專(zhuān)利名稱(chēng)：一種具有寬pH范圍的β-甘露聚糖酶BA-Man5A及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種具有寬PH范圍的β -甘露聚糖酶BA-Man5A及其基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甘露聚糖是植物半纖維素的主要成份，是以1，4_β -D-吡喃甘露糖苷鍵連接而成的線性多糖。β -甘露聚糖酶(β -l，4-D-mannan mannohydrolase,EC3. 2. 1. 78)是一種能降解甘露聚糖主鏈的水解酶，屬于半纖維素酶類(lèi)。β-甘露聚糖酶來(lái)源廣泛，許多微生物，植物和一些低等動(dòng)物中都存在β-甘露聚糖酶(Mi llward-Sadler, et al FEMS Microbiol. Lett. 1996. 141 :183-188)。微生物是β _甘露聚糖酶的重要來(lái)源，具有活力高、成本低、來(lái)源穩(wěn)定、提取方便等明顯優(yōu)點(diǎn)。但天然菌株所產(chǎn)的甘露聚糖酶產(chǎn)量低，不能滿(mǎn)足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。采用微生物反應(yīng)器生產(chǎn)β-甘露聚糖酶是目前獲得該酶的最為理想的途徑。β-甘露聚糖酶已被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、保健和醫(yī)藥、造紙、紡織印染、石油開(kāi)采、精細(xì)化工及生物技術(shù)等諸多領(lǐng)域，是一種新型的工業(yè)酶，具有很大的潛在應(yīng)用價(jià)值。不同來(lái)源的甘露聚糖酶因性質(zhì)上的差別，其應(yīng)用范圍和價(jià)值也不盡相同。國(guó)內(nèi)外研究和報(bào)道較多的細(xì)菌產(chǎn)甘露聚糖酶多為中性或堿性酶，包括芽孢桿菌、假單胞菌、弧菌、 放線菌等。而真菌來(lái)源的β-甘露聚糖酶多為酸性，它們作用的最適PH值在2. 4 5.0。 其中有些甘露聚糖酶能夠PH 8.0，但高于？!1 8.0后不再有活性(Dhawan and Kaur, Crit. Rev.Biotechnol. 2007. 27 :197-216)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，部分甘露聚糖酶的編碼基因已被克隆并進(jìn)行了異源表達(dá)(Dhawan and Kaur, Crit. Rev.Biotechnol. 2007. 27 :197-216 ；Moreira and Filho, Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008. 79 :165-178.)根據(jù)催化域氨基酸序列及結(jié)構(gòu)的相似性，β-甘露聚糖酶多被劃分為糖苷水解酶家族5，11或113(HenriSSat and Bairoch, Biochem. J. 1993. 293 :781-788)。本發(fā)明得到了一個(gè)新的甘露聚糖酶基因，其編碼的甘露聚糖酶在酸性、中性及堿性條件下均具有高活性，并具有強(qiáng)酸堿穩(wěn)定性，同時(shí)，該甘露聚糖酶具有較好的耐熱性和極好的抗蛋白酶能力，可應(yīng)用于動(dòng)物及魚(yú)類(lèi)的飼料，應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等工業(yè)，同時(shí)還可以應(yīng)用于造紙及紡織印染行業(yè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有寬pH范圍的β -甘露聚糖酶BA-Man5A。本發(fā)明的另一目的是提供編碼上述寬pH范圍的β-甘露聚糖酶的基因ki-man5A。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述寬pH范圍的β-甘露聚糖酶基因的重組載體。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述寬pH范圍的β-甘露聚糖酶基因的重組菌株。本發(fā)明的另一目的是提供制備上述寬pH范圍的β-甘露聚糖酶的方法。
本發(fā)明的另-一目的是提供上述寬PH范圍的β-甘露聚糖酶的應(yīng)用O
本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種性質(zhì)優(yōu)良的、適合于在飼料、食品、釀酒、造紙以及能源工業(yè)中應(yīng)用新的β-甘露聚糖酶。從Bisporaantennata CBS 126. 38 中獲得了 λτη 1 —一種β-甘露聚糖酶BA-Man5A，其氨基畫(huà)？序列如SEQID
MKLSTLLSISSAVAIASAQQPAYAQCGGVNWSGGSICVSGFYCFKQNEFY
SQCIPGTATT60
TAATTTATSGSPATSTIAPPVASITSFAKAAGNVFNINGKSQYFMGTNSY
WIGFFTSNDD120
VDLVFSHLASTGLKVLRVffGFNDVTTIPSAGNVffFQSFVKGSTPTINTGA
DGLQRLDYVV180
ESAGKHGVSLIINFVNNWSDYGGMAAYRSYYNLSTTDQSQ
WYTSAAVQAQYQKYIATVVA240
RYKDNPTVFSWELANEPRCNGCATSVVTNWIKTTSAYIKSLDSKHMVCIG
DEGFGIDGGT300
DTSYPFGPGEGIDffVANLKISTIDFGTAHLYPESffGETDAWGTSffINIHA
AAAKTIGKPV360
ILEEYGTATKANILVffQKAVMDSGTAADMYWQYGDTFSffG
QTHNDGHSIYYGTAEYKTYV420
EDHAAAMAAKAV432
該酶氨基酸序列全長(zhǎng)包括432個(gè)氨基E駿和一個(gè)終止密碼子，N端18個(gè)氨基酸為其預(yù)測(cè)的信號(hào)肽序列“MKLSTLLSIS SAVAIASA”。
因此，成熟的β-甘露聚II酶BA-Man5A的理論分子量為46. 6kDa，其氨基酸序列如SEQ IDNO. 2
QQPAYAQCGGVNWSGGSICVSGFYCFKQNEFYSQCIPGTA TTTAATTTAT
SGSPATSTIA60
PPVASITSFAKAAGNVFNINGKSQYFMGTNSYffIGFFTSNDDVDLVFSHL
ASTGLKVLRV120
WGFNDVTTIPSAGNVffFQSFVKGSTPTINTGADGLQRLDY VVESAGKHGV
SLIINFVNNW180
SDYGGMAAYRSYYNLSTTDQSQffYTSAAVQAQYQKYIATV
VARYKDNPTVFSffELANEPR240
CNGCATSVVTNWIKTTSAYIKSLDSKHMVCIGDEGFGIDGGTDTSYPFGP
GEGIDffVANL300
KISTIDFGTAHLYPESffGETDAffGTSffINIHAAAAKTIGKPVILEEYGTA
TKANILVffQK360
AVMDSGTAADMYWQYGDTFSWGQTHNDGHSIYYGTAEYKT
YVEDHAAAMAAKAV414
本發(fā)明還提供了編碼上述β-甘露聚I唐酶的基因ba-man5A。DNA全序列分析結(jié)果表明，β -甘露聚糖酶BA-Man5A結(jié)構(gòu)基因全長(zhǎng)1760bp。
該酶的全基因序列如SEQ ID NO. 3所示
atgaagctctctactttgctgtctatttctagcgccgtcgctattgcgagtgcacagcaa60
cccgcctacgcacaatgtgagctttctgctgggtcgagataaagtttatgctgatgaaat120
taaggtggaggagttaattggagcggagggagtatctgtgtttcgggcttctattgcttc180
aaacaaaacgagttttattctcagtgtatcccaggaactggtatgtttctccagttaaat240
ttctattccggctatcgaataacgtggatttctagcaactacaactgcagccaccacaac300
cgctacaagtggatccccagcaacatccaccattgcacctccggtagccagcatcacaag360
cttcgccaaagctgctgggaatgtcttcaatatcaatgggaaatcgcagtatttcatggg420
aacgaattcctactggattggtttctttacaagcaacgatgatgttgatctcgttttcag480
ccatcttgcctcagtatgttcttatttacgccataaaacaaacacaaagctgatgtaata540
tcctagacaggtcttaaggtccttcgtgtctggggcttcaacgatgtaacaaccattccc600
agcgcagggaatgtttggttccaatctttcgtcaagggttccacgccaac660
ggcgcagatggtctgcaacgcctcgactatgtcgttgaatcagccggaaaacatggcgtc720
tcgctcattataaactttgtcaacaattgggtaagcaacatttttctttgttccgaaacc780
aggaatcatcgcagcaaacatctgccatctgccatccgcaaatgaccccgaggcacaaac840
acgcccacactcggcgagatggagagcagttcgtcaaagagctagatacttcccccaaaa900
cacctagctttcctctgagtggctcggaggacattttgttttcttgcctcctttcggctc960
ccctttcgttgaaaaaactccgtactaatttgtttacagtctgactatggcggcatggcg1020
gcttacagatcttactacaatctgtccaccactgatcagtctcaatggtatacatccgct1080
gctgttcaagcccagtatcagaaatacattgccactgttgtggcgagatacaaggacaat1140
ccaacggtcttctcctgggaactcgccaatgaacccagatgtaatggatgcgcaacctca1200
gttgtcacaaactggatcaagactacatccgcttatatcaaatctctcgactcaaaacac1260
atggtctgcattggtgacgaaggattcgggatcgatggtggtactgacacgagctaccct1320
ttcgggccaggagaaggcatagattgggtcgcgaatctcaaaatctcaacaattgatttt1380
ggtacagcacacttgtaccccgaatcttggggagagacagatgcctggggtactagttgg1440
ataaatatccatgctgctgctgccaaaactattgggaaaccagtgattttggaagagtat1500
gggactgcga ccaaagcaaatattttggtttggcagaaagctgtcatggatagcggaacg1560
gccgcggacatgtattggcagtacggtgatactttctcttggggccaaactcataacgat1620
gggcactcgatttactatggcactgccgagtacaaaacttatgtaagttttccacttgtc1680
tttggttgcaagcagctagctaatagttttatttataggttgaggatcatgcagctgcaa1740
tggccgcaaaagcagtttga1760
本發(fā)明提供了編碼上述β-甘露聚糖酶的基因ba-man5A的cDNA序列，j1299bP，如 SEQ ID NO. 4 所示:
atgaagctctctactttgctgtctatttctagcgccgtcgctattgcgagtgcacagcaa60
cccgcctacgcacaatgtggaggagttaattggagcggagggagtatctgtgtttcgggc120
ttctattgct C33HC333Hcgagttttattctcagtgtatcccaggaactgcaactaca180
actgcagccaccacaaccgctacaagtggatccccagcaacatccaccattgcacctccg240
gtagccagcatcacaagcttcgccaaagctgctgggaatgtcttcaatatcaatgggaaa300
tcgcagtatttcatgggaacgaattcctactggattggtttctttacaagcaacgatgat360
gttgatctcgttttcagccatcttgcctcaacaggtcttaaggtccttcgtgtctggggc420
ttcaacgatgtaacaaccattcccagcgcagggaatgtttggttccaatctttcgtcaag480
ggttccacgccaactataaacacaggcgcagatggtctgcaacgcctcgactatgtcgtt540
gaatcagccggaaaacatggcgtctcgctcattataaactttgtcaacaattggtctgac600
tatggcggcatggcggcttacagatcttactacaatctgtccaccactgatcagtctcaa660
tggtatacatccgctgctgttcaagcccagtatcagaaatacattgccactgttgtggcg720
agatacaaggacaatccaacggtcttctcctgggaactcgccaatgaacccagatgtaat780
ggatgcgcaacctcagttgtcacaaactggatcaagactacatccgcttatatcaaatct840
ctcgactcaaaacacatggtctgcattggtgacgaaggattcgggatcgatggtggtact900
gacacgagctaccctttcgggccaggagaaggcatagattgggtcgcgaatctcaaaatc960
tcaacaattgattttggtacagcacacttgtaccccgaatcttggggagagacagatgcc1020
tggggtactagttggataaatatccatgctgctgctgccaaaactattgggaaaccagtg1080
attttggaagagtatgggactgcgaccaaagcaaatattttggtttggcagaaagctgtc1140
atggatagcggaacggccgcggacatgtattggcagtacggtgatactttCtCttggggC1200
caaactcataacgatgggcactcgatttactatggcactgccgagtacaaaacttatgtt1260
gaggatcatgcagctgcaatggccgcaaaagcagtttga1299其中，信號(hào)肽的堿基序列為ATGAAGCTCTCTACTTTGCT GTCTATTTCTAGCGCCGTCGCTA TTGCGAGTGCA。DNA序列與cDNA序列比對(duì)分析結(jié)果表明β -甘露聚糖酶的結(jié)構(gòu)基因，含有5 個(gè)內(nèi)含子，其序列分別為80 126bp，221 275bp，494 546bp，751 999bp和1，662 1，718bp。該酶屬于糖基水解酶第5家族。將β -甘露聚糖酶基因ba-man5AcDNA序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該基因與來(lái)源于Botryotinia fuckeliana—假定蛋白有最高的序列一致性為60%，而與來(lái)源于Aspergillus aculeatus 的甘露聚糖酶序列一致性最高為57%，說(shuō)明BA-Man5A是一種新的甘露聚糖酶。本發(fā)明還提供了包含上述β -甘露聚糖酶基因的重組載體，優(yōu)選為 pPIC9-ba-man5A。將本發(fā)明的β _甘露聚糖酶基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間，使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選為將β -甘露聚糖酶基因插入到質(zhì)粒PPIC9上的SnaBI和NotI限制性酶切位點(diǎn)之間，使該核苷酸序列位于AOXl啟動(dòng)子的下游并受其調(diào)控，得到重組酵母表達(dá)質(zhì)粒 pPIC9-ba_man5A。本發(fā)明還提供了包含上述甘露聚糖酶基因的重組菌株，優(yōu)選為重組畢赤酵母菌 GS115/ba_man5A0本發(fā)明還提供了一種制備寬pH范圍的β -甘露聚糖酶BA-Man5A的方法，包括以下步驟1)用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組β -甘露聚糖酶BA-Man5A的表達(dá)；以及3)回收并純化所表達(dá)的β-甘露聚糖酶BA-Man5A。其中，優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母細(xì)胞，優(yōu)選將重組酵母表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞(Pichic pastoris)GS115，得到重組菌株 GS115/ba-man5A。本發(fā)明還提供了上述β-甘露聚糖酶的應(yīng)用，優(yōu)選該酶在水解β-甘露聚糖及在動(dòng)物及魚(yú)類(lèi)的飼料、食品、醫(yī)藥、造紙等工業(yè)中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一個(gè)新的甘露聚糖酶基因，其編碼的甘露聚糖酶在酸性、中性及堿性范圍內(nèi)均具有高活性，作用PH范圍廣，且具有強(qiáng)的耐酸堿性及很好的耐熱性和優(yōu)良的抗蛋白酶能力，可作應(yīng)用于動(dòng)物及魚(yú)類(lèi)的飼料、食品、醫(yī)藥、造紙等工業(yè)。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案就可以實(shí)現(xiàn)利用基因工程手段生產(chǎn)甘露聚糖酶。


圖1β-甘露聚糖酶基因ba-man5A在畢赤酵母中表達(dá)的β-甘露聚糖酶的 SDS-PAGE分析，1、分子量標(biāo)準(zhǔn)；2、發(fā)酵培養(yǎng)上清；3、純化的重組β -甘露聚糖酶；4、脫糖基后的β-甘露聚糖酶。圖2本發(fā)明重組β-甘露聚糖酶的最適ρΗ值。圖3本發(fā)明β-甘露聚糖酶的ρΗ穩(wěn)定性。圖4本發(fā)明β-甘露聚糖酶最適反應(yīng)溫度。圖5本發(fā)明β -甘露聚糖酶熱穩(wěn)定性。圖6本發(fā)明β -甘露聚糖酶化學(xué)試劑抗性。圖7本發(fā)明β -甘露聚糖酶蛋白酶抗性。
具體實(shí)施例方式試驗(yàn)材料和試劑1、菌株及載體Bispora antennataCBS 126. 38購(gòu)自皇家荷蘭生物科技研究所培養(yǎng)物保藏中心(Centraalbureau voor Schimmelcultures, Netherlands),畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9及菌株GSl 15購(gòu)自于hvitrogen公司。2、酶類(lèi)及其它生化試劑內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司，連接酶購(gòu)自hvitrogen公司。 角豆膠，瓜爾豆膠購(gòu)自Sigma公司，其它都為國(guó)產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購(gòu)買(mǎi)得到)。3、培養(yǎng)基(I)Bispora antennata CBS 126. 38培養(yǎng)基為麥芽提取物培養(yǎng)基在IL水中加入 30g麥芽提取物(BD)，自然pH值，培養(yǎng)溫度28V。(2)大腸桿菌培養(yǎng)基LB (1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、NaCl，pH 7.0)。(3) BMGY 培養(yǎng)基1 % 酵母提取物，2 % 蛋白胨，1. 34 % YNB，0. 00004 % Biotin, 1 % 甘油(V/V)。(4)BMMY培養(yǎng)基除以0. 5%甲醇代替甘油，其余成份均與BMGY相同，pH 4. 0。說(shuō)明以下實(shí)施例中未作具體說(shuō)明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)J-薩姆布魯克一書(shū)中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。實(shí)施例1 真菌 Bispora antennata CBS 126. 38 產(chǎn)酶特性將Bispora antennataCBS 126. 38經(jīng)麥芽提取物培養(yǎng)基培養(yǎng)后，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(0. 2% MgSO4 · 7Η20，0· 1% KH2PO4,0. 1% CuSO4 · 5Η20，0· 1% CaCl2,0. 5%蛋白胨，1 %
玉米芯粉，麩皮，0.5%魔芋粉，pH 5.0)，30°C培養(yǎng)3 4d，測(cè)定其產(chǎn)纖維素和半纖維素酶的活性。經(jīng)測(cè)定該菌為高產(chǎn)甘露聚糖酶菌株。實(shí)施例2 真菌Bispora antennata CBS 126. 38 β -甘露聚糖酶編碼基因 ba-man5A的克隆將液體培養(yǎng)3天的菌絲體用無(wú)菌濾紙過(guò)濾放入研缽中，加入2mL提取液，研磨 5min，然后將研磨液置于50mL離心管中，65°C水浴鍋裂解20min，每隔IOmin混勻一次，在 4°C下IOOOOrpm離心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇，于室溫靜置5min后，4°C下IOOOOrpm離心lOmin。棄上清，沉淀用70%的乙醇洗滌兩次，真空干燥，加入適量TE溶解，置于-20°C備用。根據(jù)已發(fā)表的甘露聚糖酶基因保守序列設(shè)計(jì)合成了兼并引物Pl，P2。以Bispora antennataCBS 126. 38總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為95°C變性5min后冷卻至4°C ；然后94 °C變性30sec，53 V退火30sec，72 V延伸30sec，32個(gè)循環(huán)后72 V保溫 IOmin0得到一約ISObp片段，將該片段回收后送三博生物技術(shù)有限公司測(cè)序。根據(jù)測(cè)序得到的核甘酸序列設(shè)計(jì)TAIL-PCR引物Ul, U2，U3 ；Dl, D2，D3 (見(jiàn)表1)。 通過(guò)TAIL-PCR得到已知基因序列的側(cè)翼序列，擴(kuò)增得到產(chǎn)物回收后送三博生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)序正確的片斷經(jīng)拼接后獲得全長(zhǎng)基因。表1.甘露聚糖酶基因克隆的簡(jiǎn)并引物及TAIL-PCR特異性引物
權(quán)利要求
1.一種具有寬PH范圍的β-甘露聚糖酶BA-Man5A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1或2所示。
2.一種具有寬pH范圍的β-甘露聚糖酶基因ba-man5A，其特征在于，編碼權(quán)利要求1 所述的β-甘露聚糖酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述具有寬pH范圍的β-甘露聚糖酶基因ba-man5A，其特征在于， 其堿基序列如SEQ ID NO. 3或4所示。
4.包含權(quán)利要求2或3所述具有寬pH范圍的β-甘露聚糖酶基因ba-man5A的重組載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為pPIC9-ba-man5A。
6.包含權(quán)利要求2或3所述寬pH范圍的β-甘露聚糖酶基因ba-man5A的重組菌株。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組菌株，其特征在于，所述重組菌株為畢赤酵母菌。
8.一種制備寬pH范圍的β-甘露聚糖酶BA-Man5A的方法，其特征在于，包括以下步驟1)用權(quán)利要求4的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組β-甘露聚糖酶BA-Man5A的表達(dá)；以及3)回收并純化所表達(dá)的β-甘露聚糖酶BA-Man5A。
9.權(quán)利要求1所述寬pH范圍的β-甘露聚糖酶BA-Man5A的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種寬pH范圍的β-甘露聚糖酶BA-Man5A及其基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種寬pH范圍的β-甘露聚糖酶BA-Man5A，其具有如SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列，且本發(fā)明還提供了編碼上述寬pH范圍的β-甘露聚糖酶BA-Man5A的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3、或4所示，以及包含該基因的重組載體和重組菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明的β-甘露聚糖酶BA-Man5A在酸性、中性及堿性范圍內(nèi)均具有高活性，作用pH范圍廣，且具有強(qiáng)的耐酸堿性及很好的耐熱性和優(yōu)良的抗蛋白酶能力，可作應(yīng)用于動(dòng)物及魚(yú)類(lèi)的飼料、食品、醫(yī)藥、造紙等工業(yè)。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案就可以實(shí)現(xiàn)利用基因工程手段生產(chǎn)甘露聚糖酶。
文檔編號(hào)C12N9/42GK102363774SQ20111033027
公開(kāi)日2012年2月29日 申請(qǐng)日期2011年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月26日
發(fā)明者劉文龍, 孫碩, 李芳芳, 王興吉, 王忠連, 郭慶文, 錢(qián)娟娟 申請(qǐng)人:山東隆科特酶制劑有限公司