專利名稱：一種地衣芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及Y-PGA高產(chǎn)菌株及其應(yīng)用，即地衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniformis)P-104 及其發(fā)酵生產(chǎn) γ-PGA 的方法。
背景技術(shù)：
Y -聚谷氨酸(Y -polyglutamic acid, y -PGA)是一種由 L-谷氨酸和 D-谷氨酸為單體，通過α-氨基和Y-羧基以肽鍵的形式縮合而成的同聚酰胺。Y-PGA多由微生物發(fā)酵產(chǎn)生，分子量通常為IOO-IOOOkDa (Buescher，J. Μ. and A. Margaritis. Microbial biosynthesis of polyglutamic acid biopolymer and applications in the biopharmaceutical, biomedical and food industries. Critical Reviews in Biotechnology，2007，27 :1-19)，不同分子量的Y-PGA具有不同的用途。Y-PGA不僅具有良好的生物相容性和生物可降解性，還具有增稠性、乳化性、成膜性、成纖維性、保濕性、粘性等功能特性，其降解產(chǎn)物為對(duì)人體和環(huán)境無(wú)公害的谷氨酸，是一種對(duì)環(huán)境友好且具有優(yōu)良性能的綠色高分子材料。廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域作為藥物載體以及結(jié)構(gòu)材料、用于化妝品保濕添加劑、食品工業(yè)的增稠劑和抗凍劑、工業(yè)膠黏劑等等，具有極大的商業(yè)開發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景。目前，眾多學(xué)者開展Y-聚谷氨酸高產(chǎn)菌的選育、代謝途徑、發(fā)酵工藝、分離純化工藝以及性質(zhì)、應(yīng)用的研究。發(fā)酵生產(chǎn)Y-PGA的菌種主要為芽胞桿菌屬細(xì)菌，其中枯草芽抱桿菌、地衣芽抱桿菌研究最多?？莶菅挎邨U菌的產(chǎn)量普遍較地衣芽孢桿菌高， 但是因?yàn)槿菀资艿绞删w的侵染，造成損失，因此地衣芽孢桿菌更加受到關(guān)注。Cheng 等采用 B. licheniformis A35 生產(chǎn) γ-PGA(Cheng C, Asada Y, Aaida Τ. Production of y-polyglutamic acid by Bacillus licheniformis A35under denitrifying conditions. Agric. Biol. Chem.，1989，53 :2369-2375)產(chǎn)量為 8g/L,且存在發(fā)酵周期長(zhǎng)、需要無(wú)機(jī)厭氧培養(yǎng)基、發(fā)酵產(chǎn)率低、產(chǎn)物分子量小等不足。為了解決這一問題，研究者公開了采用 B. licheniformis ATCC 9945A 生產(chǎn)聚 Y-PGA 的方法(US Patent 5378807,1995)。先后有眾多研究者通過基因工程、培養(yǎng)基優(yōu)化、培養(yǎng)條件控制等手段，使其產(chǎn)量有所提高，但使用B. licheniformis ATCC 9945A，產(chǎn)量一般在17_45g/L左右，且發(fā)酵時(shí)間一般為9 ι相對(duì)較長(zhǎng)，且過程中需添加高濃度的甘油，故其生產(chǎn)成本高。B. licheniformis SAB46的產(chǎn)量較高(Abdel-Fattah, Y. R. ,N. A. Soliman, and Μ. Μ. Berekaa, Application of Box-Behnken Design for Optimization of Poly-y-Glutamic Acid Production by Bacillus licheniformis SAB-26. Research journal of microbiology, 2007, 2 (9) :664-670),能夠達(dá)到產(chǎn)量59. 9g/L，但是周期為72h也較長(zhǎng)，且B. licheniformis SAB-洸生產(chǎn)的γ-PGA分子量?jī)H有70kDa-180kDa，不能夠滿足高分子量的需求。綜上所述，地衣芽孢桿菌生產(chǎn)周期長(zhǎng)、生產(chǎn)效率低、成本高。因此，篩選一株高效Y-PGA生產(chǎn)菌并開發(fā)低成本的生產(chǎn)工藝具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)效率高、生產(chǎn)成本低的菌株，以及用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)Y-PGA的方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)本發(fā)明提供一種用于Y -PGA發(fā)酵生產(chǎn)的地衣芽孢桿菌(Bacillus lichenifOrmis)P-104，于2010年9月14日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC No. 4156。本發(fā)明所提供的菌株P(guān)-104細(xì)胞呈直桿狀，革蘭氏染色陽(yáng)性。在LB固體培養(yǎng)基上菌落圓形，干燥，不透明，蔓延，邊緣不齊，毛發(fā)狀。最適生長(zhǎng)溫度30-37°C，適宜pH 6. 8-7. 2。接觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性，硝酸鹽試驗(yàn)陽(yáng)性，檸檬酸鹽試驗(yàn)陽(yáng)性，明膠液化試驗(yàn)陽(yáng)性。本發(fā)明所提供菌株P(guān)-104的16S rRNA基因序列有1382個(gè)堿基，測(cè)得的16SrRNA 序列通過MEG. 4軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，進(jìn)化樹顯示該菌株屬于地衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniformis)0綜合形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化鑒定和16S rRNA基因分子鑒定結(jié)果，該菌株被鑒定為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。本發(fā)明同時(shí)提供了一種用B. licheniformis P-104生產(chǎn)Y-PGA的方法。包括以下步驟a、采用地衣芽孢桿菌p-104、保藏編號(hào)為CGMCC No. 4156的菌株作為生產(chǎn)菌株；b、將上述菌株接在LB培養(yǎng)基固體斜面上培養(yǎng)8_14h ；刮取菌苔至無(wú)菌甘油保藏管中；在冷凍條件下保藏，冷凍溫度不高于-70°C ；C、制備種子液(1)將上述冷凍保藏的菌種接種到LB固體培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)至少對(duì)-3他，使其活化；(2)將上述活化的種子轉(zhuǎn)接到LB液體種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期；d、發(fā)酵培養(yǎng)(1)配置發(fā)酵培養(yǎng)基每IL培養(yǎng)基加入谷氨酸鈉IO-IOOg ；碳源IO-IOOg ；無(wú)機(jī)氮源 3-20g ；K2HPO4 · 3H20 0. l_2g ；MgSO4 · 7H20 0. l_2g ；檸檬酸鈉 2-10g ；MnSO4O. 01-0. 2g ；補(bǔ)充蒸餾水至IOOOmL,調(diào)節(jié)pH 6. 0-7. 5 ；(2)將上述發(fā)酵培養(yǎng)基投入搖瓶或發(fā)酵罐中，高壓蒸汽滅菌至少20min后，冷卻至 30-37°C，按1-5%的接種量接入種子液，培養(yǎng)Μ-4 !；e、提取將d中得到的菌株培養(yǎng)液離心除去菌體、收集上清液，并用乙醇或異丙醇沉淀、回收Y-PGA。制備種子液步驟O)時(shí)培養(yǎng)8-1 至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期。搖瓶培養(yǎng)是在三角瓶中裝入一定量的培養(yǎng)基配上瓶塞，經(jīng)滅菌后接種，在搖瓶上進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng)。搖瓶培養(yǎng)依賴搖動(dòng)振蕩使培養(yǎng)基液面與上方空氣不斷接觸，供給微生物生長(zhǎng)所需的溶氧量。本發(fā)明采用搖瓶培養(yǎng)時(shí)，按50-100mL/500mL三角瓶的裝液量投入發(fā)
酵培養(yǎng)基。發(fā)酵罐，指工業(yè)上用來(lái)進(jìn)行微生物發(fā)酵的裝置。其主體一般為用不銹鋼板制成的主式圓筒，其容積在Im3至數(shù)百m3。在設(shè)計(jì)和加工中應(yīng)注意結(jié)構(gòu)嚴(yán)密，合理。能耐受蒸汽滅菌、有一定操作彈性、內(nèi)部附件盡量減少(避免死角)、物料與能量傳遞性能強(qiáng)，并可進(jìn)行一定調(diào)節(jié)以便于清洗、減少污染，適合于多種產(chǎn)品的生產(chǎn)以及減少能量消耗。發(fā)酵罐是一種對(duì)物料進(jìn)行機(jī)械攪拌與發(fā)酵的設(shè)備。該設(shè)備采用內(nèi)循環(huán)方式，用攪拌槳分散和打碎氣泡，它溶氧速率高，混合效果好。罐體采用SUS304或316L進(jìn)口不銹鋼，罐內(nèi)配有自動(dòng)噴淋清洗機(jī)頭，確保生產(chǎn)過程符合GMP要求。本發(fā)明采用發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)，按發(fā)酵罐容積的40-80%投入發(fā)酵培養(yǎng)基，攪拌速度為200-600rpm，通氣量為0. 5-2vvm。在發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中可以進(jìn)行補(bǔ)料；補(bǔ)料方式優(yōu)選加入葡萄糖。補(bǔ)料發(fā)酵可以解除底物抑制、葡萄糖效應(yīng)、代謝阻退等問題，得到較高的轉(zhuǎn)化率、染菌和退化的概率小、對(duì)發(fā)酵過程可實(shí)現(xiàn)優(yōu)化控制等優(yōu)點(diǎn)。深層發(fā)酵是指在發(fā)酵過程中從發(fā)酵底部通入無(wú)菌空氣并攪拌，使空氣與發(fā)酵液的接觸面積極大提高。從而大幅度提高氧氣含量。本發(fā)明使用發(fā)酵罐時(shí)為深層發(fā)酵，能夠有效提高轉(zhuǎn)化率。LB培養(yǎng)基是一種培養(yǎng)基的名稱，生化分子實(shí)驗(yàn)中一般用該培養(yǎng)基來(lái)預(yù)培養(yǎng)菌種， 使菌種成倍擴(kuò)增，達(dá)到使用要求。培養(yǎng)的菌種一般是經(jīng)過改造的無(wú)法在外界環(huán)境單獨(dú)存活和擴(kuò)增的工程菌。通過培養(yǎng)工程菌，我們可以表達(dá)大量的外源蛋白，也可以拿到帶有外源基因的質(zhì)粒，工程菌的有效擴(kuò)增是生化分子實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。本發(fā)明所述LB固體培養(yǎng)基含蛋白胨 10g/L、酵母浸出物5g/L、NaC110g/L、瓊脂18g/L，pH 7. 0 ；LB液體種子培養(yǎng)基含蛋白胨IOg/ L、酵母浸出物 5g/L、NaCl 10g/L, pH 7.0。本發(fā)明所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分還包括NaN032_10g ；CaCl2 · 2H20 0. l_2g，添加NaNO3 和CaCl2 ·2Η20的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)效果更好；谷氨酸鈉的含量為30-100g/L ；優(yōu)選地，無(wú)機(jī)氮源為硫酸銨、氯化銨或硝酸鈉中的一種或幾種，例如硫酸銨、硝酸鈉、或同時(shí)添加硫酸銨和硝酸鈉作為氮源；含量為5-20g/L ；優(yōu)選地，碳源為葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、淀粉或淀粉水解液，例如葡萄糖、蔗糖、同時(shí)添加葡萄糖和淀粉作為碳源；含量為30-100g/L。本發(fā)明各步驟所述的培養(yǎng)優(yōu)選在30-37°C下進(jìn)行。高壓蒸汽滅菌法(autoclaving)可殺滅包括芽胞在內(nèi)的所有微生物，是滅菌效果最好、應(yīng)用最廣的滅菌方法。方法是將需滅菌的物品放在高壓鍋(autoclave)內(nèi)，加熱時(shí)蒸汽不外溢，高壓鍋內(nèi)溫度隨著蒸汽壓的增加而升高。在103.4kPa(1.05kg/cm2)蒸汽壓下， 溫度達(dá)到121. 3°C，維持15 20分鐘。適用于普通培養(yǎng)基、生理鹽水、手術(shù)器械、玻璃容器及注射器、敷料等物品的滅菌。本發(fā)明所述高壓蒸汽滅菌優(yōu)選在115°C下滅菌30min。本發(fā)明所提供的B. Iicheniformis P-104在用于生產(chǎn)γ-PGA時(shí)，性能明顯優(yōu)于已報(bào)道B. Iicheniformis菌株，主要體現(xiàn)在發(fā)酵周期短，生產(chǎn)效率高采用本發(fā)明菌株 B. Iicheniformis Ρ-104，在7L發(fā)酵罐中間歇發(fā)酵生產(chǎn)Y-PGA，發(fā)酵周期為M_36h，y-PGA 產(chǎn)量可達(dá)到40g/L以上。


附圖1 ； γ -PGA紫外掃描圖譜；附圖2 γ -PGA紅外吸收?qǐng)D譜；附圖3 菌株P(guān)-104的掃描電鏡圖片；附圖4 菌株P(guān)-104的16S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化樹；附圖5 :B. Iicheniformis P-104發(fā)酵生產(chǎn)聚合物產(chǎn)物水解樣品的HPLC分析圖譜， 保留時(shí)間為2. 74min的峰與谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品保留時(shí)間相同。下面對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。但下述的實(shí)例僅僅是本發(fā)明的簡(jiǎn)易例子，并不代表或限制本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍，本發(fā)明的權(quán)利范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。
具體實(shí)施例方式為更好地說(shuō)明本發(fā)明，便于理解本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明的典型但非限制性的實(shí)施例如下本發(fā)明提供一種用于Y-PGA發(fā)酵生產(chǎn)的地衣芽孢桿菌Bacillus Iicheniformis P-104，于2010年9月14日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 (CGMCC)，保藏編號(hào)為 CGMCC No. 4156。實(shí)施例1 本發(fā)明菌株的分離、篩選選取國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的多種豆豉醬，各取Ig于滅菌試管中，加無(wú)菌水9mL，用棉塞封口， 振蕩2min，然后放入水浴鍋中，70°C加熱lOmin，再靜置30min。冷卻后，吸取上清液0. ImL, 稀釋IO2和IO3倍，分別取0. 2mL,涂布LB平板(谷氨酸鈉10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/ L，氯化鈉10g/L，瓊脂粉15g/L，pH7. 2)，37°C培養(yǎng)4 觀察結(jié)果，挑選在LB培養(yǎng)基上呈乳液狀能拉絲的單菌落，接入新鮮LB液體種子培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉 10g/L, pH7. 2)中，37°C搖床培養(yǎng)1 后，按2%的接種量分別接種到裝有50mL滅菌基本發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶(谷氨酸鈉50g/L，葡萄糖50g/L，檸檬酸鈉12g/L，氯化銨7g/L， KH2PO4O. 5g/L, MgSO4 · 7H20 0. 5g/L, CaCl2 · 2Η200· 15g/L, MnSO4 · H2O 0. 104g/L, pH7. 2)中， 37°C，ISOrpm，振蕩培養(yǎng)3 結(jié)束發(fā)酵。對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物分別取樣離心除去菌體，用3倍乙醇沉淀上清液，輕輕振蕩后4000rpm離心15min，收集沉淀物，冷凍干燥，再加入蒸餾水溶解沉淀物，透析去除離子，利用HPLC檢測(cè)產(chǎn)物。實(shí)施例2 本發(fā)明菌株的鑒定生理生化鑒定本發(fā)明所提供的地衣芽孢桿菌菌株菌體直桿狀，革蘭氏染色陽(yáng)性。在LB固體培養(yǎng)基上菌落圓形，干燥，不透明，蔓延，邊緣不齊，毛發(fā)狀。最適生長(zhǎng)溫度30-37°C，適宜pH 6. 8-7. 2。接觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性，硝酸鹽試驗(yàn)陽(yáng)性，檸檬酸鹽試驗(yàn)陽(yáng)性，明膠液化試驗(yàn)陽(yáng)性。利用16S rRNA基因序列分析進(jìn)行菌種鑒定菌株P(guān)-104總DNA通過細(xì)菌基因組抽提試劑盒抽提，16S rRNA基因PCR擴(kuò)增采用通用引物 :AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和(1492r GGTTACCTTGTTACGACTT)進(jìn)行。PCR程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min ；94°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸1.5min，28個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin0基因測(cè)序通過ABI Prism 370自動(dòng)測(cè)序儀完成。測(cè)序結(jié)果顯示該菌株的16S rRNA 基因序列有1382個(gè)堿基，通過MEG. 4軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，進(jìn)化樹顯示菌株LSSE-62 屬于地衣芽胞桿菌。結(jié)合16S rRNA分子鑒定與前面的形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定結(jié)果，鑒定 P-104為芽胞桿菌屬地衣芽胞桿菌。實(shí)施例3 采用本發(fā)明菌株P(guān)-104所生產(chǎn)高分子產(chǎn)物的定性定量分析采用紫外光譜掃描和紅外光譜分析，通過與Y-PGA標(biāo)準(zhǔn)品光譜圖比較，表明菌株 P-104發(fā)酵所得高分子產(chǎn)物為γ-PGA。對(duì)本發(fā)明菌株P(guān)-104所生產(chǎn)的高分子產(chǎn)物在酸性條件下水解，對(duì)水解產(chǎn)物采用HPLC進(jìn)行定性和定量分析，所用色譜柱為Brava C18-BDS，流動(dòng)相為1 Ommo 1 /LKH2PO4 加5. 0 %甲醇(用磷酸調(diào)pH值至2. 5，過濾，超聲波脫氣)，流速為lmL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品作為定性和定量的標(biāo)準(zhǔn)物。Y-PGA濃度=水解后谷氨酸濃度 X129/147。實(shí)施例4 γ -PGA發(fā)酵生產(chǎn)(1)用冷凍保藏的本發(fā)明菌株P(guān)-104作為生產(chǎn)菌株；(2)將冷凍保藏的菌株P(guān)-104，接種到LB培養(yǎng)基固體斜面(含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L、瓊脂18g/L、pH 7. 0)，37°C培養(yǎng)8h,刮取菌苔至無(wú)菌的20%甘油保藏管中；-70°C冷凍保藏；(3)種子液培養(yǎng)將上述冷凍保藏的菌種接種到LB固體培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)Mh，使其活化；將活化的種子轉(zhuǎn)接到含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L、pH7. 0的LB三角瓶液體種子培養(yǎng)基中，37°C，200rpm培養(yǎng)1 至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期；(4)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)按照每IL培養(yǎng)基的加入量配置發(fā)酵培養(yǎng)基谷氨酸鈉70g ；葡萄糖80g ；檸檬酸鈉 IOg ；硫酸銨 IOg ；K2HPO4 ·3Η20 0. 6g ；MgSO4 ·7Η20 0. 6g ；MnSO4O. 15g ；補(bǔ)充蒸餾水至 IOOOmL, PH 7. 5，配制IOOmL發(fā)酵液分裝500mL三角瓶，在115°C下，高壓蒸汽滅菌30min，冷卻至 370C，按照1 %的接種量接入種子液，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，發(fā)酵溫度37°C，發(fā)酵至36h結(jié)束發(fā)酵；(5)將上述菌株培養(yǎng)液離心除去菌體、收集上清液，用95%的乙醇沉淀、回收 Y-PGA。(6)檢測(cè)分析所得到的Y -谷氨酸的濃度為44. 7g/L。實(shí)施例5 γ -谷氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)(1)用冷凍保藏的本發(fā)明菌株P(guān)-104作為生產(chǎn)菌株；(2)將冷凍保藏的菌株P(guān)-104，接種到LB固體斜面(含蛋白胨10g/L、酵母浸出物 5g/L、NaCl 10g/L、瓊脂18g/L、pH 7. 0)，30°C培養(yǎng)14h，刮取菌苔至無(wú)菌的20%甘油保藏管中；-80°C冷凍保藏；(3)種子液培養(yǎng)將上述冷凍保藏的菌種接種到LB固體培養(yǎng)基平板上，30°C培養(yǎng)36h，使其活化；將活化的種子轉(zhuǎn)接到含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L、pH7. 0的LB三角瓶液體種子培養(yǎng)基中，35°C，200rpm培養(yǎng)14h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期；(4)發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)按照每IL培養(yǎng)基的加入量配置發(fā)酵培養(yǎng)基谷氨酸鈉70g ；葡萄糖80g ；檸檬酸鈉 IOg ；硫酸銨 IOg ；K2HPO4 · 3H20 0. 6g ；MgSO4 · 7H20 0. 8g ；MnSO4O. 15g ；NaN032g，補(bǔ)充蒸餾水至1000mL，pH 7. 5，配制3L發(fā)酵液分裝7L發(fā)酵罐，以115°C高壓蒸汽滅菌維持30min，冷卻至37°C按照3%的接種量接入種子液，攪拌速度為600rpm，通風(fēng)量0. 5vvm，發(fā)酵溫度37°C， 發(fā)酵至36h結(jié)束發(fā)酵。(5)將上述菌株培養(yǎng)液離心除去菌體、收集上清液，用異丙醇沉淀、回收Y-PGA。(6)檢測(cè)分析所得到的Y -谷氨酸的濃度為32g/L。實(shí)施例6 Y -谷氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)(1)用冷凍保藏的本發(fā)明菌株P(guān)-104作為生產(chǎn)菌株；
(2)將冷凍保藏的菌株P(guān)-104，接種到LB固體斜面(含蛋白胨10g/L、酵母浸出物 5g/L、NaCl 10g/L、瓊脂18g/L、pH7. 0)，33°C培養(yǎng)10h，刮取菌苔至無(wú)菌的20%甘油保藏管中；-100°C冷凍保藏；(3)種子液培養(yǎng)將上述冷凍保藏的菌種接種到LB固體培養(yǎng)基平板上，34°C培養(yǎng)30h，使其活化；將活化的種子轉(zhuǎn)接到含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L、pH7. 0的LB三角瓶液體種子培養(yǎng)基中，30°C，200rpm培養(yǎng)1 至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期；(4)發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)按照每IL培養(yǎng)基的加入量配置發(fā)酵培養(yǎng)基谷氨酸鈉70g ；葡萄糖80g ；檸檬酸 IOg ；硫酸銨 IOg ；K2HPO4 · 3H20 0. 6g ；MgSO4 · 7H20 0. 8g ；MnSO4O. 15g ；NaN034g ；CaCl2 · 2H20 0. lg，補(bǔ)充蒸餾水至lOOOmL，pH 7. 0，配制3L發(fā)酵液分裝6. 6L發(fā)酵罐，以115°C高壓蒸汽滅菌維持31分鐘，冷卻至30°C按照5%的接種量接入種子液，攪拌速度為400rpm，通風(fēng)量 2vvm,發(fā)酵溫度37 °C，發(fā)酵至2 Ih時(shí)加入40g/L葡萄糖120ml，繼續(xù)發(fā)酵至3 結(jié)束發(fā)酵。(5)將上述菌株培養(yǎng)液離心除去菌體、收集上清液，用95%的乙醇沉淀、回收 Y-PGA。(6)檢測(cè)分析所得到的Y -谷氨酸的濃度為41. 6g/L。實(shí)施例7 y -PGA發(fā)酵生產(chǎn)(1)用冷凍保藏的本發(fā)明菌株P(guān)-104作為生產(chǎn)菌株；(2)將冷凍保藏的菌株P(guān)-104，接種到LB固體斜面(含蛋白胨10g/L、酵母浸出物 5g/L、NaCl 10g/L、瓊脂18g/L、pH 7. 0)，32°C培養(yǎng)llh，刮取菌苔至無(wú)菌的20%甘油保藏管中；-70. 5°C冷凍保藏；(3)種子液培養(yǎng)將上述冷凍保藏的菌種接種到LB固體培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)^h，使其活化；將活化的種子轉(zhuǎn)接到含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L、pH7. 0的LB三角瓶液體種子培養(yǎng)基中，370C，200rpm培養(yǎng)他至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期；(4)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)按照每IL培養(yǎng)基的加入量配置發(fā)酵培養(yǎng)基谷氨酸鈉IOg ；葡萄糖和淀粉IOOg ； 檸檬酸鈉 5g ；硫酸銨和氯化銨 20g ;K2HP04 · 3H20 0. Ig ；MgSO4 · 7H20 2g ；MnSO4O. Olg ；補(bǔ)充蒸餾水至lOOOmL，pH 6.0，配制50mL發(fā)酵液分裝500mL三角瓶，在115°C下，高壓蒸汽滅菌 50min，冷卻至37°C，按照5%的接種量接入種子液，搖床轉(zhuǎn)速230rpm，發(fā)酵溫度37°C，發(fā)酵至24h結(jié)束發(fā)酵；(5)將上述菌株培養(yǎng)液離心除去菌體、收集上清液，用異丙醇沉淀、回收Y-PGA。(6)檢測(cè)分析所得到的Y -谷氨酸的濃度為38. 2g/L。實(shí)施例8 γ -谷氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)(1)用冷凍保藏的本發(fā)明菌株P(guān)-104作為生產(chǎn)菌株；(2)將冷凍保藏的菌株P(guān)-104，接種到LB固體斜面(含蛋白胨10g/L、酵母浸出物 5g/L、NaCl 10g/L、瓊脂18g/L、pH7. 0)，30°C培養(yǎng)8h，刮取菌苔至無(wú)菌的20%甘油保藏管中；-120°C冷凍保藏；(3)種子液培養(yǎng)
將上述冷凍保藏的菌種接種到LB固體培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)30h，使其活化；將活化的種子轉(zhuǎn)接到含蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L、pH7. 0的LB三角瓶液體種子培養(yǎng)基中，30°C，200rpm培養(yǎng)1 至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期；(4)發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)按照每IL培養(yǎng)基的加入量配置發(fā)酵培養(yǎng)基谷氨酸鈉IOOg ；葡萄糖IOg ；檸檬酸鈉 IOg ；硫酸銨3g ；K2HPO4 ·3Η20 2g ；MgSO4 ·7Η200· Ig ；MnSO4O. 15g ；NaNO3IOg ；CaCl2 '2H202g, 補(bǔ)充蒸餾水至1000mL，pH7. 0，配制2. 4L發(fā)酵液分裝3L發(fā)酵罐，以115°C高壓蒸汽滅菌維持 20分鐘，冷卻至30°C按照2%的接種量接入種子液，攪拌速度為200rpm，通風(fēng)量1. 2vvm，發(fā)酵溫度37°C，發(fā)酵至25h時(shí)加入40g/L葡萄糖120ml，繼續(xù)發(fā)酵至4 結(jié)束發(fā)酵。(5)將上述菌株培養(yǎng)液離心除去菌體、收集上清液，用95%的乙醇沉淀、回收 Y-PGA。(6)檢測(cè)分析所得到的Y -谷氨酸的濃度為40. Og/L。申請(qǐng)人:聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的具體操作步驟，但本發(fā)明并不局限于上述操作步驟，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述具體操作步驟才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。
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權(quán)利要求
1.一種用于Y-PGA發(fā)酵生產(chǎn)的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)P-104，于 2010年9月14日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為 CGMCC No. 4156。
2.一種如權(quán)利要求1所述地衣芽孢桿菌P-104在合成、-PGA中的應(yīng)用。
3.一種如權(quán)利要求1所述地衣芽孢桿菌P-104合成制備Y-PGA的方法，包括以下步驟a、采用地衣芽孢桿菌P-104、保藏編號(hào)為CGMCCNo. 4156的菌株作為生產(chǎn)菌株；b、將上述菌株接在LB培養(yǎng)基固體斜面上培養(yǎng)8-14h；刮取菌苔至無(wú)菌甘油保藏管中； 在不高于-70°C冷凍條件下保藏；C、制備種子液(1)將上述冷凍保藏的菌種接種到LB固體培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)至少對(duì)-3他，使其活化；(2)將上述活化的種子轉(zhuǎn)接到LB液體種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期；d、發(fā)酵培養(yǎng)(1)配置發(fā)酵培養(yǎng)基每IL培養(yǎng)基加入谷氨酸鈉IO-IOOg；碳源IO-IOOg ；無(wú)機(jī)氮源 3-20g ；K2HPO4 · 3H20 0. l_2g ；MgSO4 · 7H20 0. l_2g ；檸檬酸鈉 2-10g ；MnSO4O. 01-0. 2g ；補(bǔ)充蒸餾水至IOOOmL,調(diào)節(jié)pH 6. 0-7. 5 ；(2)將上述發(fā)酵培養(yǎng)基投入搖瓶或發(fā)酵罐中，高壓蒸汽滅菌至少20min后，冷卻至 30-37°C，按1-5%的接種量接入種子液，培養(yǎng)Μ-4 !；e、提取將d中得到的菌株培養(yǎng)液離心除去菌體、收集上清液，并用乙醇或異丙醇沉淀、回收Y-PGA0
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，制備種子液步驟( 時(shí)培養(yǎng)8-1 至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，搖瓶培養(yǎng)時(shí)，按50-100mL/500mL三角瓶的裝液量投入發(fā)酵培養(yǎng)基。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)，按發(fā)酵罐容積的40-80%投入發(fā)酵培養(yǎng)基，攪拌速度為200-600rpm，通氣量為0. 5-2vvm。
7.如權(quán)利要求3-6之一所述的方法，其特征在于，在發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中進(jìn)行補(bǔ)料；補(bǔ)料方式優(yōu)選加入葡萄糖。
8.如權(quán)利要求3-7之一所述的方法，其特征在于，所述LB固體培養(yǎng)基含蛋白胨10g/L、 酵母浸出物5g/L、NaCl 10g/L、瓊脂18g/L，pH7. 0 ；LB液體種子培養(yǎng)基含蛋白胨10g/L、酵母浸出物 5g/L、NaCl 10g/L, ρΗ7· 0。
9.如權(quán)利要求3-8之一所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分還包括 NaNO3> CaCl2 · 2Η20 ；所述谷氨酸鈉的含量?jī)?yōu)選30-100g/L ；優(yōu)選地，無(wú)機(jī)氮源為硫酸銨、氯化銨或硝酸鈉中的一種或幾種；含量為5-20g/L ； 優(yōu)選地，碳源為葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、淀粉或淀粉水解液中的一種或幾種；含量為 30-100g/L。
10.如權(quán)利要求3-9之一所述的方法，其特征在于，各步驟所述的培養(yǎng)優(yōu)選在30-37°C條件下進(jìn)行；所述高壓蒸汽滅菌優(yōu)選在115°C下滅菌30min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于γ-PGA發(fā)酵生產(chǎn)的地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis P-104及其應(yīng)用，于2010年9月14日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO.4156。本發(fā)明的地衣芽孢桿菌P-104是從中國(guó)傳統(tǒng)豆醬制品中篩選分離得到，生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)效率高、生產(chǎn)成本低，利用本發(fā)明的菌株及其發(fā)酵方法，γ-聚谷氨酸的7L發(fā)酵罐產(chǎn)量達(dá)到32g/L，補(bǔ)料發(fā)酵產(chǎn)量可達(dá)到41.6g/L。本發(fā)明具有生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)效率高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/10GK102367431SQ20111035837
公開日2012年3月7日 申請(qǐng)日期2011年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月11日
發(fā)明者劉會(huì)洲, 張業(yè)偉, 羅明芳, 魏雪團(tuán) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院過程工程研究所