專利名稱：一種重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶的方法，屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
堿性果膠酶一般指聚半乳糖醛酸裂解酶(E. C. 4. 2. 2.2,簡稱PGL)，其最適pH在 8 10，可以在高pH條件下以反式消去作用斷開果膠聚合物主鏈，產(chǎn)生Δ4:5不飽和的寡聚半乳糖醛酸。堿性果膠酶可用于紡織品前處理的精練工藝，從而取代傳統(tǒng)的堿煮法，不但能夠降低能耗和廢水處理難度，同時(shí)還可以提高產(chǎn)品質(zhì)量，提升產(chǎn)品的國際競爭力，是目前紡織生物技術(shù)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。目的蛋白的產(chǎn)量和分泌效率取決于多個(gè)因素，其中適宜的流加策略和誘導(dǎo)策略對于發(fā)酵罐水平蛋白表達(dá)來說，是關(guān)鍵因素。然而，需要注意的是，在指數(shù)流加過程中，當(dāng)誘導(dǎo)開始后，實(shí)際比生長速率(μ Ρ)往往明顯低于設(shè)定比生長速率(ysJ，營養(yǎng)物質(zhì)不斷的積累，從而導(dǎo)致細(xì)胞生理和代謝的大幅變化，進(jìn)而影響目的蛋白的合成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供一種利用重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶的方法。為解決上述問題提供如下技術(shù)方案Whcherichia coli BL21(DE3)為出發(fā)菌株，其特征在于，步驟如下1)發(fā)酵培養(yǎng)基中初始甘油濃度為6_14g L-1，待甘油耗盡DO上升后，按照比生長速率為0. 15-0. 23h-l指數(shù)流加甘油；2)直至菌體干重達(dá)到12-18g L-I，降低溫度同時(shí)加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，以6_18mL h-1的速率進(jìn)行甘油培養(yǎng)基流加直至發(fā)酵結(jié)束。具體而言步驟如下誘導(dǎo)前(菌體生長階段)控制重組大腸桿菌生長階段溫度為37°C，發(fā)酵培養(yǎng)基為 MTB，初始甘油濃度為6-14g L-1，待發(fā)酵罐中甘油耗盡，DO陡然上升后，以指數(shù)方式流加甘油(μ set = 0. 2)，以通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速控制DO為30%，直到菌體干重達(dá)到12-18g L-I ；誘導(dǎo)后(PGL高表達(dá)階段)將溫度降低為同時(shí)加入0. 05mM IPTG，以6_18mL h-1的速率進(jìn)行甘油培養(yǎng)基流加，維持DO為30% ；整個(gè)過程用25%氨水(ν/ν)控制pH為7. 0，空氣流量設(shè)為1. 8(L mirT1)。菌種E.coli BL21DE3 (pET-20b(+) PGL)，為胞外分泌表達(dá)，構(gòu)建方法見 Shuying Fang, Jian Chen, et al. Overproduction of alkaline polygalacturonate lyase in a recombinant Escherichia coli by a two-stage glycerol feeding approach. Bioresource Technology,doi :10.1016/j.biortech. 2011. 09. 020. In Press。培養(yǎng)基成分如下種子培養(yǎng)基(LB)酵母粉5g L—1，胰蛋白胨6-14g L-l,NaCl 6_14g L-1，氨芐青霉素 0. ImM, pH 7. 0發(fā)酵培養(yǎng)基(MTB)甘油6-14g L-1，酵母粉 24g L—1，蛋白胨 12g L-1，KH2P0417mM, K2HP0472mM,氨節(jié)青霉素 0. ImMMTB 培養(yǎng)基甘油 6-14g L-1，酵母粉 24g L-1，蛋白胨 12g L-1，KH2P0417mM, K2HP0472mM,氨節(jié)青霉素 0. ImM固體平板培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基，1. 5%瓊脂流加甘油培養(yǎng)基甘油500g ΙΛ酵母粉50g L—1，蛋白胨50g L—1培養(yǎng)方法如下種子培養(yǎng)將保藏的菌種接入裝有25mL LB培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，回旋式搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)8h。發(fā)酵培養(yǎng)將LB中菌液以5%接種量接種至全自動(dòng)3L發(fā)酵罐(BioFlo 110，New Brunswick Scientific Co.)指數(shù)流加按照如下公式進(jìn)行F{t；=F(t)流加速率, :細(xì)胞密度，Vtl 初始體積，Sf 補(bǔ)料液中甘油濃度，yset:比生長速率為0. 2，Yx/S 對底物細(xì)胞得率。乙酸是好氧發(fā)酵的胞外副產(chǎn)物，當(dāng)其濃度超過2. Og L—1，將影響細(xì)胞生長和外源蛋白合成，乙酸的生成的抑制可以通過控制比生長速率來實(shí)現(xiàn)，對于^^！^！^油化COli BL21(DE3)，控制比生長速率0. 15-0. 23h_l以下時(shí)乙酸濃度不超過2. Og L-1。堿性果膠酶測定方法取一定量發(fā)酵液于IOOOOr mirT1離心lOmin，上清液作為堿性果膠酶活性測定的樣品。反應(yīng)體系中包括粗酶稀釋液20 μ 1，2mL含0. 2%聚半乳糖醛酸的甘氨酸-NaOH緩沖液(0. 2moir1, pH 9. 4，含有0. 44mmol L-1的CaC12)，以無活性的酶液(即提前加入終止液的酶液)作為空白對照，以含底物的緩沖溶液的加入起動(dòng)酶促反應(yīng)；反應(yīng)條件為45°C反應(yīng) 15min，用3mL0. 03mol L—1的磷酸終止反應(yīng)，在235nm處測定其吸光度值。一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活單位定義為每分鐘使聚半乳糖醛酸裂解產(chǎn)生1 μ mol的不飽和聚半乳糖醛酸的酶量。
OD23 5 X 106 X dilution factor X volume of mixture酶活計(jì)算
103 XtX 4600 XbX volume of enzyme preparation4600 (L/mol/cm)不飽和聚半乳糖醛酸在235nm處的摩爾吸光系數(shù)t(min)酶促反應(yīng)時(shí)間(在酶反應(yīng)的線性范圍內(nèi))b (cm)比色杯厚度本發(fā)明方法簡單易行，大幅提高了堿性果膠酶的產(chǎn)量與生產(chǎn)強(qiáng)度以及分泌表達(dá)效率，有利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。同時(shí)對于指導(dǎo)其他大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)外源蛋白量的提高有重要意義。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
菌種E.coli BL21DE3 (pET_20b (+) PGL)，為胞外分泌表達(dá)。培養(yǎng)基1)種子培養(yǎng)基(LB)酵母粉5g L—1，胰蛋白胨6_14g L-I, NaCl 6_14g L-1，氨芐青霉素ImM，pH 7. 02)發(fā)酵培養(yǎng)基(MTB)甘油 6-14g L_l，酵母粉Mg Λ 蛋白胨 12g L—1，KH2PO417mM， K2HP0472mM,氨節(jié)青霉素 0. ImM幻固體平板培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基，1. 5 %瓊脂4)甘油流加培養(yǎng)基甘油500g L—1，酵母粉50g L—1，蛋白胨50g L-1培養(yǎng)方法1)種子培養(yǎng)將保藏的菌種接入裝有25mL LB培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，回旋式搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)他?；冒l(fā)酵培養(yǎng)將LB中菌液以5%接種量接種至全自動(dòng)3L發(fā)酵罐(BioFlo 110,New Brunswick Scientific Co.)。采用MTB培養(yǎng)基(包含100 μ g mL—1氨芐青霉素)為發(fā)酵培養(yǎng)基，整個(gè)過程可以分為三個(gè)階段1)初始甘油濃度為6g L-1，培養(yǎng)溫度為37°C，當(dāng)DO反彈甘油耗盡后，開始第二階段；2)按照如下公式進(jìn)行指數(shù)流加甘油培養(yǎng)基，比生長速率為0. 151Γ1Fit；=:‘“巧，路‘)(1)
^i1X SF(t)為流加速率(L h-1)，X0為細(xì)胞密度(gcell L-1)，V0為初始體積(L)，Sf代表補(bǔ)料液中甘油濃度(g Γ1), Psrt為設(shè)定的比生長速率OT1)，^s對底物細(xì)胞得率fe。ell gg^ee^r1)，依據(jù)計(jì)算公式，每小時(shí)調(diào)整一次流加速率，當(dāng)細(xì)胞干重達(dá)到12g L-1，加入0. 05mM IPTG，同時(shí)將培養(yǎng)溫度降至^°C，開始誘導(dǎo)果膠酶(PGL)表達(dá)；3)甘油流加速率為恒定的6mLh_l，在整個(gè)過程中，用25% (ν/ν)的氨水控制pH為 7.0，維持DO為30%，空氣流量為1. SLmirT1。堿性果膠酶總產(chǎn)量與胞外產(chǎn)量分別為303. OU mL—1和219.3U mL—1，生產(chǎn)強(qiáng)度為 6. 4U Hir1IT1。實(shí)施例2 發(fā)酵過程參數(shù)略有不同，其余材料和方法同實(shí)施例1，采用MTB培養(yǎng)基(包含 IOOyg mL—1氨芐青霉素)為發(fā)酵培養(yǎng)基，整個(gè)發(fā)酵過程可以分為三個(gè)階段1)初始甘油濃度為IOg L-I，培養(yǎng)溫度為37°C，當(dāng)DO反彈甘油耗盡后，開始第二階段；2)按照如下公式進(jìn)行指數(shù)流加甘油培養(yǎng)基，比生長速率為0.池―1Fit；=:‘”巧Γ 路”《
iC'Σ SF(t)為流加速率(L h-1)，X0為細(xì)胞密度(gcell L-1)，V0為初始體積(L)，Sf代表補(bǔ)料液中甘油濃度(g Γ1), Psrt為設(shè)定的比生長速率0Γ1)，Yx/S對底物細(xì)胞得率fe。ell k—1)，依據(jù)計(jì)算公式，每小時(shí)調(diào)整一次流加速率，當(dāng)細(xì)胞干重達(dá)到16g L-1，加入0. 05mMIPTG，同時(shí)將培養(yǎng)溫度降至^°C，開始誘導(dǎo)果膠酶(PGL)表達(dá)；3)甘油流加速率為恒定的12mL h_l，在整個(gè)過程中，用25% (ν/ν)的氨水控制ρΗ 為7.0，維持DO為30%，空氣流量為1. SLmirT1。堿性果膠酶總產(chǎn)量與胞外產(chǎn)量分別為371. 8U mL—1和257. 8U mL—1，生產(chǎn)強(qiáng)度為 7. IU mLH實(shí)施例3 發(fā)酵過程參數(shù)略有不同，其余材料和方法同實(shí)施例1，采用MTB培養(yǎng)基(包含 IOOyg mL—1氨芐青霉素)為發(fā)酵培養(yǎng)基，整個(gè)發(fā)酵過程可以分為三個(gè)階段1)初始甘油濃度為14g L-I，培養(yǎng)溫度為37°C，當(dāng)DO反彈甘油耗盡后，開始第二階段；2)按照如下公式進(jìn)行指數(shù)流加甘油培養(yǎng)基，比生長速率為0. 231Γ1
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bS1X SF (t)為流加速率(L h-1)，X0為細(xì)胞密度(gcell L-1)，V0為初始體積(L)，Sf代表補(bǔ)料液中甘油濃度(g Γ1), Psrt為設(shè)定的比生長速率0Γ1)，Yx/S對底物細(xì)胞得率fe。ell k—1)，依據(jù)計(jì)算公式，每小時(shí)調(diào)整一次流加速率，當(dāng)細(xì)胞干重達(dá)到18g L-1，加入0. 05mM IPTG,同時(shí)將培養(yǎng)溫度降至^°C，開始誘導(dǎo)果膠酶(PGL)表達(dá)；3)甘油流加速率為恒定的18mL h_l，在整個(gè)過程中，用25% (ν/ν)的氨水控制ρΗ 為7.0，維持DO為30%，空氣流量為1. SLmirT1。堿性果膠酶總產(chǎn)量與胞外產(chǎn)量分別為330. 5U mL—1和193. 8U mL—1，生產(chǎn)強(qiáng)度為 5. IU mdT1。
權(quán)利要求
1.一種重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶的方法，以E. coli BL21DE3(pET-20b(+)PGL)為出發(fā)菌株，其特征在于，步驟如下1)發(fā)酵培養(yǎng)基中初始甘油濃度為6-14gL—1，待甘油耗盡DO上升后，按照比生長速率為 0. 15-0. 231Γ1指數(shù)流加甘油培養(yǎng)基；2)直至菌體干重達(dá)到12-18gΙΛ降低溫度同時(shí)加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，以6_18mL IT1的速率進(jìn)行甘油培養(yǎng)基流加直至發(fā)酵結(jié)束。
2.權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟1)每小時(shí)調(diào)整一次甘油流加速率，流加速率按照如下方式計(jì)算F(t)流加速率, :細(xì)胞密度，Vtl 初始體積，Sf 補(bǔ)料液中甘油濃度，Psrt 比生長速率為02，YX/S 對底物細(xì)胞得率。
3.權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟1)中指數(shù)流加控制DO為30%。
4.權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟1)中溫度為37°C。
5.權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟2)中溫度降為^rc。
6.權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟2)中加入0.05mM IPTG0
7.權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，發(fā)酵過程中用25%的氨水控制pH為7.0。
8.權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述甘油培養(yǎng)基甘油500gL—1，酵母粉50g Γ1, 蛋白胨50g L—1。
全文摘要
一種重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶的方法，屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。以Escherichia coliBL21DE3)為出發(fā)菌株，按照一定比生長速率流加甘油培養(yǎng)基，本發(fā)明簡單易行，大幅提高了堿性果膠酶的產(chǎn)量與生產(chǎn)強(qiáng)度以及分泌表達(dá)效率，有利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，同時(shí)對于指導(dǎo)其他大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)外源蛋白量具有重要意義。
文檔編號C12R1/19GK102367437SQ20111032684
公開日2012年3月7日 申請日期2011年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月25日
發(fā)明者劉龍, 堵國成, 張東旭, 房淑穎, 李江華, 陳堅(jiān) 申請人:江南大學(xué)