一種念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒及其制備方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒，包括Mn包被的酶標(biāo)板和抗Mn多克隆酶標(biāo)抗體。本發(fā)明的試劑盒通過將Mn包被在酶標(biāo)板上，將待檢樣本或標(biāo)準(zhǔn)抗原與包被抗原競爭結(jié)合有限的抗體結(jié)合位點，再經(jīng)辣根過氧化物酶與底物發(fā)生顯色反應(yīng)，根據(jù)Mn標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待檢抗原的濃度值，本發(fā)明檢測試劑盒具有較好的敏感性和特異性，結(jié)果與參比試劑符合率高，能提供更準(zhǔn)確可靠的檢驗結(jié)果，所述試劑盒操作簡便易行，檢測快速靈敏，所用酶標(biāo)儀簡單、普及，價格低廉，本發(fā)明檢測試劑盒為Mn定量檢測提供了一種有效工具。
【專利說明】
一種念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒及其制備方法與 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種念珠菌甘露聚糖(Candida mannan，Mn) 抗原免疫檢測試劑盒及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 侵襲性真菌?。╥nvasive fungal disease，IFD)或侵襲性真菌感染（invasive fungal infection，IFI)是指致病性真菌侵犯皮下組織、黏膜、肌肉和內(nèi)臟器官等所引起的 真菌感染性疾病。念珠菌屬是機會真菌或條件致病真菌中最常見的真菌，它主要侵犯粘膜， 進一步可向血液中播散，引起播散性感染；它在真菌感染所致的侵襲性真菌?。╥nvasive fungal sisease，IFD)中占首位。念珠菌屬很容易在呼吸系統(tǒng)內(nèi)繁殖，引發(fā)真菌性肺炎。而 真菌性肺炎的臨床表現(xiàn)和細菌性肺炎的臨床表現(xiàn)基本相同，易誤診為細菌性肺炎，使得真 菌感染進一步加重，甚至播散到全身。
[0003] 據(jù)統(tǒng)計侵襲性念珠菌病的歸因病死率可高達47%，歸因病死率在成人患者中為 15 %-25 %，在新生兒和兒童中為10%-15%。侵襲性念珠菌病可使ICU入住時間和住院時間 分別增加12.7d和15.5d。造成這種高死亡率的主要原因在于不能在病程早期對念珠菌病進 行檢測診斷，以至患者得不到及時有效的治療而死亡，因此選擇早期檢測診斷方法具有重 要的意義。
[0004]甘露聚糖(Mannan)是念珠菌細胞壁的主要抗原成分。對于念珠菌感染的診斷，除 了傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法外，測定血清中Μη，已經(jīng)逐漸成為侵襲性念珠菌病早期診斷的簡單、快捷 的方法，目前開展的檢測方法主要有以下5大類：
[0005] (1)組織病理學(xué)檢查，該法為有創(chuàng)性檢查，不易取材；
[0006] (2)血培養(yǎng)方法，該法敏感性差，耗時長，易污染，有些真菌樣本采集難，陽性檢出 率不尚；
[0007] (3)直接鏡檢方法，該法可靠性低，局限性大，僅適合檢測淺部真菌病；
[0008] (4)影像學(xué)檢查，該法特異性差，在影像學(xué)上與血管侵襲性感染相似，不易區(qū)分。
[0009] (5)免疫學(xué)檢測法:特異性針對Μη的抗體實現(xiàn)對念珠菌的檢測，檢測血液敏感性達 到80%以上。免疫學(xué)檢測方法靈敏度和特異性都較前四種方法有明顯的優(yōu)勢，正逐漸成為 念珠菌檢測的常用方法。在國內(nèi)外IFI的診斷標(biāo)準(zhǔn)中，均認為血清念珠菌抗原陽性可作為微 生物學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，因此測定血清中的Μη水平有助于念珠菌病的早期診斷、早期治療。
[0010] 免疫檢測技術(shù)是利用抗原抗體間能特異性結(jié)合反應(yīng)，通過檢測標(biāo)記在反應(yīng)物上的 標(biāo)記物，對抗原或抗體實現(xiàn)定性或定量檢測的方法。根據(jù)標(biāo)記物的不同，分為酶聯(lián)免疫分析 技術(shù)(Enzyme-Linked Immunosorbant Assay,ELISA)、免疫焚光檢測技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫分 析技術(shù)、免疫微球技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)等。其中ELISA技術(shù)具有操作簡單，靈敏度高，檢測 時間短的特點，在臨床檢測和科學(xué)研究中被廣泛使用。
[0011] 在念珠菌的臨床檢測中，目前國際市場上免疫檢測產(chǎn)品為數(shù)不多，現(xiàn)有的有美國 Bio-Rad公司的ELISA法檢測試劑盒產(chǎn)品，該產(chǎn)品采用雙抗夾心法，其方法是先將念珠菌的 特異單克隆抗體包被在酶標(biāo)板上，再加入待檢樣本和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的同一單 克隆抗體，37 °C反應(yīng)1.5個小時，待檢樣本中的抗原會與特異單克隆抗體結(jié)合并形成夾心結(jié) 構(gòu)，再加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色，顏色的深淺和待檢抗原的濃度呈正相關(guān)，從而實現(xiàn)Μη 的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 在本發(fā)明的全文中，下述簡寫分別代表的術(shù)語是：
[0013] Μη-念珠菌甘露聚糖；
[0014] EDTA-乙二胺四乙酸二鈉；
[0015] PBS-磷酸鹽緩沖溶液；
[0016] SDS-十二烷基磺酸鈉；
[0017] CBS-碳酸鹽緩沖溶液；
[0018] Tirs-三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液；
[0019] BSA-牛血清白蛋白；
[0020] TMB-四甲基聯(lián)苯胺；
[0021] HRP-辣根過氧化物酶；
[0022] 0D-在給定波長下的吸光度。
[0023] 對于EDTA、PBS、CBS、Tris、TMB的組成、濃度、pH等，均可采用免疫生物學(xué)上的常見 類型。
[0024] 本發(fā)明的目的是提供一種念珠菌甘露聚糖抗原提取方法。
[0025] 本發(fā)明的目的是提供一種念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒。
[0026] 本發(fā)明的另一個目的是提供上述曲念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備 方法。
[0027] 本發(fā)明的還一個目的是提供上述念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的應(yīng)用。 [0028]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0029] -種念珠菌甘露聚糖抗原提取方法：
[0030] 1)白色念珠菌培養(yǎng)采用通用的白色念珠菌培養(yǎng)條件，具體地說培養(yǎng)基采用YM肉湯 培養(yǎng)基，成分為每升培養(yǎng)基含3g酵母提取物，5g蛋白胨，3g麥芽糖提取物，10g D-葡萄糖。培 養(yǎng)溫度為30 °C，震蕩速度為200rpm，培養(yǎng)時間大約28h。
[0031] 2)上述培養(yǎng)液進行離心，沉淀即白色念珠菌細胞用0.9wt %氯化鈉洗滌兩次，56 °C 加熱2h殺死細胞，用丙酮干燥得到白色念珠菌菌粉。
[0032] 3)所得白色念珠菌菌粉在pH = 7.0,濃度為0.02M的檸檬酸鹽緩沖液中高壓滅菌 90min，離心，保留上清液，沉淀膠狀物相同條件下滅菌，離心，合并上清液。
[0033] 4)上述上清液加入到甲醇中，出現(xiàn)沉淀;離心分離得到沉淀，沉淀溶于去離子水， 用去離子水透析，凍干，得到粗制甘露聚糖。
[0034] 5)粗制甘露聚糖溶于去離子水中，加入十六烷基三甲基溴化銨的水溶液，混合液 靜止一段時間出現(xiàn)沉淀。
[0035] 6)離心分離沉淀，沉淀用去離子水洗滌，合并洗滌液和5)步上清液，合并液加入 lwt%的硼酸溶液。
[0036] 7)上述混合液邊攪拌邊加入2M氫氧化鈉，調(diào)節(jié)pH至8.8，生成十六烷基三甲基溴化 銨-甘露聚糖絡(luò)合物沉淀，收集沉淀，用pH= 8.8的0.5 %醋酸鈉洗滌，然后用2%乙酸溶解， 所得溶液在乙醇中沉淀。
[0037] 8)離心，棄上清液，沉淀用2 %的醋酸乙醇溶液洗滌，溶于水后用2M氫氧化鈉中和， 蒸餾水中透析，凍干，得到白色念珠菌甘露聚糖產(chǎn)物。
[0038]本發(fā)明中，白色念珠菌細胞經(jīng)過檸檬酸鹽處理后，上清液在甲醇中沉淀即可得到 甘露聚糖粗品，之后加入十六烷基三甲基溴化銨，其目的如下：1)中性條件下，出去蛋白質(zhì) 和核酸；2)堿性條件下，和甘露聚糖結(jié)合形成絡(luò)合物沉淀，純化多糖。因此，本發(fā)明中，使用 十六烷基三甲基溴化銨來制備甘露聚糖，省略了凝膠層析的過程，不但使得制備工藝簡單 化，同時能制備出高純度的甘露聚糖。
[0039] -種念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒，包括Μη包被的酶標(biāo)板和抗Μη多克隆酶 標(biāo)抗體。
[0040] 進一步的，上述念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒還包括Μη標(biāo)準(zhǔn)品、樣本處理 液、濃縮洗液、樣本稀釋液、底物溶液和終止液。
[0041 ]本發(fā)明的念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的工作原理如下：
[0042] 1)將Μη包被在固相載體上，制成固相抗原；
[0043] 2)將待檢樣本處理后與生物素標(biāo)記的抗Μη多克隆酶標(biāo)抗體加入1)的固相上，使待 檢抗原與包被抗原競爭結(jié)合有限的抗體結(jié)合位點；
[0044] 3)經(jīng)過恒溫反應(yīng)并徹底洗滌，加入HRP標(biāo)記鏈親和素；
[0045] 4)經(jīng)過恒溫反應(yīng)并徹底洗滌，再加入酶的反應(yīng)底物ΤΜΒ顯色，顏色的深淺和待檢樣 本中Μη濃度呈負相關(guān)；
[0046] 5)用酶標(biāo)儀在一定波長下測定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線實現(xiàn)對抗原濃度的檢測。
[0047] 本發(fā)明所述Μη和抗Μη多克隆酶標(biāo)抗體的相關(guān)技術(shù)信息如下：
[0048] 所述抗Μη多克隆抗體，可與Μη特異性結(jié)合，用SDS-PAGE顯示為均一抗體產(chǎn)物，用Μη 包被，間接法ELISA檢測顯示其效價不低于1:1 X 105，所述抗體是由下述方法得到的：用Μη 作為免疫原免疫動物得到的血清進行分離純化，得到抗體，所述純化方法為飽和硫酸銨鹽 析沉淀法和/或親和層析法，其中，免疫方法可以為皮下注射、脾內(nèi)注射、靜脈注射或腹腔注 射，免疫劑量為〇. 3-2mL/只，免疫的動物為大鼠、小鼠、豚鼠、兔、雞、羊、馬、豬或驢，優(yōu)選兔。
[0049] 上述抗Μη多克隆抗體的制備方法，具體步驟為：
[0050] (1)提取白色念珠菌甘露聚糖抗原；
[0051 ] (2)將白色念珠菌甘露聚糖抗原免疫動物。收集Μη抗原免疫的動物的頸動脈血，分 離抗血清；
[0052] (3)用飽和硫酸銨鹽析沉淀法和/或親和層析法進行初步純化：
[0053]所述抗Μη多克隆抗體，是將上述純化的抗Μη多克隆抗體用生物素進行標(biāo)記。
[0054]在本發(fā)明中，所述的濃縮洗液，樣本稀釋液、樣本處理液、底物溶液和終止液都是 免疫生物學(xué)實驗領(lǐng)域常見試劑，其組成成分及配比如下：
[0055]濃縮洗液：按重量份數(shù)計氯化鈉96.0份，氯化鉀2.40份，十二水合磷酸氫二鈉 42.96份，磷酸二氫鉀2.88份，吐溫-20 0.05份，超純水1000份；
[0056] 酶標(biāo)記物:HRP標(biāo)記鏈親和素；
[0057]樣本稀釋液:人工血清；
[0058] 樣本處理液：可采取以下蛋白變性溶液(pH2-pH10): 0.05-0.2mol/L EDTA溶液； 0 · 07-0 · 2mo 1/L甘氨酸-HCL(甘氨酸-鹽酸)溶液;0 · 05-15mg/mL鏈酶蛋白酶;0 · 01-0 · lmo 1/L SDS (十二烷基磺酸鈉)溶液或lmo 1 /L-8mo 1 /L尿素；
[0059] 底物溶液:TMB;
[0060] 終止液:2mo 1 /L硫酸溶液。
[0061 ] 上述抗Μη多克隆抗體、以及Μη標(biāo)準(zhǔn)品a、Mn標(biāo)準(zhǔn)品b、Mn標(biāo)準(zhǔn)品c、Mn標(biāo)準(zhǔn)品d、Mn標(biāo)準(zhǔn) 品e、酶標(biāo)記物、樣本處理液、濃縮洗液、樣本稀釋液、底物溶液和終止液分別放入各個試劑 瓶中，上述各試劑瓶由海綿托架固定，并同Μη包被的酶標(biāo)板和封板膜一同置于試劑盒盒體 內(nèi)。
[0062]在本發(fā)明中，所述多個Μη標(biāo)準(zhǔn)品之間具有濃度差從而得以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，優(yōu)選的， 上述念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒，Μη標(biāo)準(zhǔn)品a的濃度為10ng/ml、Mn標(biāo)準(zhǔn)品b的濃度 為5ng/ml、Mn標(biāo)準(zhǔn)品c的濃度為2.5ng/ml、Mn標(biāo)準(zhǔn)品d的濃度為lng/ml、Mn標(biāo)準(zhǔn)品e的濃度為 0 · 5ng/ml〇
[0063]相應(yīng)的，本發(fā)明公開了上述念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備方法，具 體步驟如下：
[0064] (1)制備酶標(biāo)板
[0065] (a)Mn包被液的配制：采用以下緩沖溶液將Μη稀釋至25ng/100yL-2yg/100yL: 0.01M-0.2M PBS，其ρΗ7·0-ρΗ8·0;0·05-0·2Μ CBS，其pH9.0-pH9.6;0.05mol/L Tris緩沖 液，其ρΗ10·0-ρΗ10·6;
[0066] (b)封閉液的配制:將3%_5%的脫脂奶粉或者1%_4%BSA加入下述緩沖溶液中， 配制成封閉液:緩沖溶液，〇 · 01M-0 · 2M PBS，其ρΗ7 · 0-pH8 · 0;
[0067] (c)包被酶標(biāo)板：
[0068]①將配制的Μη包被液加入酶標(biāo)板孔中，每孔分別加入60yL-200yL包被液；
[0069] ②酶標(biāo)板置于2-8°C環(huán)境下包被8-16h;
[0070] ③將配制的封閉液加入酶標(biāo)板孔中，每孔分別加入60yL-200yL封閉液，置于37°C 溫箱，30-90分鐘；
[0071] ④從溫箱取出酶標(biāo)板后棄去封閉液，37°C恒溫30-90分鐘，即得；
[0072 ] (2)標(biāo)準(zhǔn)品的制備(定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立）
[0073] 標(biāo)準(zhǔn)品的制備是將Μη用人工血清配制而成，稀釋濃度分別是10ng/ml，5ng/ml， 2·5ng/ml，lng/ml，0·5ng/ml;
[0074] (3)抗Μη多克隆酶標(biāo)抗體溶液的配制：將生物素標(biāo)記的抗Μη多克隆抗體用偶聯(lián)物 穩(wěn)定劑以1:2000-1:20000的比例稀釋而成；
[0075] (4)HRP標(biāo)記鏈親和素溶液的配制:將HRP標(biāo)記鏈親和素用偶聯(lián)物穩(wěn)定劑以1: 2000- 1:20000的比例稀釋而成；
[0076] (5)樣本處理液的配制：分別用超純水配制成以下pH 2-ρΗΙΟ的樣本處理液:0.05- 0 · 2mol/L EDTA溶液;0 · 07-0 · 2mol/L甘氨酸-HCL(甘氨酸-鹽酸)溶液;0 · 05-15mg/mL鏈酶蛋 白酶;0.01-0· lmol/LSDS溶液或lmol/L_8mol/L尿素；
[0077] (6)濃縮洗液（20X0.01M PBS)的配制：按重量份數(shù)稱取氯化鈉96.0份，氯化鉀 2.40份，十二水合磷酸氫二鈉42.96份，磷酸二氫鉀2.88份，吐溫-20 0.05份，超純水1000 份，混合均勻；
[0078] (7)樣本稀釋液為:人工血清；
[0079] (8)底物溶液為:TMB;
[0080] (9)終止液的配制:將濃硫酸與超純水1:8稀釋，配制成2mol/L硫酸溶液的終止液。
[0081] 進一步的，本發(fā)明還公開了上述念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒在檢測Μη濃 度方面的應(yīng)用。
[0082] 優(yōu)選的，上述念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒檢測Μη濃度的應(yīng)用采用競爭 ELI SA方法(一步法），包括Μη包被的酶標(biāo)板，Μη免疫的兔源多克隆生物素標(biāo)記抗體，Μη標(biāo)準(zhǔn) 品a，Μη標(biāo)準(zhǔn)品b，Μη標(biāo)準(zhǔn)品c，Μη標(biāo)準(zhǔn)品d，Μη標(biāo)準(zhǔn)品e，酶標(biāo)記物、濃縮洗液，樣本稀釋液、樣本 處理液、底物溶液和終止液，具體步驟如下：
[0083] a)取待檢樣本與樣本處理液以1:1-5:1的體積比混合并煮沸l(wèi)-10min后離心得到 待檢測物；
[0084] b)將步驟a)的待檢測物與生物素標(biāo)記的抗Μη多克隆酶標(biāo)抗體等體積混勻并加入 Μη包被的酶標(biāo)板中同時孵育20-60min，孵育后洗板；
[0085] c)向步驟b)的酶標(biāo)板中加入HRP標(biāo)記鏈親和素孵育20-60min，孵育后洗板；
[0086] d)向步驟c)的酶標(biāo)板中加入TMB顯色15min后，加入終止液后進行檢測，于酶標(biāo)儀 上讀取450納米處的吸光光度值。
[0087]與已有產(chǎn)品相比，本發(fā)明的技術(shù)區(qū)別在于：1、方法不同：Bio-Rad念珠菌菌試劑盒 采用雙抗夾心法，本發(fā)明采用競爭法，先將Μη包被在酶標(biāo)板上，再將待檢樣本或標(biāo)準(zhǔn)抗原與 包被抗原競爭結(jié)合有限的抗體結(jié)合位點，測定結(jié)果的顏色深淺和待檢抗原的濃度呈負相 關(guān)。2、抗體不同：Bio-Rad念珠菌試劑盒采用的念珠菌單抗，本發(fā)明所用抗體為抗Μη多克隆 酶標(biāo)抗體，可根據(jù)Μη標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待檢抗原的濃度值，該檢測試 劑盒具有較好的敏感性和特異性，結(jié)果與參比試劑符合率高，能提供更準(zhǔn)確可靠的檢驗結(jié) 果，所述試劑盒操作簡便易行，檢測快速靈敏，所用酶標(biāo)儀簡單、普及，價格低廉，該檢測試 劑盒為Μη定量檢測提供了一種有效工具。
【附圖說明】
[0088]圖1顯示了多克隆抗體的SDS-PAGE檢測的結(jié)果。
[0089]圖2顯示了多克隆抗體的效價測定的結(jié)果。
[0090]圖3顯示了 Μη試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實施方式】
[0091]實施例1抗Μη多克隆抗體的制備 [0092] 1.免疫動物
[0093]將白色念珠菌甘露聚糖抗原對3只成年雌性新西蘭大白兔采用背部多點皮下注射 法進行免疫，免疫前1周去兔耳緣靜脈血，分離血清作為陰性對照，免疫劑量為l.OmL/次，每 次免疫時加注l.OmL弗氏佐劑作為免疫佐劑，分別于初次免疫后第7、14、21和28天再加強免 疫一次。
[0094] 2.多克隆抗體的獲得
[0095] 1)效價測定:經(jīng)過3次免疫后，從兔子耳緣靜脈取血，采血量為lmL/只，分離血清， 用間接ELISA法檢測血清中的抗體效價。該多克隆抗體效價很高，大于1:1 X 105。
[0096] 2)分離抗血清：當(dāng)兔子效價高于1:1 X 105時，用頸動脈放血的方法大量采血，取血 后在室溫下放置約2h，然后4°C放置過夜使其凝固，2500rpm離心15min，取上清。
[0097] 3)用飽和硫酸銨鹽析法進行初步純化
[0098] 1 ·飽和硫酸銨一次沉淀
[0099] 取17ml上述血清放入燒杯中，并加入等體積的生理鹽水（17ml)，在攪拌器上攪拌， 緩慢滴加總體積50%的飽和硫酸銨(34ml)，攪拌3-5分鐘，轉(zhuǎn)到4°C冰箱內(nèi)保存過夜。
[0100] 2.飽和硫酸銨二次沉淀及透析
[0101 ] (1)將一次沉淀的同一種血清蛋白分裝在2個50ml離心管中，5000rpm離心15min;
[0102] (2)去上清液，向離心管內(nèi)放入總體積60 % (10.27ml)的生理鹽水，使之完全溶解， 在溶解過程中進行吹打，在緩慢滴總體積40 %加飽和硫酸銨(6.8ml )，不斷震蕩，轉(zhuǎn)到4 °C冰 箱內(nèi)保存，沉淀至少2.5小時。
[0103] (3)取2次沉淀后的血清溶液經(jīng)離心機離心，5000rpm離心15min，去掉上清液。根據(jù) 沉淀量加入2_3ml高壓PBS，進行吹打使之完全溶解，取透析膜，將溶解好的血清放入透析膜 中進行透析，轉(zhuǎn)到4°C冰箱內(nèi)保存。每隔2-3h換液一次，共換3-4次。
[0104] 3.用親和層析法進行純化
[0105] (1)稱取Protein A Sepharose干粉100mg，經(jīng)PBS 4°C過夜充分溶脹，裝柱后用PBS 平衡。
[0106] (2)將透析后的多克隆抗體粗提物在4°C下反復(fù)過柱20次，過柱液保留。
[0107] (3)以0.01M PB 0.14M NaCl PH7.4充分淋洗柱子，至分光光度測定0D280約等于0 或0D280值基本不再降低。
[0108] (4)換0.1M甘氨酸-HC1 pH2.8洗脫，第一次500μ1，洗脫產(chǎn)物立即以約20μ1的1.0M Tris-HCl ρΗ9.0中和。洗脫液依次遞減，收集洗脫產(chǎn)物。得到白色念珠菌多克隆抗體。
[0109] 實施例2抗Μη多克隆抗體的檢測
[0110] 1 · SDS-PAGE 電泳檢測
[0111] 對實施例1制得的抗體進行SDS-PAGE電泳，對得到的凝膠進行考馬斯亮藍染色。實 驗結(jié)果見圖1。由圖中可看出，在25KD和50KD分子量區(qū)有清晰明顯的條帶，說明抗體純度很 尚。
[0112] 2.效價測定
[0113] 用間接ELISA法對抗體效價進行測定。所用包被原為白色念珠菌甘露聚糖抗原，所 用酶標(biāo)二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG。檢測結(jié)果見圖2。從結(jié)果可看出，該多克隆 抗體效價很高，大于1:1 X 1〇5。
[0114] 實施例3念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0115] 一、酶標(biāo)板的制備
[0116] 1、包被液的配制：
[0117] 所述的Μη包被液，采用0.01M PBS溶液將Μη稀釋至25ng/100yL pH7.0-pH 7.4。
[0118] 2、封閉液的配制：
[0119] 1)所述的封閉液，采用0.01M PBS溶液，其pH7.0-pH7.4;
[0120] 2)將3%的脫脂奶粉加入上述溶液中，配制成封閉液。
[0121] 3、酶標(biāo)板的包被方法：
[0122] 1)將配制的包被液加入酶標(biāo)板孔中，每孔分別加入60yL包被液；
[0123] 2)上述酶標(biāo)板置于2_8°C環(huán)境下包被8h;
[0124] 3)將配制的封閉液加入酶標(biāo)板孔中，每孔分別加入60yL封閉液，置于37°C溫箱，30 分鐘；
[0125] 4)從溫箱取出酶標(biāo)板后棄去封閉液，37 °C恒溫30分鐘。
[0126]二、標(biāo)準(zhǔn)品的制備(定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立）
[0127]標(biāo)準(zhǔn)品的制備是將Μη用人工血清配制而成，稀釋濃度分別是10ng/ml，5ng/ml， 2·5ng/ml，lng/ml，0·5ng/ml〇
[0128] 三、抗Μη的多克隆生物素標(biāo)記抗體溶液的配制
[0129] 抗Μη的多克隆酶標(biāo)抗體溶液的配制是將生物素標(biāo)記的抗Μη的多克隆酶標(biāo)抗體用 偶聯(lián)物穩(wěn)定劑以1:2000的比例稀釋而成。
[0130] 四、酶標(biāo)記物的配制
[0131] HRP標(biāo)記鏈親和素溶液的配制是將HRP標(biāo)記鏈親和素用偶聯(lián)物穩(wěn)定劑以1: 2000的 比例稀釋而成。
[0132] 五、樣本處理液的配制
[0133] 可選用以下處理液：用超純水溶解乙二胺四乙酸二鈉，配制成0.05mol/L EDTA溶 液，pH 4·0-ρΗ4·8。
[0134] 六、濃縮洗液（20X0.01Μ PBS)
[0135] 濃縮洗液:氯化鈉96.0份，氯化鉀2.40份，十二水合磷酸氫二鈉42.96份，磷酸二氫 鉀2.88份，吐溫-20 0.05份，超純水1000份。
[0136] 七、樣本稀釋液
[0137] 人工血清。
[0138] 八、底物溶液
[0139] TMB〇
[0140] 九、終止液
[0141] 將濃硫酸與超純水1:8稀釋，配制成2mol/L硫酸溶液作為終止液。
[0142] 實施例4念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0143] 所述的Μη包被液，采用0 · 1M PBS溶液將Μη稀釋至25ng/100yL，ρΗ7 · 6-pH8 · 0，其余 步驟同實施例3。
[0144] 實施例5念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0145] 所述的Μη包被液，采用0 · 2M PBS溶液將Μη稀釋至25ng/100yL，ρΗ7 · 6-pH8 · 0，其余 步驟同實施例3。
[0146] 實施例6念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0147] 所述的Μη包被液，采用0 · 05M CBS溶液將Μη稀釋至25ng/100yL，ρΗ9 · 0-pH9 · 6，其余 步驟同實施例3。
[0148] 實施例7念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0149] 所述的Μη包被液，采用0 · 1M CBS溶液將Μη稀釋至25ng/100yL，ρΗ9 · 0-pH9 · 6，其余 步驟同實施例3。
[0150] 實施例8念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0151] 所述的Μη包被液，采用0.2M CBS溶液將Μη稀釋至25ng/100yL，pH9.0-pH9.6，其余 步驟同實施例3。
[0152] 實施例9念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0153] 所述的Μη包被液，采用0.05M Tris緩沖溶液將Μη稀釋至25ng/100μL，pH10·0-pH10.6，其余步驟同實施例3。
[0154] 實施例10念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0155] 所述的Μη包被液，采用0.01Μ PBS溶液將Μη稀釋至500ng/100yL，其pH7.2-ρΗ7.4。
[0156] 所述的的封閉液，采用0 · 1Μ PBS磷酸鹽緩沖溶液，其ρΗ7 · 6-ρΗ8 · 0，將5%的脫脂奶 粉加入上述溶液中，配制成封閉液，
[0157] 其余步驟同實施例3。
[0158] 實施例11念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0159] 所述的的封閉液，采用0 · 2Μ PBS磷酸鹽緩沖溶液，其ρΗ7 · 6-ρΗ8 · 0，將5%的脫脂奶 粉加入上述溶液中，配制成封閉液，
[0160] 其余步驟同實施例10。
[0161]實施例12念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0162] 所述的的封閉液，采用0 · 2Μ PBS磷酸鹽緩沖溶液，其ρΗ7 · 6-ρΗ8 · 0，將1 %的BSA加 入上述溶液中，配制成封閉液，其余步驟同實施例10。
[0163] 實施例13念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0164] 所述的封閉液，采用0 · 2Μ PBS磷酸鹽緩沖溶液，其ρΗ7 · 6-ρΗ8 · 0，將2 %的BSA加入 上述溶液中，配制成封閉液，其余步驟同實施例10。
[0165] 實施例14念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0166] 所述的封閉液，采用0.2Μ PBS PBS溶液，其ρΗ7·6-ρΗ8·0,將4%的BSA加入上述溶 液中，配制成封閉液，其余步驟同實施例10。
[0167] 實施例15念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0168] 所述的樣本處理液可選用：用超純水溶解乙二胺四乙酸二鈉，配制成0.2mol/L m)TA溶液，pH 4.0-PH4.8。其余步驟同實施例10。
[0169] 實施例16念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0170] 樣本處理液的配制方法為：用超純水溶解十二烷基磺酸鈉，配制成0.01m〇l/L SDS 溶液，Ph8.5-pHl 0，其余步驟同實施例15。
[0171 ]實施例17念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0172] 樣本處理液的配制方法為：用超純水溶解十二烷基磺酸鈉，配制成0.05mol/L SDS 溶液，Ph8.5-pHl 0，其余步驟同實施例15。
[0173] 實施例18念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0174] 樣本處理液的配制方法為：用超純水溶解十二烷基磺酸鈉，配制成0. lmol/L SDS 溶液，Ph8.5-pHl 0，其余步驟同實施例15。
[0175]實施例19念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0176]樣本處理液的配制方法為：用超純水溶解甘氨酸，配制成0.07mol/L甘氨酸，再用 濃HCL溶液調(diào)節(jié)pH至pH2.2-pH 2.8其余步驟同實施例15。
[0177]實施例20念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0178]樣本處理液的配制方法為：用超純水溶解甘氨酸，配制成0.13mol/L甘氨酸，再用 濃HCL溶液調(diào)節(jié)pH至pH2.2-pH 2.8其余步驟同實施例15。
[0179]實施例21念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0180]樣本處理液的配制方法為：用超純水溶解甘氨酸，配制成0.2mol/L甘氨酸，再用濃 HCL溶液調(diào)節(jié)pH至pH2.2-pH 2.8其余步驟同實施例15。
[0181 ]實施例22念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0182] 樣本處理液的配制方法為：用超純水溶解鏈酶蛋白酶，配制成0.05mg/mL鏈酶蛋白 酶溶液，PH8. Ο-pH 9.0，其余步驟同實施例15。
[0183] 實施例23念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0184] 樣本處理液的配制方法為：用超純水溶解鏈酶蛋白酶，配制成5mg/mL鏈酶蛋白酶 溶液，PH8. Ο-pH 9.0，其余步驟同實施例15。
[0185] 實施例24念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0186] 樣本處理液的配制方法為:用超純水溶解鏈酶蛋白酶，配制成15mg/mL鏈酶蛋白酶 溶液，PH8. Ο-pH 9.0，其余步驟同實施例15。
[0187] 實施例25念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0188] 樣本處理液的配制方法為：用超純水溶解尿素，配制成lmol/L尿素，pH7.2-pH8.0， 其余步驟同實施例15。
[0189] 實施例26念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0190] 樣本處理液的配制方法為：用超純水溶解尿素，配制成4mol/L尿素，pH7.2-pH8.0， 其余步驟同實施例15。
[0191 ]實施例27念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備
[0192] 樣本處理液的配制方法為：用超純水溶解尿素，配制成8m〇VL尿素，pH7.2-pH8.0， 其余步驟同實施例15。
[0193] 實施例28Mn免疫檢測試劑盒檢測步驟
[0194] 一、樣本的處理
[0195] 1)將待檢樣本與樣本處理液以3:1的體積比混合后沸水浴5min。
[0196] 2)將水浴后的混合液5,000g離心5min。
[0197] 3)離心后上清液用于檢測。
[0198] 二、檢測步驟
[0199] 1)取出已預(yù)包被抗原的96孔酶標(biāo)板；
[0200] 2)配制工作洗滌液:濃縮洗液稀釋20 X (1份濃縮洗液（20X0.01M roS)加19份的 無菌去離子水或超純水）；
[0201 ] 3)加樣:分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)曲線組、待測樣品組，其中
[0202] 標(biāo)準(zhǔn)曲線組:各標(biāo)準(zhǔn)曲線點(0 · 5ng/ml_10ng/ml)
[0203] 待測樣本組:處理后的待測樣本
[0204]將兩組分別與抗Μη生物素標(biāo)記抗體等體積加入酶標(biāo)板孔中，在37°C下孵育40min; [0205] 5)洗滌:甩掉反應(yīng)液，每孔每次加入不少于300yL的洗液，靜置40s后拍干，重復(fù)上 述洗滌操作，共洗滌3次；
[0206] 6)加樣:將酶標(biāo)記鏈親和素加入酶標(biāo)板孔中，在37°C下孵育40min;
[0207] 7)洗滌:甩掉反應(yīng)液，每孔每次加入不少于300yL的洗液，靜置40s后拍干，重復(fù)上 述洗滌操作，共洗滌3次；
[0208] 8)顯色:洗滌結(jié)束后，每孔加入底物溶液80yL，在37 °C孵育15min，避光；
[0209] 9)終止:每孔內(nèi)加入50yL終止液，混勻后，在0D450nm處讀數(shù)；
[0210] 10)結(jié)果判斷:在計算機中分別輸入標(biāo)準(zhǔn)液和待測樣品的吸光度測定值，根據(jù)計算 軟件繪制的半對數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和方程，即可自動計算出各待測樣品中Μη的濃度值。
[0211] 實施例34試劑盒的臨床應(yīng)用(應(yīng)用了實施例10的試劑盒和實施例28的檢測步驟）
[0212] Μη免疫檢測試劑盒參考值的確定
[0213] 臨床確診為念珠菌感染陽性樣本60例，同時檢測正常人樣本300例，測定0D450值， 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(表1，圖3)計算抗原濃度值(表2)，最終確定參考值判斷標(biāo)準(zhǔn)(表3)。
[0214] 表1檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0216] 表2Μη免疫檢測試劑盒參考值的確定ELISA臨床檢測結(jié)果
[0217]
[0218] 注表示與正常人比較p〈〇.〇l;
[0219] 表3
[0220]
[0221] 如果樣本的檢測結(jié)果落在可疑區(qū)間，則需要進行第二次檢測。
[0222] 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果計算檢測抗原的濃度，通過檢測300例正常人樣本，取95%置 信區(qū)間的抗原的濃度值為Cut-off上限：^ (平均值)+2s(標(biāo)準(zhǔn)偏差）=0.5+2*0.25 = 1.0，通 過檢測60例陽性病人，取95%置信區(qū)間的抗原的濃度值為Cut-off下限：i(平均值）一2s (標(biāo)準(zhǔn)偏差）=2· 5 -2*0·9 = 0· 7，抗原的濃度值在0· 7ng/ml-l ·Ong/ml之間為疑似病人。
[0223] 實施例35試劑盒的方法學(xué)考察（應(yīng)用了實施例22的試劑盒和實施例32的檢測步 驟）
[0224] 1、敏感性實驗
[0225] 收集臨床確診樣本20例進行檢驗。
[0226] 診斷敏感性=陽性樣本檢出例數(shù)/陽性樣本總例數(shù)X 100%，由實驗結(jié)果說明本實 驗的敏感性在85%以上。
[0227] 表4敏感性檢測實驗結(jié)果

[0230] 2、特異性實驗
[0231] 檢測20例健康人樣本。
[0232] 特異性=陰性樣本檢出例數(shù)/陰性樣本總例數(shù)X 100%，由實驗結(jié)果說明本實驗的 敏感性在90%以上。
[0233] 表5特異性檢測實驗結(jié)果

[0236] 3、回收率實驗
[0237] 選擇正常人血液添加念珠菌甘露聚糖抗原2yg/L、3yg//L后檢測，計算真實值與期 望值的比值，得到回收率?；厥章式橛?0-120%之間認為合格。由實驗結(jié)果說明本實驗的回 收率介于80%-120%之間，回收率良好。
[0238] 表6回收率結(jié)果實驗
[0240] 4、重復(fù)性實驗
[0241] 1)批間精密度
[0242] 合格標(biāo)準(zhǔn):將同一標(biāo)本每天一次測試，連續(xù)10個工作日，計算其均值M、標(biāo)準(zhǔn)差SD與 變異系數(shù)CV，變異系數(shù)CV < 25 %為合格。結(jié)論:本產(chǎn)品批間精密度（即變異系數(shù)CV)為24%， 小于25%，符合標(biāo)準(zhǔn)，證明本產(chǎn)品批間精密度良好。
[0243] 表7批間精密度結(jié)果實驗
[0245] 2)批內(nèi)精密度
[0246] 合格標(biāo)準(zhǔn):將同一標(biāo)本在同一批次實驗中平行測定10組數(shù)據(jù)。計算其均值M、標(biāo)準(zhǔn) 差SD與變異系數(shù)CV，變異系數(shù)CV < 15%為合格。本產(chǎn)品批內(nèi)精密度(即變異系數(shù)CV)為14%， 小于15%，符合標(biāo)準(zhǔn)，驗證合格。
[0247] 表8批內(nèi)精密度結(jié)果實驗
[0249] 5、穩(wěn)定性實驗
[0250] 將組裝好的試劑盒在37 °C環(huán)境中放置，每天做標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測已知濃度的抗原溶 液，連續(xù)檢測5天，檢測值變化率（即變異系數(shù)CV)小于20%，證明試劑盒穩(wěn)定。其結(jié)果顯示5 天的變異系數(shù)CV < 20%，說明本發(fā)明穩(wěn)定性良好。
[0251 ]表9穩(wěn)定性試驗結(jié)果
[0252]
[0253] 上述【具體實施方式】是對本發(fā)明念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒及其制備方 法與應(yīng)用進行的詳細描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個 實施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒，其特征在于:包括Μη包被的酶標(biāo)板和抗 Μη多克隆生物素標(biāo)記抗體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒，其特征在于:還包括Μη 標(biāo)準(zhǔn)品、樣本處理液、酶標(biāo)記物、濃縮洗液、樣本稀釋液、底物溶液和終止液。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒，其特征在于:各組分組 成及配比如下： 濃縮洗液:按重量份數(shù)計氯化鈉96.0份，氯化鉀2.40份，十二水合磷酸氫二鈉42.96份， 磷酸二氫鉀2.88份，吐溫-20 0.05份，超純水1000份； 樣本稀釋液:人工血清； 樣本處理液:可采取以下蛋白變性溶液，其ρΗ2-ρΗ10，0.05-0.2mo 1/L EDTA溶液;0.07-0 · 2mol/L甘氨酸-HCL溶液;0 · 05-15mg/mL鏈酶蛋白酶;0 · 01-0 · lmol/L SDS溶液或lmol/L-8mol/L 尿素； 底物溶液:TMB溶液； 終止液:2mol/L硫酸溶液。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒，其特征在于:多個Μη標(biāo) 準(zhǔn)品之間具有濃度差。5. 權(quán)利要求1-4之一所述的念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備方法，其特征 在于:具體步驟如下， (1) 制備酶標(biāo)板 (3)111包被液的配制：采用以下緩沖溶液將血稀釋至25叫/10(^1^-2以8/10(^1^0.0謂- 0.21卩85，其？!17.0-?!18.0;0.05-0.21〇85，其？!19.0-?!19.6;0.05111〇1/11^8緩沖液，其 ρΗ10.0-ρΗ10.6； (b) 封閉液的配制:將3%-5%的脫脂奶粉或者1%-4%BSA加入緩沖溶液中配制成封閉 液;其中緩沖溶液為〇 · 01M-0 · 2M PBS，其ρΗ7 · 0-pH8 · 0; (c) 包被酶標(biāo)板： ① 將配制的Μη包被液加入酶標(biāo)板孔中，每孔分別加入60yL-200yL包被液； ② 酶標(biāo)板置于2_8°C環(huán)境下包被8-16h; ③ 將配制的封閉液加入酶標(biāo)板孔中，每孔分別加入60yL-200yL封閉液，置于37°C溫箱， 30-90分鐘； ④ 從溫箱取出酶標(biāo)板后棄去封閉液，37°C恒溫30-90分鐘，即得； (2) 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 標(biāo)準(zhǔn)品采用Μη用人工血清配制而成，稀釋濃度分別是500ng/ml-0. lng/ml; (3) 抗Μη多克隆生物素標(biāo)記抗體溶液的配制:將生物素標(biāo)記的抗Μη多克隆酶標(biāo)抗體用 偶聯(lián)物穩(wěn)定劑以1:2000-1:20000的比例稀釋而成； (4) HRP標(biāo)記鏈親和素溶液的配制：將HRP標(biāo)記鏈親和素用偶聯(lián)物穩(wěn)定劑以1: 2000-1: 20000的比例稀釋而成； (5) 樣本處理液的配制：分別用超純水配制成以下pH2-pH10的樣本處理液Α.Οδ-Ο · 2mol/L EDTA 溶液； 0 · 07-0 · 2mol/L 甘氨酸-HCL 溶液； 0 · 05-15mg/mL 鏈酶蛋白酶； 0 · 01-0 · lmol/L SDS溶液或lmol/L_8mol/L尿素； (6) 濃縮洗液(20 X 0.01M roS)的配制：按重量份數(shù)稱取氯化鈉96.0份，氯化鉀2.40份， 十二水合磷酸氫二鈉42.96份，磷酸二氫鉀2.88份，吐溫-20 0.05份，超純水1000份，混合均 勻； (7) 樣本稀釋液為:人工血清； (8) 底物溶液為:TMB溶液； (9) 終止液的配制:將濃硫酸與超純水1:8稀釋，配制成2mol/L硫酸溶液作為終止液。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒的制備方法，其特征在 于:所述抗Μη多克隆抗體的制備包括下述步驟： (1) 提取白色念珠菌甘露聚糖抗原； (2) 將白色念珠菌甘露聚糖抗原免疫動物，收集Μη抗原免疫的動物的頸動脈血，分離抗 血清； (3) 用飽和硫酸銨鹽析沉淀法和親和層析法進行純化。7. 權(quán)利要求1-4之一所述的念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒在檢測Μη濃度方面的 應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的念珠菌甘露聚糖抗原免疫檢測試劑盒檢測Μη濃度的應(yīng)用，其 特征在于采用競爭ELISA方法，包括Μη包被的酶標(biāo)板，Μη標(biāo)準(zhǔn)品，濃縮洗液，樣本稀釋液、樣 本處理液、底物溶液和終止液，具體步驟如下： a) 取待檢樣本與樣本處理液以1:1-5:1的體積比混合并煮沸l(wèi)-10min后離心得到待檢 測物； b) 將步驟a)的待檢測物與辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗Μη多克隆酶標(biāo)抗體等體積混勻并 加入Μη包被的酶標(biāo)板中同時孵育20-60min，孵育后洗板； c) 向步驟b)的酶標(biāo)板中加入TMB顯色15min后，加入終止液后進行檢測，于酶標(biāo)儀上讀 取450納米處的吸光光度值。
【文檔編號】G01N33/569GK105866409SQ201610496020
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月27日
【發(fā)明人】彭潔, 劉春龍, 李寧, 粟艷, 周澤奇
【申請人】丹娜（天津）生物科技有限公司