一種高效發(fā)酵生產(chǎn)l-丙氨酸的大腸桿菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種高效發(fā)酵生產(chǎn)k丙氨酸的大腸桿菌，屬于微生物代謝工程技術(shù) 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] k丙氨酸是最小的手性分子之一，被用于醫(yī)藥和獸藥行業(yè)，與其他k型氨基 酸共同用作手術(shù)前和手術(shù)后的營(yíng)養(yǎng)劑。由于心丙氨酸具有甜味，也被用于食品添加 劑。此外，丙氨酸也可用于合成改性耐熱塑料，例如（PA)S、poly(ester-amide)s(PEA)s、 poly(ester-amide-sulfide)s(PEA巧sW及poly(ester-imide)s(PEI)s等。然而k丙氨 酸生產(chǎn)成本高，使其應(yīng)用受到限制。
[0003] 近年來(lái)，利用基因工程手段，將外源丙氨酸脫氨酶基因引入E.coli菌 株，在E.coli中實(shí)現(xiàn) 了k丙氨酸的合成（LeeM.etal.,ApplMicrobiol Biotechnol, 2004, 65:56-60；SmithG.M.etal. ,BiotechnolLett,2006, 28:1695-1700 ； ZhangX.etal.,ApplMicrobiolBiotechnol, 2007, 77:355-366) 〇Smi1:h等（SmithG.M.et al.,BiotechnolLett, 2006, 28:1695-1700)將來(lái)源于Bacillussphaeri州s的alaD基 因克隆于質(zhì)粒載體上，并在E.coliALS929(pflppspoxB1化AaceE巧菌株中表達(dá)，可利 用復(fù)雜培養(yǎng)基合成88g/L丙氨酸，丙氨酸合成階段體積生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到4g/L?h?；痑ng等 狂hangX.etal.,ApplMicrobiolBiotechnol, 2007, 77:355-366)將來(lái)源于Geobacillus stearothermo地ilus的alaD基因整合于重組E.coliSZ194染色體上，經(jīng)馴化后，最終菌株 XZ132(pflBfrda化EackAmgsAdadX1化A::alaD)經(jīng)4她發(fā)酵，可利用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基W 及120g/L葡萄糖合成1279mmol丙氨酸，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中丙氨酸生產(chǎn)強(qiáng)度為2. 37g/L?!!，丙 氨酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到95g/100g葡萄糖，k丙氨酸光學(xué)純度達(dá)到99. 5%，是目前利用重組E.coli 菌株進(jìn)行k丙氨酸合成的最高產(chǎn)量。
[0004] 本發(fā)明W野生型E.coliB100為出發(fā)菌株，構(gòu)建出高效合成k丙氨酸的新型 E.coli重組菌株。通過(guò)控制溫度，在菌體生長(zhǎng)階段關(guān)閉重組菌株k丙氨酸的合成，避免產(chǎn) 物對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制和競(jìng)爭(zhēng)作用；在k丙氨酸合成階段，高效開啟k丙氨酸合成途徑，W 葡萄糖為唯一碳源進(jìn)行k丙氨酸的高水平合成，不需要添加一些昂貴的化合物進(jìn)行誘導(dǎo)， 不需用惰性氣體控制嚴(yán)格的厭氧環(huán)境，具有更好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種能W廉價(jià)原料和粗放發(fā)酵條件，高效 生產(chǎn)高光學(xué)純度和高化學(xué)純度k丙氨酸的大腸桿菌62ALA。
[0006]所述菌株分類命名為大腸埃希氏菌巧scherichiacoli)，已于2015年3月16日， 保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西 路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 10628。
[0007] 所述菌株的染色體上副產(chǎn)物己酸、甲酸、己醇、班巧酸、乳酸的合成途徑編碼基因 ackA-pta、pflB、a化E、frdA、1 化A被敲除。
[000引所述菌株的染色體上dadX基因處整合了來(lái)源于嗜熱菌Geobacillus stearothermo地ilus的丙氨酸脫氨酶基因alaD。
[0009] 本發(fā)明還提供一種應(yīng)用所述重組菌發(fā)酵生產(chǎn)k丙氨酸的方法，分兩階段控制發(fā) 酵溫度，在第一階段，控制較低培養(yǎng)溫度，使菌體快速生長(zhǎng)而不合成k丙氨酸，然后在第二 階段，提高培養(yǎng)溫度，進(jìn)行k丙氨酸的合成。
[0010] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，第一階段在28~35°C好氧條件下培養(yǎng)菌體，使菌體 快速生長(zhǎng)；至菌體生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)中后期，進(jìn)入第二階段，于40~45°C好氧培養(yǎng)菌體片刻，然后 進(jìn)入限氧發(fā)酵產(chǎn)k丙氨酸的階段。
[0011] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將活化后的大腸桿菌接種于裝液量60%的發(fā)酵罐 中，進(jìn)行兩階段發(fā)酵，（1)好氧階段培養(yǎng)：初始空氣通量為化/min,攬拌獎(jiǎng)轉(zhuǎn)速為2(K)r/min， 此時(shí)的溶解氧濃度設(shè)定為100%，菌體生長(zhǎng)過(guò)程中調(diào)節(jié)空氣通量直至化/min,同時(shí)將攬拌 轉(zhuǎn)速與DO值關(guān)聯(lián)來(lái)控制溶解氧濃度始終大于30%;使用NH4OH和10% (v/v)H2S〇4維持抑 值為7. 0,發(fā)酵溫度控制為28~35°C ;當(dāng)至菌體生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)中后期，升高溫度至40~45°C 繼續(xù)好氧培養(yǎng)45min，再進(jìn)入限氧發(fā)酵產(chǎn)酸階段；（2)限氧階段培養(yǎng)：空氣通量調(diào)為零，攬拌 獎(jiǎng)轉(zhuǎn)速控制為10化/min,添加NH4OH來(lái)維持抑值為7. 0,發(fā)酵溫度為40~45°C，并補(bǔ)加S 次濃度為600g/L的葡萄糖，每次補(bǔ)加200mL，W維持發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液殘?zhí)菨舛雀哂趌Og/ 以當(dāng)所有補(bǔ)加的葡萄糖消耗盡后即結(jié)束發(fā)酵。
[0012] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，發(fā)酵培養(yǎng)基成分為（/L) ;30g葡萄糖，15.llg 化2冊(cè)〇4?12H2〇,3gKH2PO4,Ig畑典1，0. 5g化C1，13.2g(NH4)2S〇4,并補(bǔ)加 10/4 (v/v)Imol/ LM拆O4和1%。（v/v)的微量元素母液。微量元素成分為（/L) ;2.4gFeCl3'6H2〇,0. 3g CoCl2.6H2〇,0. 15gCuCl2.2H2〇,0. 3gZnCl2,0. 3gNa2M〇4.2H2〇,0. 075g&8〇3,0. 495g MnCla ? 4H2O0
[0013] 本發(fā)明的有益之處體現(xiàn)在：
[0014] 1、本發(fā)明提供的重組菌，在基因組中刪除了合成副產(chǎn)物的基因，并整合了表達(dá)了 啟動(dòng)子及丙氨酸脫氨酶編碼基因alaD，具有明顯的高產(chǎn)心丙氨酸的能力，菌種在28~ 45°C的條件下發(fā)酵26h，產(chǎn)k丙氨酸水平達(dá)到106g/L或W上，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到 4. 27g/L?hW上。
[0015] 2、本發(fā)明的心丙氨酸高產(chǎn)菌在心丙氨酸發(fā)酵中，基本沒(méi)有有機(jī)酸等副產(chǎn)物W及 D-丙氨酸的合成，保障了k丙氨酸產(chǎn)品具有高化學(xué)純度及高光學(xué)純度。
[0016] 3、本發(fā)明的心丙氨酸高產(chǎn)菌利用葡萄糖為唯一碳源高效生產(chǎn)k丙氨酸，發(fā)酵過(guò) 程中不需添加特殊的底物或誘導(dǎo)劑，不需用惰性氣體嚴(yán)格控制厭氧條件，具有生產(chǎn)成本低 的優(yōu)點(diǎn)。
[0017] 生物材料保藏
[001引一種大腸埃希氏菌巧scherichiacoli)，已于2015年3月16日保藏于中國(guó)微生 物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中 國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 10628。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1;大腸桿菌CGMCCNo. 10628丙氨酸發(fā)酵過(guò)程；:丙氨酸；?：細(xì)胞干重 值CW)。虛線箭頭指示時(shí)間是培養(yǎng)溫度由28~35°C轉(zhuǎn)為40~45°C。虛線將發(fā)酵過(guò)程劃分 為好氧培養(yǎng)階段（左）和限氧培養(yǎng)階段（右）。箭頭表示分別向發(fā)酵罐中添加120g(A)、 120g做和120g似葡萄糖的時(shí)間。
【具體實(shí)施方式】
[0020] W下實(shí)施例設(shè)及的有關(guān)方法：
[0021] ①菌體量測(cè)定方法；菌體密度采用濁度法間接測(cè)量，通過(guò)0化。。來(lái)表示，并通過(guò)下 列公式換算為菌體干重。菌體干重值CW)和ODe。。的關(guān)系；100日。。=0. 38g/LDCW。
[002引②葡萄糖測(cè)定方法；葡萄糖用SBA-40E葡萄糖生物傳感儀（山東省科學(xué)院生物研 究所）進(jìn)行分析。
[002引⑨有機(jī)酸測(cè)定方法；有機(jī)酸含量用高壓液相色譜進(jìn)行分析，檢測(cè)器為UV(210nm) 檢測(cè)器，色譜柱為PrevailOrganicAcid5u(GraceDavisonDiscoverySciences),流動(dòng) 相為25mmol/LKH2P04(pH2. 5)，流速為1血/min,柱溫為室溫。
[0024] ④氨基酸測(cè)定方法；樣品適當(dāng)稀釋后再用苯基異硫酸醋（PITC)進(jìn)行衍生。衍生 步驟為；500yL樣品中加入250UL0.Imol/LPITC己膳溶液和250ULImol/LS己胺己 膳溶液，充分混勻，避光室溫放置比，加入500yL正己燒溶液，禍旋振蕩器振蕩Imin，靜置 60min，吸取下層溶液，用0. 45ym有機(jī)濾膜過(guò)濾后進(jìn)行高壓液相檢測(cè)。色譜柱為AccQ'Tag 3. 9X150mm(Waters)。流動(dòng)相A液為 80 % (v/v)己膳水溶液，B液為 97:3 (v/v)的 0.Imol/ L己酸鋼-己膳溶液。采用梯度洗脫；0-20m