，直接進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間大大縮短，傳統(tǒng)發(fā)酵周期縮短一半，每個(gè)月可進(jìn)行四輪篩選，且培養(yǎng)條件更加易于操控。5.由于整個(gè)過程只有一次傳代培養(yǎng)，對(duì)于遺傳背景易受環(huán)境影響的微生物，減少了多次傳代遺傳背景變化的幾率，能夠?qū)⒏弋a(chǎn)量菌種快速分離，得到更好的保持。6.截短側(cè)耳素提取方便，只用一種試劑就可以完成提取截短側(cè)耳素高度溶解于甲醇或乙醇。且在微量環(huán)境中，過量的提取劑還會(huì)破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使截短側(cè)耳素提取的更加充分，更好的體現(xiàn)產(chǎn)量的高低。7.提取時(shí)間短，5分鐘即可將微孔板中截短側(cè)耳素提取至溶劑中，微量化避免了提取的不完全，結(jié)果更加可靠。8.提取液轉(zhuǎn)板使截短側(cè)耳素快速與培養(yǎng)條件分離，培養(yǎng)時(shí)間相同，檢測(cè)環(huán)境統(tǒng)一； 顯色反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，顯色時(shí)間短，過量的顯色劑使所有截短側(cè)耳素充分顯色，因此，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)到的截短側(cè)耳素含量即為發(fā)酵得到的截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌中的截短側(cè)耳素含量。9.提取得到的截短側(cè)耳素經(jīng)過濃硫酸的顯色反應(yīng)，生成有色物質(zhì)，避免了其他干擾物質(zhì)對(duì)測(cè)定截短側(cè)耳素產(chǎn)量的影響，且顯色時(shí)間短，20s-60s就可完成顯色，濃硫酸的體積大于等于提取液的體積時(shí)，可以確保顯色充分。濃硫酸是萜類物質(zhì)的特定顯色物質(zhì)，應(yīng)用濃硫酸進(jìn)行顯色使生成的產(chǎn)物具有穩(wěn)定的特征吸收峰，進(jìn)一步增加結(jié)果的可信度。10.反應(yīng)結(jié)束后立即進(jìn)行酶標(biāo)儀紫外吸收的測(cè)定，每96孔酶標(biāo)板測(cè)定時(shí)間為2秒， 短時(shí)間內(nèi)可以進(jìn)行大量酶標(biāo)板的測(cè)定，目前高效液相測(cè)定為一次12分鐘測(cè)定一個(gè)樣品，本發(fā)明的酶標(biāo)儀測(cè)定方法檢測(cè)的效率是用高效液相檢測(cè)的效率的34560倍。11.整個(gè)過程在各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行了高通量化，以及時(shí)間的壓縮，在一人操作情況下篩選效率大幅度提高高通量發(fā)酵時(shí)間是原來發(fā)酵時(shí)間的一半；一人可以操作10個(gè) 96孔微孔板共計(jì)發(fā)酵菌株960個(gè)，常規(guī)搖瓶發(fā)酵最多一次操作12個(gè)菌株，發(fā)酵過程效率提高了 2X960/12=160 ；測(cè)定過程效率是原來的34560倍，篩選效率是原來篩選效率的 34560X160=5529600倍，并且能夠保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。


圖1是應(yīng)用本發(fā)明的高通量篩選方法與應(yīng)用普通的篩選方法(搖瓶發(fā)酵篩選、高效液相色譜測(cè)定的方法)數(shù)據(jù)對(duì)比圖。其中，橫坐標(biāo)為挑選出的截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌的菌株編號(hào)，縱坐標(biāo)為截短側(cè)耳素濃度(μ g/ml)，顏色深的柱體表示的是應(yīng)用本發(fā)明的高通量篩選方法得到的截短側(cè)耳素濃度，顏色淺的柱體表示的是應(yīng)用普通的篩選方法得到的截短側(cè)耳素濃度。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。本發(fā)明中所使用的試劑如下
截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌菌株產(chǎn)自保加利亞，型號(hào)HK-101 ；
固體發(fā)酵培養(yǎng)基每100克中包含葡萄糖5. 7g、玉米漿4g、大豆油0. 4g、MgSO4O. 04g、 大豆蛋白胨lg、瓊脂粉1. 5g，水87. 36g ； 96孔酶標(biāo)板。實(shí)施例1
截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌的微量培養(yǎng)步驟如下
(1)用無菌水將截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌稀釋10倍，制成菌懸液，涂布于平板，25°C培養(yǎng)3-5 天，分離單菌落；
(2)制備含有1/2固體發(fā)酵培養(yǎng)基的96孔酶標(biāo)板備用將固體發(fā)酵培養(yǎng)基121°C高壓滅菌15分鐘，在超凈臺(tái)中無菌操作將其加入96孔酶標(biāo)板，每孔加入量150μ 1 ；
(3)用竹簽挑取步驟(1)中形成的截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌的單菌落菌絲體，將其接種于含有固體發(fā)酵培養(yǎng)基的96孔酶標(biāo)板中，復(fù)板一次，留作搖瓶鑒定使用；
(4)將接種后的96孔酶標(biāo)板于25°C培養(yǎng)7天，完成截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌的微量培養(yǎng)。截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌的高通量篩選方法如下(1)在上述含有經(jīng)過微量培養(yǎng)后的截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌的酶標(biāo)板孔中每孔加入100μ1 甲醇，提取10分鐘；
(2)提取結(jié)束后，每孔吸取50μ 1提取液，轉(zhuǎn)板于另一 96孔酶標(biāo)板中；
(3)向每孔加入50 μ 1濃硫酸，使之充分顯色反應(yīng)，顯色時(shí)間為20s，反應(yīng)結(jié)束后，將每孔稀釋10倍，吸取200 μ 1稀釋液轉(zhuǎn)板于另一 96孔酶標(biāo)板中，在455nm處進(jìn)行酶標(biāo)儀的紫外吸收測(cè)定；
(4)紫外吸收測(cè)定的OD值如表1所示，OD值越高代表截短側(cè)耳素濃度越大，從中挑選出OD值高的孔，共挑選出11個(gè)，這11個(gè)孔相對(duì)應(yīng)的菌株為篩選出的截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌， 截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌在96孔酶標(biāo)板中的位置序號(hào)按OD值高低依次為B10，Cll, C8，H6，H7， E9，C9，B9,，H5，CIO, G7。將其由 1-11 進(jìn)行編號(hào)。表 權(quán)利要求
1.一種截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌的微量培養(yǎng)方法，其特征在于所述微量培養(yǎng)方法的步驟如下1 )、將截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌稀釋成菌懸液，涂布于平板，培養(yǎng)后分離單菌落；2)、配制固體發(fā)酵培養(yǎng)基以下為質(zhì)量百分含量葡萄糖5.7%、玉米漿4%、大豆油0. 4%、 MgSO4O. 04%、大豆蛋白胨1%、瓊脂粉1. 5%，其余為水；3)、將步驟2)中的固體發(fā)酵培養(yǎng)基高壓滅菌后在無菌環(huán)境中將其加入酶標(biāo)板，每孔加入量為孔體積的1/3-2/3 ；4)、將步驟1)中形成的截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌的單菌落菌絲體接種于步驟3)中制備的酶標(biāo)板中，于25°C培養(yǎng)7-9天，完成截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌的微量培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微量培養(yǎng)方法，其特征在于步驟3)中所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基的每孔加入量為孔體積的1/2。
3.一種截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，其特征在于所述高通量篩選方法的步驟如下1)將截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌稀釋成菌懸液，涂布于平板，培養(yǎng)后分離單菌落；2)、配制固體發(fā)酵培養(yǎng)基以下為質(zhì)量百分含量葡萄糖5.7%、玉米漿4%、大豆油0. 4%、 MgSO4O. 04%、大豆蛋白胨1%、瓊脂粉1. 5%，其余為水；3)、將步驟2)中的固體發(fā)酵培養(yǎng)基高壓滅菌后在無菌環(huán)境中將其加入酶標(biāo)板，每孔加入量為孔體積的1/3-2/3 ；4)、將步驟1)中形成的截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌的單菌落菌絲體接種于步驟3)中制備的酶標(biāo)板中，于25 °C培養(yǎng)7-9天；5)、在步驟4)的每孔中加入50-100μ 1甲醇或乙醇提??；6)、每孔吸取一定量提取液，轉(zhuǎn)板于另一酶標(biāo)板中；7)、向每孔加入濃硫酸顯色，所述濃硫酸的體積大于等于提取液的體積；8)、將每孔稀釋相同倍數(shù)，吸取稀釋液轉(zhuǎn)板于另一酶標(biāo)板中，在450nm-460nm波長(zhǎng)處進(jìn)行酶標(biāo)儀的紫外吸收測(cè)定，分析測(cè)定結(jié)果，得到篩選后的截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，其特征在于步驟3) 中所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基的每孔加入量為孔體積的1/2。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，其特征在于步驟7) 中所述濃硫酸的體積與提取液的體積相同。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，其特征在于步驟8) 中的稀釋倍數(shù)為10-100倍。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，其特征在于步驟8) 中在455nm波長(zhǎng)處進(jìn)行酶標(biāo)儀的紫外吸收測(cè)定。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，其特征在于步驟5) 中提取時(shí)間為5-20分鐘。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，其特征在于步驟5) 中提取時(shí)間為10分鐘。
全文摘要
本發(fā)明提供一種截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌的微量培養(yǎng)方法，步驟如下將截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌經(jīng)培養(yǎng)后分離單菌落；配制固體發(fā)酵培養(yǎng)基高壓滅菌后加入酶標(biāo)板的各孔中，將截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌的單菌落菌絲體接種于酶標(biāo)板中培養(yǎng)7-9天。本發(fā)明還提供截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，步驟如下將經(jīng)微量培養(yǎng)的截短側(cè)耳素產(chǎn)生菌的酶標(biāo)板孔中加入提取液提取，每孔吸取提取液進(jìn)行轉(zhuǎn)板，加入顯色劑顯色，用酶標(biāo)儀測(cè)定并分析結(jié)果，得到篩選后的截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌。由于采用固體發(fā)酵，簡(jiǎn)化了種子培養(yǎng)這一步驟，發(fā)酵時(shí)間大大縮短。應(yīng)用本發(fā)明的高通量篩選方法和普通的篩選方法相比相關(guān)系數(shù)良好，可知本發(fā)明的高通量篩選方法能應(yīng)用于截短側(cè)耳素高產(chǎn)菌的篩選。
文檔編號(hào)C12N1/00GK102352317SQ20111031006
公開日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月13日
發(fā)明者尚若峰, 梁劍平, 王學(xué)紅, 趙曉彬, 郝寶成, 郭志廷, 郭文柱, 陶蕾 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所