專利名稱：硫酸軟骨素酶b融合蛋白、其編碼基因以及其構(gòu)建方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程和發(fā)酵工程領域中一種硫酸軟骨素酶B融合蛋白及其編碼基因以及其構(gòu)建方法。此外本文還提供一種純化硫酸軟骨素酶B融合蛋白的方法。另外，本文還涉及一種生產(chǎn)低分子量硫酸軟骨素B的方法。
背景技術：
硫酸軟骨素裂解酶(chondroitinase或 chondroitin sulfaeyase,以下有時也簡稱為“ChSase”)是一類能將硫酸軟骨素、軟骨素、透明質(zhì)酸等糖胺聚糖降解為不飽和二糖(ADi及寡糖的裂解酶。近年來,ChSase作為一種研究機體蛋白聚糖的結(jié)構(gòu)與功能的工具以及作為一種新型藥用酶而日益受到人們的重視。硫酸軟骨素酶B(以下有時也簡稱為“ChSase B”)可特異性降解硫酸皮膚素及透明質(zhì)酸為AD1-Os及寡糖。因ChSase B僅特異性降解硫酸皮膚素(也稱為硫酸軟骨素B)及透明質(zhì)酸，所以對該酶的藥用價值的研究比較另一種硫酸軟骨素酶AC(以下有時也簡稱為“ChSase AC”)要少一些，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)ChSase B也有著不可忽視的應用價值:在基礎理論方面，利用ChSase B可特異性的降解硫酸軟骨素蛋白聚糖中硫酸軟骨素側(cè)鏈，許多科研人員通過對機體組織特定部位的硫酸軟骨素的降解，并通過該部位硫酸軟骨素降解前后功能的改變及降解產(chǎn)物的分析，來了解硫酸軟骨素的結(jié)果與功能(參見:Shibata S，MiduraRJ, Hascall UC.Structural analysis of the linkage region oligosaccharides andunsaturated disaccharides from chondroitin sulfate using Carbopac PA.J BiolChem，1992，267(10):6548-6555)。在臨床運用領域，近年來研究非?；钴S，研究表明，硫酸軟骨素糖胺聚糖與腫瘤細胞的侵入、轉(zhuǎn)移密切相關(參見:Henke CA, Roongta V,Mickelson DJ, et al.CD44_relatedchondroitin sulfat e proteoglycan,a cell surface receptor implicated with tumorcell invasion, mediates endothelial cell migration on fibrinogen and invasioninto a fibrin matrix.J Clin Invest,1996,97 (11):2541-2552)。2001 年Denholm EM等發(fā)現(xiàn)ChSase B能抑制黑色素瘤血管的形成及瘤細胞的轉(zhuǎn)移與增生等(參見=Denholm EM,Lin YQ,Silver PJ.Ant1-tumor activities of chondroitinase AC and chondroitinaseB:inhibition of angiogenesis, proliferation and invasion.Eur J Pharmacol,2001,416(3):213-221)。在制藥領域，硫酸軟骨素是一種具有較強的降血脂作用和緩沖抗凝血作用的物質(zhì)，臨床上主要用于防止冠心病和動脈粥樣硬化。目前，對低分子量硫酸軟骨素的制備常采用酸水解法、離子交換法和酶解法。前兩種方法需要較復雜的實驗設備并且會污染環(huán)境，比較而言，酶解法需要的條件不高且容易控制，因而具備較大的優(yōu)勢。酶解法的關鍵在于獲得大量的硫酸軟骨素裂解酶，其中包括ChSase B的獲得。硫酸軟骨素裂解酶分離純化非常復雜，通常需要經(jīng)過多步的色譜純化，收率很低。在分離純化硫酸軟骨素裂解酶中，ChSase B的異源重組表達是替代利用微生物生產(chǎn)ChSase B的可行的方案。然而對ChSase B的異源重組表達研究非常有限，到目前為止國內(nèi)還沒有這方面的報道。只有Pojasek等在E.coil中表達了 chsase基因，并分離純化到活性蛋白，在其研究中所用的載體為pET15b和PCRT7/NT，這兩個載體中的融合標簽均His-tag。但His-tag存在明顯的缺點，即跟親和載體的親和力不強,不能增加與之結(jié)合蛋白質(zhì)的可溶性，難以提高純化效果和蛋白質(zhì)可溶性比例等。Pojasek的論文中關于His-tag的純化效果和蛋白可溶性比例等內(nèi)容均未給出清晰的報道(參見Kevin Pojasek,ZacharyShriver, Patrick Kiley，Ganesh Venkataraman and Ram Sasisekharan.RecombinantExpression, Purification and Kinetic Characterization of Chondroitinase ACand Chondroitinase B from Flavobacterium hparinum.Biochemical and BiophysicalResearch Communications，2001，286:343-351)。目前，需要一種簡單、方便的方法，通過該方法可以得到具有硫酸軟骨素酶B活性的硫酸軟骨素酶B替代物，該替代物可以與硫酸軟骨素酶B相同地使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人意外地得到了硫酸軟骨素裂解酶替代物-硫酸軟骨素酶B融合蛋白，其具有硫酸軟骨素酶B的活性，能夠用于生產(chǎn)硫酸軟骨素，并且硫酸軟骨素的生成條件不高、方法簡便且容易控制。本文涉及以下內(nèi)容:(I).一種硫酸軟骨素酶B融合蛋白，其中融合有硫酸軟骨素酶B和麥芽糖結(jié)合蛋白。(2).根據(jù)(I)所述的硫酸軟骨素酶B融合蛋白，其中所述硫酸軟骨素酶B具有SEQID NO:1所示的氨基酸。(3).根據(jù)(I)或(2)所`述的硫酸軟骨素酶B融合蛋白，其中所述麥芽糖結(jié)合蛋白具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸(4).根據(jù)(I) (3)中任一項所述的硫酸軟骨素酶B融合蛋白，其中，所述麥芽糖結(jié)合蛋白通過肽段連接部分與所述硫酸軟骨素酶B連接。(5).根據(jù)(4)所述的硫酸軟骨素酶B融合蛋白，其中，所述連接部分具有SEQ IDNO: 3所示的序列。(6).根據(jù)(4)所述的硫酸軟骨素B融合蛋白，其中所述連接部分連接在SEQ IDNO:1的氨基酸的N端。(7).根據(jù)(I) (6)中任一項所述的硫酸軟骨素融合蛋白B，其中所述融合蛋白具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸。(8).一種硫酸軟骨素酶B的替代物，其是(I) (7)中任一項所述的硫酸軟骨素酶B融合蛋白。(9).一種編碼(I) (7)中任一項所述的融合蛋白的DNA。(10).—種具有序列表中SEQ ID NO:5所不的喊基序列的DNA。(11).一種重組載體，其包含(9)或(10)所述的DNA。(12).一種轉(zhuǎn)化體，其是將(11)所述的重組載體導入宿主細胞而得到的轉(zhuǎn)化體。(13).一種構(gòu)建(I) (7)中任一項所述的硫酸軟骨素酶B融合蛋白的方法，包括
(i).提供含麥芽糖結(jié)合蛋白的質(zhì)粒載體；和(ii).將硫酸軟骨素酶B的基因連接到上述質(zhì)粒載體上。(14).根據(jù)(13)的方法，其中所述硫酸軟骨素酶B的N端與通過肽段連接部分與
麥芽糖結(jié)合蛋白結(jié)合。(15).一種純化硫酸軟骨素酶B融合蛋白的方法，其包括:a.利用直鏈淀粉樹脂吸附含⑴ (7)中任一項所述的硫酸軟骨素酶B融合蛋白的粗產(chǎn)物，以及b.利用麥芽糖洗脫純化硫酸軟骨素酶B融合蛋白。(16).根據(jù)(15)所述的生產(chǎn)硫酸軟骨素酶B融合蛋白的方法，在所述a和b之前，該方法還包括:提供含麥芽糖結(jié)合蛋白的質(zhì)粒載體；將硫酸軟骨素酶B的基因連接到上述質(zhì)粒載體上提供重組載體；將重組載體導入宿主細胞而得到轉(zhuǎn)化體；以及利用培養(yǎng)基培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體并獲得所述含硫酸軟骨素酶B融合蛋白的粗產(chǎn)物。(17).硫酸軟骨素酶B融合蛋白的用途,用來代替硫酸軟骨素酶B。(18).一種 生產(chǎn)低分子量硫酸軟骨素B的方法，其包括:使用(I) (7)中任一項所述的硫酸軟骨素酶B融合蛋白降解硫酸軟骨素B原料來生產(chǎn)低分子量硫酸軟骨素B的方法，其中得到的低分子量硫酸軟骨素B的分子量為0.5kDa 25kDa。(19).根據(jù)(18)所述的生產(chǎn)硫酸軟骨素B的方法，其中，所述得到的硫酸軟骨素B的分子量為2 lOkDa。(20).一種硫酸軟骨素酶B融合蛋白的用途，用于低分子量生產(chǎn)硫酸軟骨素B (硫酸皮膚素)，其中，生產(chǎn)的低分子量硫酸軟骨素B(硫酸皮膚素)的分子量為0.5kDa 25kDa。(21).根據(jù)(20)所述的硫酸軟骨素酶B融合蛋白的用途，其中，生產(chǎn)的低分子量生產(chǎn)硫酸軟骨素B的分子量為2 lOkDa。


圖1為從肝素黃桿菌中PCR擴增得到的硫酸軟骨素酶B基因電泳圖譜。圖2為轉(zhuǎn)化子PCR驗證電泳圖譜。圖3為轉(zhuǎn)化子酶切驗證電泳圖譜。圖4為pMAL-ChSase B在7種不同的大腸桿菌(E.coli)宿主中的表達情況:A表示不同宿主的0D_、總蛋白質(zhì)濃度和酶活，B表示不同宿主的硫酸軟骨素酶B融合蛋白的比酶活。圖5為大腸桿菌TBl/pMAL-ChSase B工程菌株表達硫酸軟骨素酶B融合蛋白的SDS-PAGE圖譜以及為硫酸軟骨素酶B融合蛋白通過直鏈淀粉樹脂親和分離的SDS-PAGE電泳圖譜。圖6為E.coli TBl/pMAL-ChSase B的IPTG濃度優(yōu)化結(jié)果:A表示不同IPTG誘導濃度下的OD6c 、總蛋白質(zhì)濃度和酶活，B表示不同IPTG誘導濃度下硫酸軟骨素酶B融合蛋白的比酶活。
具體實施例方式以下，對本文的實施方式進行具體說明。硫酸軟骨素酶B融合蛋白本文涉及的硫酸軟骨素酶B融合蛋白(以下，有時也簡稱為“MBP-ChSaseB”)，其融合有硫酸軟骨素酶B和麥芽糖結(jié)合蛋白(以下，有時也簡稱為“MBP”)。本文涉及的硫酸軟骨素酶B可以任何硫酸軟骨素酶B。根據(jù)本文一個優(yōu)選的實施方案，硫酸軟骨素酶B是肝素黃桿菌(Flavobacterium heparinum)來源的硫酸軟骨素酶B。特別地，硫酸軟骨素酶B是去除了編碼信號肽堿基的肝素黃桿菌硫酸軟骨素酶B。根據(jù)本文一個優(yōu)選的實施方案，本文硫酸軟骨素酶B具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸。硫酸軟骨素酶B融合蛋白中，硫酸軟骨素酶B可以直接與麥芽糖結(jié)合蛋白融合，也可以通過連接部分與所述硫酸軟骨素酶連接。優(yōu)選通過肽段連接部分來連接。肽段連接部分是本領域技術人員可以確定的，該肽段連接部分的長度可以至少為I個氨基酸以上，優(yōu)選為3個氨基酸以上。對于構(gòu)成該肽段連接部分的氨基酸沒有特別限定，優(yōu)選，由甘氨酸、絲氨酸、或丙氨酸這樣中性的氨基酸重復構(gòu)成。根據(jù)本文一個優(yōu)選的實施方案，該肽段連接部分為SEQ ID NO:3所示的序列。本文涉 及的麥芽糖結(jié)合蛋白可以是任何本領域普通技術人員能夠得到的麥芽糖結(jié)合蛋白。優(yōu)選來自于大腸桿菌的麥芽糖結(jié)合蛋白。來自大腸桿菌的天然的MBP能夠與麥芽糖特異吸附，參與大腸桿菌對麥芽糖的轉(zhuǎn)運和利用。MBP不但能與直鏈淀粉結(jié)合，實現(xiàn)親和分離，也能與馬鈴薯淀粉實現(xiàn)親和分離，從而可以大大降低酶的分離純化成本，有利于實現(xiàn)工業(yè)化規(guī)模的分離純化。在一個更優(yōu)選的實施方案中，本文的麥芽糖結(jié)合蛋白具有SEQIDNO:2所示的氨基酸。優(yōu)選，本文的硫酸軟骨素酶B融合蛋白具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸。此外，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，得到的硫酸軟骨素酶B融合蛋白不需要將麥芽糖結(jié)合蛋白部分切除，具有硫酸軟骨素酶B的活性，可以直接用作硫酸軟骨素酶B的替代物。DNA本文還涉及一種編碼上述所有硫酸軟骨素酶B融合蛋白的DNA，其是該融合蛋白的編碼序列。用于本說明書的術語“編碼序列”的意思是直接指定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子例如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子例如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA或重組核苷酸序列。根據(jù)本文一個優(yōu)選的實施方案，DNA具有SEQ ID NO: 5所示的堿基序列。重鉬載體本文還涉及重組載體，其包含編碼上述硫酸軟骨素酶B融合蛋白DNA。本文涉及的重組載體包含編碼上述所有的融合蛋白的DNA序列、啟動子、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。本文中所述的DNA序列可以和其它調(diào)控序列結(jié)合在一起，產(chǎn)生重組載體，該載體可以包括一個或多個(數(shù)個)方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代編碼多肽的DNA序列。備選的，可以通過在適當?shù)挠糜诒磉_的載體中插入包含所述氨基酸序列的DNA序列來表達本文的DNA序列。在制備重組載體的過程中，將編碼序列導入載體中，從而將該編碼序列與適當?shù)谋磉_調(diào)控序列可操作地連接。啟動子、轉(zhuǎn)錄信號、翻譯終止信號以及其它調(diào)控序列是任何本領域普通技術人員能夠可以根據(jù)常規(guī)選擇而確定的。重組載體可以是任何載體(例如,質(zhì)?；虿《?，其能夠方便地進行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生核苷酸序列的表達。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復制載體，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復制的構(gòu)建?；蛘撸d體可以是一種當被引入宿主細胞中時，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復制的載體。此外，可以使用單獨的載體或質(zhì)?；騼蓚€或更多個載體或質(zhì)粒，其共同含有待引入宿主細胞基因組的完整DNA，或可以使用轉(zhuǎn)座子。根據(jù)本文一個優(yōu)選的實施方案，本文的重組載體是pMAL_c2x。優(yōu)選，該重組載體是通過以下步驟構(gòu)建:將SEQ ID NO:5所示的DNA片段插入質(zhì)粒pMAL_c2x的多克隆位點，得到重組載體。轉(zhuǎn)化體本文還涉及轉(zhuǎn)化體，其是將包含編碼上述硫酸軟骨素酶B融合蛋白DNA導入宿主細胞而得到的轉(zhuǎn)化體。本文涉及的轉(zhuǎn)化體可用`于蛋白質(zhì)的生產(chǎn),通過將包含本文DNA序列的載體導入宿主細胞而得到該轉(zhuǎn)化體，并在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體，可以用來生產(chǎn)所需要的目標蛋白質(zhì)。術語“宿主細胞”包括母體細胞的任何后代，其由于復制過程中發(fā)生的突變而不同于母體細胞。宿主細胞可以是在本文的多肽的重組產(chǎn)生中有用的任何細胞，例如，原核或真核細胞。原核宿主細胞可以是任何革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。革蘭氏陽性細菌包括但不限于，芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳酸菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌屬和海洋芽孢桿菌屬。革蘭氏陰性細菌包括但不限于，大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬和脲原體屬。細菌宿主細胞可以是任何芽孢桿菌屬細胞。在本文的實施中有用的芽孢桿菌屬細胞包括但不限于，嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細胞。細菌宿主細胞還可以是任何鏈球菌屬細胞。在本文的實施中有用的鏈球菌屬細胞包括但不限于，似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種細胞。細菌宿主細胞還可以是任何鏈霉菌屬細胞。在本文的實施中有用的鏈霉菌屬細胞包括但不限于，不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍鏈霉菌、灰色鏈霉菌和淺青紫鏈霉菌細胞。宿主細胞還可以是真核生物，如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞。在一個具體的方面，宿主細胞是真菌細胞。在一個具體的方面，真菌宿主細胞是酵母細胞。在另一個具體的方面，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。根據(jù)本文一個優(yōu)選的實施方案，細菌宿主細胞是大腸桿菌。根據(jù)進一步優(yōu)選的實施方案，細菌宿主細胞是大腸桿菌TBl。構(gòu)建硫酸軟骨素酶B融合蛋白的方法本文還涉及一種構(gòu)建硫酸軟骨素酶B融合蛋白的方法，包括(i).提供含麥芽糖結(jié)合蛋白的質(zhì)粒載體；和(ii).將硫酸軟骨素酶B的基因連接到上述載體上。本文的另一實施方式涉及構(gòu)建硫酸軟骨素酶B融合蛋白的方法，其中，該硫酸軟骨素酶B的N端通過肽段連接部分與麥芽糖結(jié)合蛋白結(jié)合。其中涉及的質(zhì)粒載體如上文所述。純化硫酸軟骨素酶B融合蛋白的方法本文還涉及純化硫酸軟骨素酶B融合蛋白的方法，其包括:a.利用直鏈淀粉樹脂吸附含硫酸軟骨素酶B融合蛋白的粗產(chǎn)物的步驟，以及b.利用麥芽糖洗脫純化硫酸軟骨素酶B融合蛋白的步驟。本文涉及的生產(chǎn)硫酸軟骨素酶B融合蛋白的方法，在所述a和b之前，該方法還包括:
提供含麥芽糖結(jié)合蛋白的質(zhì)粒載體；將硫酸軟骨素酶B的基因連接到上述質(zhì)粒載體上提供重組載體；將重組載體導入宿主細胞而得到轉(zhuǎn)化體；以及利用培養(yǎng)基培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體并獲得所述含硫酸軟骨素酶B融合蛋白的粗產(chǎn)物。其中，轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)可以使用包含碳源、氮源、無機鹽、各種維生素等的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基來進行，作為碳源，可以使用例如葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖等糖類，乙醇、甲醇等醇類，檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸等有機酸類，廢糖蜜等。作為氮源，可以單獨或混合使用例如氨氣、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、尿素等。此外，作為無機鹽，可以使用例如磷酸一氫鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂等。此外，培養(yǎng)基中可以添加蛋白胨、肉膏、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白氨基酸、生物素等各種維生素等營養(yǎng)素。此外，在培養(yǎng)中，可優(yōu)化培養(yǎng)基的氮源、碳源、無機離子，從而能夠進一步促進細菌的生長和融合蛋白的表達。培養(yǎng)通常在通氣攪拌、振蕩等需氧條件下進行。對培養(yǎng)溫度沒有特殊限制，只要是宿主微生物能夠生長繁育的溫度即可，此外，對培養(yǎng)過程中的PH也沒有特殊限制，只要是宿主微生物能夠生長繁育的PH即可。培養(yǎng)中的pH調(diào)整可以通過添加酸或堿來進行。根據(jù)本文一個優(yōu)選的實施方案，對上述的轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)是在誘導的條件下進行的培養(yǎng)，由此表達得到硫酸軟骨素酶B。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，上述誘導培養(yǎng)的條件是:0 ImM的IPTG。根據(jù)本文另一個優(yōu)選的實施方案，上述誘導培養(yǎng)的條件是:0.05mM的IPTG0在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，上述誘導培養(yǎng)條件是:10 42°C誘導培養(yǎng)15 28小時。在一個更優(yōu)選的方面，上述誘導培養(yǎng)條件是:15°C誘導培養(yǎng)23小時。根據(jù)本文一個優(yōu)選的實施方案，進行上述誘導培養(yǎng)的培養(yǎng)基的溶劑是水，溶質(zhì)是10g/L NaCl，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨和100 μ g/L氨芐青霉素。對于制備含硫酸軟骨素酶B融合蛋白的粗產(chǎn)物的方法，沒有特別地限制，可以使用各種的方法。通常，可以如下制備:利用上述的適當?shù)呐囵B(yǎng)基培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體，通過使用超聲波、壓榨、滲透壓沖擊等物理方法，或者利用了表面活性劑等化學方法，或者酶處理等破碎或可溶化，以及離心分離或過濾等操作，從而得到含硫酸軟骨素酶B融合蛋白的粗產(chǎn)物。根據(jù)本文一個優(yōu)選的實施方案，將上述培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)物菌體采用超聲波、壓榨、滲透壓沖擊等物理方法進行破碎而得到含有硫酸軟骨素酶B融合蛋白粗產(chǎn)物。根據(jù)本文一個優(yōu)選的實施方案，采用超聲破碎獲得含有硫酸軟骨素酶B融合蛋白粗產(chǎn)物。根據(jù)本文一個優(yōu)選的實施方案，采用滲透壓沖擊獲得含有硫酸軟骨素酶B融合蛋白粗產(chǎn)物。在一個更優(yōu)選的實施方案中，滲透壓沖擊是在含有20 40%蔗糖，30mMTris-HCl，ImM EDTA的緩沖液進行的。根據(jù)本文一個優(yōu)選的實施方案，是將上述含有硫酸軟骨素酶B融合蛋白的粗產(chǎn)物通過直鏈淀粉樹脂(amylose樹脂)實現(xiàn)一步親和分離。直鏈淀粉樹脂是任何本領域普通技術人員能夠可以根據(jù)常規(guī)選擇而確定的，可以使用可以商購的直鏈淀粉樹脂，例如MBPTrap HP(商品號:28-9187-78, GEHealthcare)。在一個優(yōu)選的實施方案中，通過直鏈淀粉樹脂的上清液的流速為0.5ml/min。在一個優(yōu)選的實施方案中，用于洗脫的麥芽糖的濃度為10mM。在一個優(yōu)選的實施方案中,用于洗脫的麥芽糖的流速為0.5ml/min。在一個優(yōu)選的實施方案中，該直鏈淀粉樹脂是經(jīng)過預平衡的。低分子暈硫酸軟骨素B的生產(chǎn)方法本文涉的生產(chǎn)低分子量硫酸軟骨素B (也稱為硫酸皮膚素)的方法，其包括:使用硫酸軟骨素酶B融合蛋白降解硫酸軟骨素B (硫酸皮膚素)原料、生產(chǎn)低分子量硫酸軟骨素B (硫酸皮膚素)的方法，其中得到的硫酸軟骨素的分子量為0.5kDa 25kDa，優(yōu)選為2kDa lOkDa。當將硫酸軟骨素的分子`量降低至2kDa IOkDa時，其藥效更為明顯，對防止動脈粥樣硬化、風濕性炎癥和傷口愈合有更好的療效。用于生產(chǎn)低分子量硫酸軟骨素的底物可以任意選擇，只要是能夠被硫酸軟骨素酶B降解的底物均可?？梢詾榱蛩崞つw素，硫酸皮膚素可以是動物來源的，例如魚類、牛、羊等來源的硫酸皮膚素。根據(jù)本文的一個優(yōu)選的技術方案，硫酸軟骨素為硫酸皮膚素。生產(chǎn)低分子量硫酸軟骨素的底物的濃度是本領域技術人員可以根據(jù)所添加的硫酸軟骨素酶B融合蛋白的濃度而適當確定的。硫酸軟骨素與硫酸軟骨素酶B融合蛋白反應的時間也可以根據(jù)目標的低分子量硫酸軟骨素的分子量來進行確定。實施例下面結(jié)合具體實施例對本文作進一步說明，但本文并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。所述引物合成及測序工作均由Invitrogen生物技術有限公司完成,所有的限制性內(nèi)切酶均購自New England Biolabs公司；Pfu酶及dNTP購自TaKaRa公司；所有感受態(tài)細胞(如:DH5 α、ΤΒ1和ToplO)購自北京全式金生物技術有限公司)；硫酸軟骨素酶B酶活測定底物硫酸皮膚素購自sigma公司，其它的化學藥品均為一般分析純試劑，購自國藥集團化學試劑有限公司。實施例1、硫酸軟骨素酶B融合蛋白MBP-ChSase B的表汰一、去除信號肽的肝素黃桿菌硫酸軟骨素酶B編碼序列的克隆表達載體pMAL-ChSase B的構(gòu)建的具體過程如下:
1、引物的設計及合成經(jīng)Genbank查詢得到肝素黃桿菌硫酸軟骨素酶B的DNA序列(Tkalec, A.L.,Fink, D., Blain, F., Zhang-Sun, G., Laliberte, M., Bennett, D.C., Gu, K., Zimmermann,J.J.and Su, H.1solation and expression in Escherichia coli of cslA and cslB,genes coding for the chondroitin sulfate-degrading enzymes chondroitinase ACand chondroitinase B, respectively, from Flavobacterium heparinum.Appl.Environ.Microbiol.2000,66 (I)，29-35)，再根據(jù)去除編碼信號肽堿基的肝素黃桿菌硫酸軟骨素酶B的DNA序列設計引物，并在引物序列中引入限制性內(nèi)切酶SacI和EcoRI的識別位點，所用的上下游引物分別為:上游引物Pl:5，-TATGAGCTCTCAGGTTGTTG CTTCAAATG-3’ (SEQID NO:6)(帶下劃線的堿基為SacI的酶切位點)，下游引物P2:5’ -CGCGAATTCTTACTAGTGCTCT TTATTTCTTT TAAT-3’ (SEQ ID NO:7)(帶下劃線的堿基為EcoRI的酶切位點)，擴增后，即分別引入SacI和EcoRI酶切位點。2、PCR擴增去除信號肽的肝素黃桿菌硫酸軟骨素酶B的編碼序列PCR擴增的反應體系為:50ng肝素黃桿菌基因組DNA模版，IOOpmol每種引物，IX擴增緩沖液(北京天為生物技術有限公司)，200 μ mol/L每種dNTP，I單位高保真Pfu酶；擴增程序為:94攝氏度預變性5分鐘，94攝氏度變性I分鐘，68、65.7,62.9,59.5,56.8和54攝氏度引物退火I分鐘，72攝氏度延伸3分鐘，30個循環(huán)后，72攝氏度延伸10分鐘結(jié)束反應。該PCR結(jié)果如圖1所示，表明擴增得到了 1.5kb的硫酸軟骨素酶B基因片段，測序表明，擴增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列I的第1114-2562位所示(命名為ChSase B)。圖1中，泳道1-6分別為退火溫度為68、65.7、62.9、59.5、56.8和54攝氏度擴增結(jié)果，泳道M 為分子量 marker (條帶大小依次為 10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1.5kb、lkb、800bp),箭頭所指處為1.5kb目標片段。

3、構(gòu)建含有目的片段的克隆載體參照試劑盒說明書進行操作，將步驟一中2中的PCR擴增的目的片段直接亞克隆入載體pMD -19T Simple (TaKaRa公司)中，得連接產(chǎn)物。4、轉(zhuǎn)化大腸桿菌及陽性克隆轉(zhuǎn)化子的篩選及測序?qū)⒉襟E3獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，具體方法為:將10 μ I的連接產(chǎn)物與100 μ I的大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞混勻，冰浴30分鐘，42攝氏度熱激90秒，冰浴10分鐘，然后加入800 μ I含100 μ g/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基(蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaCl 3g，水285mL)中，180rpm、37攝氏度振搖60分鐘，涂于含100 μ g/L氨芐青霉素的LB抗性培養(yǎng)平板(蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaCl 3g，瓊脂粉4.5g，水285mL, 16 μ I Χ-gal和4 μ I IPTG/平板)進行藍白斑篩選。37攝氏度培養(yǎng)12-20小時。挑選白斑并以此為模版，用引物Pl和P2進行菌落PCR鑒定，PCR反應體系及反應條件與步驟2相同。反應結(jié)束后，對擴增產(chǎn)物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可含轉(zhuǎn)化子的陽性克隆。將篩選得到的陽性克隆轉(zhuǎn)至5mL含0.05mg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37攝氏度、220rpm振搖12小時,將菌液交由Invitrogen生物技術有限公司進行測序,將含有具有序列表中SEQ ID NO:5的第1114-2562位核苷酸序列的硫酸軟骨素酶B蛋白編碼基因的pMD -19T Simple 重組載體命名為 pMD-19-ChSase B。
二、重組大腸桿菌表達載體的構(gòu)建以pMD-19-ChSase B質(zhì)粒為模版，用引物Pl和P2進行PCR擴增肝素黃桿菌硫酸軟骨素酶B的基因，PCR反應體系及反應條件與步驟一中2相同。將pMAL-c2x載體(購自美國New England Biolabs公司和PCR產(chǎn)物(以pMD-19-ChSase B質(zhì)粒為模版的擴增產(chǎn)物)分別用SacI和EcoRI雙酶切，用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)連接，轉(zhuǎn)化DH5 α，以Pl和Ρ2為引物，通過菌落PCR篩選轉(zhuǎn)化子(如圖2所示)，提取可得到1.5kb PCR產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化子中的pMAL-c2x重組載體，分別通過SacI和EcoRI雙酶切驗證(如圖3所示)。圖2中M為分子量 marker (條帶大小依次為 10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1.5kb、lkb、800bp、500bp)，泳道1、2、3為PCR驗證的轉(zhuǎn)化子，箭頭所指處為硫酸軟骨素酶B基因條帶。圖3中M為分子量 marker (條帶大小依次為 10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1.5kb、lkb、800bp、500bp、300bp)，泳道1、3、5、7為正確連接的重組質(zhì)粒pMAL-ChSase B，泳道2、4、5、8分別為重組質(zhì)粒pMAL-ChSase B被Sac I和EcoR I雙切后電泳圖，箭頭所指處為硫酸軟骨素酶B基因條帶。將通過Sac I和EcoR I雙酶切得到的1.5kb片段的質(zhì)粒進行測序，將含有具有序列表中序列I的第1114-2562位核苷酸序列的硫酸軟骨素酶B融合蛋白編碼基因的pMAL_c2x重組載體命名為pMAL-ChSase B。在pMAL-ChSase B中，ChSase B基因與IacZa基因之間有兩個連續(xù)的終止密碼TAGTAA，從而能夠有效地終止蛋白翻譯不會表達IacZ α蛋白。三、硫酸軟骨素酶B融合蛋白MBP-ChSase B的表達提取步驟二中含有pMAL-ChSase B的大腸桿菌DH5a中的質(zhì)粒，按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸菌 TBU ToplO、JM109、BL21、BL21 (DE3)和 BL21 (DE3) (plysS)。除 E.coli TBl感受態(tài)細胞制作按照《分子克隆實驗指南》中氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞的說明完成外，E.coli T0P10、E.coliDH5a、E.coli JM109、Ε.coli BL21、E.coli BL21(DE3)、E.coliBL21(DE3) (plysS)感受態(tài)細胞均購自北京全式金生物技術有限公司。經(jīng)過氨芐青霉素篩選和利用步驟一中步驟I提供的引物進行菌落PCR鑒定，得到含有pMAL-ChSase B的大腸桿菌 TBl、ToplO、JM109、BL21(DE3)和 BL21(DE3) (plysS)，即 TB Ι/pMAL-ChSaseB、 Top Ο/pMAL-ChSase B、 JM109/pMAL_ChSase B、 BL21/pMAL_ChSase B、BL21(DE3)/pMAL-ChSaseB、BL21(DE3) (plysS) /pMAL-ChSase B 和 DH5 a /pMAL-ChSase B 作為表達MBP-ChSase B的工程菌。以質(zhì)粒 pMAL-c2x 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 TBl、ToplO、JM109、BL21、BL21 (DE3)、BL21 (DE3)(plysS)和 DH5 α，得到空載體對照 TBl/pMAL_c2x、ToplO/pMAL_c2x、JM109/pMAL_c2x、BL21/pMAL-c2x、BL21 (DE3) /pMAL_c2x、BL21 (DE3) (plysS) /pMAL_c2x 和 DH5 a /pMAL_c2x。以下操作對上面的工程菌平行進行。將空載體對照和工程菌分別在含氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基(NaC110g/L，酵母提取物為5g/L，蛋白胨10g/L，含100 μ g/L氨芐青霉素)37攝氏度培養(yǎng)2.5小時后，加入終濃度為0.24mM IPTG 15攝氏度誘導25小時。lOOOOrpm，10分鐘離心收集菌體并用50mMTris-HCl (pH8.0)洗滌兩次，重懸至OD6tltl約為8.000附近。將上面OD6tltl約為8.000重懸液進行超聲破碎(輸出功率為300W，每次超聲3秒和間歇3秒的處理198次)，12000rpm，30分鐘離心，超聲破碎后離心所得的上清液即為粗產(chǎn)物。酶活力(單位為IU/L)的檢測采用232nm的光吸收法，IIU的酶活定義為30攝氏度每分鐘產(chǎn)生1 μ mol不飽和鍵的反應效力。取硫酸皮膚素底物溶液0.5ml (1g/L硫酸皮膚素，50mM Tris-HCl, pH8.0)，加入上步中所得的一定體積的粗產(chǎn)物，其他體積以50mM Tris-HCl, pH8.0緩沖液補充，最終的反應體積為1.51111，測單位時間內(nèi)在23211111的吸光度變化八432。消光系數(shù)ε = 3800Μ^ο比酶活(單位為IU/mg蛋白)的定義為酶活力與粗產(chǎn)物蛋白濃度(單位為mg/L)的比值。蛋白濃度監(jiān)測采用常規(guī)的Bradford法。宿主優(yōu)化的結(jié)果如圖4所示，空載體對照菌株TBl/pMAL_c2x、ToplO/pMAL-c2x、JM109/pMAL-c2x、BL21/pMAL_c2x、BL21 (DE3)/pMAL_c2x、BL21(DE3) (plysS) /pMAL-c2x 和DH5 a /pMAL-c2x誘導培養(yǎng)后無酶活，工程菌都表達出了有活性的可溶性MBP-ChSase B融合蛋白。并且經(jīng)過測序,表達出的融合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No:4所示；并且該融合蛋白MBP-ChSase B中的MBP的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；該融合蛋白中的ChSase B的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示?？梢园l(fā)現(xiàn),綜合比較酶活、蛋白表達水平和比酶活，E.coli TBl為最佳宿主。對最佳宿主E.coli TBl表達的蛋白進行SDS-PAGE電泳:取上述超聲破碎后離心所得的上清夜(粗產(chǎn)物)100 μ I做可溶蛋白組分SDS-PAGE電泳，取上述超聲破碎后離心所得的沉淀來做不可溶蛋白組分SDS-PAGE電 泳。結(jié)果如圖5所示，圖5中M為marker(由上至下分子量依次均為 230kDa、150kDa、100kDa、80kDa、60kDa、50kDa、40kDa、30kDa、25kDa)，1-4 分別為
E.coli TBl/pMAL-ChSase B的全細胞、不可溶蛋白、可溶蛋白、直鏈淀粉柱純化蛋白組分，箭頭所指處為融合蛋白MBP-ChSaseB (94.35kDa)。此外，嘗試將硫酸軟骨素酶B的C端與MBP融合，但未獲得融合蛋白。實施例2、通過對誘導劑IPTG濃度和對培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化來提高硫酸軟骨素酶B融合蛋白MBP-ChSase B的表達暈和酶活選用實施例1中的最優(yōu)表達宿主E.coli TBl/pMAL-ChSase B，通過對誘導劑IPTG濃度進行優(yōu)化，大幅度提高了硫酸軟骨素酶B融合蛋白MBP-ChSase B的表達量，提高了單位發(fā)酵液中的酶活。菌體培養(yǎng)、破碎、蛋白質(zhì)量測定及酶活測定同實施例1步驟三。得到的硫酸軟骨素B融合蛋白可以直接用來測定硫酸軟骨素酶B的活性，未切除麥芽糖結(jié)合蛋白部分。圖6示出了對誘導劑IPTG濃度進行優(yōu)化的結(jié)果。可以發(fā)現(xiàn)，誘導E.coliTBl/pMAL-ChSase B表達的最優(yōu)IPTG濃度為0.05mM。當誘導劑IPTG的濃度為0.05mM時酶活可以達到431.66IU/L發(fā)酵液(以硫酸軟骨素B為底物)，蛋白表達量可以達到321.49mg/L發(fā)酵液，比酶活可以達到1.34IU/mg蛋白。進一步，通過對培養(yǎng)基的氮源、碳源、無機離子進行優(yōu)化，可以進一步提高酶活，以硫酸軟骨素B為底物時酶活可以達到4100IU/L發(fā)酵液。實施例3、通過肓鏈淀粉柱純化硫酸軟骨素酶B融合蛋白MBP-ChSase B本發(fā)明利用的融合伴侶(fusion partner)麥芽糖結(jié)合蛋白MBP能夠與直鏈淀粉親和吸附實現(xiàn)一步分離。具體的親和分離步驟如下:將終濃度為0.24mM IPTG誘導表達23小時的菌體IOOmL, IOOOOrpm離心10分鐘；同時設未誘導表達的菌體對照。接著按以下兩個方案分別操作:方案一:用柱平衡液Column buffer (20mM Tris-HCl, 200mM NaCl, pH7.5)洗滌兩次，重懸在5mL Column buffer中，進行超聲破碎(輸出功率為300W，每次超聲3秒和間歇3秒的處理99次)。
方案二:滲透壓沖擊。將菌體重懸在IOOmL osmotic shock buffer I中(20-40%蔗糖，30mM Tris-HCl,lmM EDTA) 15分鐘，攪拌。IOOOOrpm離心10分鐘，然后重懸在等體積0.5mM硫酸鎂中，冰浴10-15分鐘，lOOOOrpm，離心10分鐘。離心后上清液以0.5ml/min通過2ml預平衡的直鏈淀粉親和分離柱，通過IOmM
0.5ml/min麥芽糖洗脫并收集。目標蛋白經(jīng)過直鏈淀粉(amylose)樹脂吸附后，用IOmM麥芽糖在I個柱體積下能夠?qū)⒛繕说鞍紫疵?。結(jié)果如圖4所示，表明經(jīng)過直鏈淀粉樹脂一步純化后目標蛋白可占90%以上。圖5中，M為marker (由上至下分子量依次均為230kDa、150kDa、100kDa、80kDa、60kDa、50kDa、40kDa、30kDa、25kDa)，1-4 分別為 E.coli BL21/pMAL-ChSase B 的全細胞、不可溶蛋白、可溶蛋白、直鏈淀粉柱純化蛋白組分，fir頭所指為目標蛋白94.35kDa。綜上，通過融合蛋白首次實現(xiàn)硫酸軟骨素酶B在大腸桿菌中70%以上有活性、正確折疊的可溶蛋白形式存在；實施例的結(jié)果說明利用麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)作為融合標簽，克服了 His-tag的確定，具有起始轉(zhuǎn)錄效率高、顯著提高酶重組表達的可溶性等優(yōu)點。本文還可通過親和分離實現(xiàn)了該融合蛋白的一步純化。與現(xiàn)有技術中使用的魚精蛋白沉淀(參見 ANA LYDIA TKALEC, DOMINIQUE FINK 等人 Isolation and Expressionin Escherichia coli of cslA and cslB, Genes Coding for the ChondroitinSulfate-Degrading Enzymes Chondroitinase AC and Chondroitinase B,Respectively,from Flavobacterium heparinum.APPL.ENVIRON.MICROBIOL.2000,66 (I):29-35)和一步柱純化法相比(參見表I)，可以大大縮短純化需要的時間，并且純化所用的設備明顯減少，降低了純化硫酸軟骨素酶的生產(chǎn)成本。利用直鏈淀粉樹脂的純化僅需要進行2個小時左右，即可獲得能夠用于工業(yè)生產(chǎn)的硫酸軟骨素酶B融合蛋白。純度達到可以應用的95%以上。

表I魚精蛋白 沉淀和一步柱純化法相比
權利要求
1.一種硫酸軟骨素酶B融合蛋白，其中融合有硫酸軟骨素酶B和麥芽糖結(jié)合蛋白。
2.根據(jù)權利要求1所述的硫酸軟骨素酶B融合蛋白，其中所述硫酸軟骨素酶B具有SEQID NO:1所示的氨基酸。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的硫酸軟骨素酶B融合蛋白，其中所述麥芽糖結(jié)合蛋白具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸
4.根據(jù)權利要求1 3中任一項所述的硫酸軟骨素酶B融合蛋白，其中，所述麥芽糖結(jié)合蛋白通過肽段連接部分與所述硫酸軟骨素酶B連接。
5.根據(jù)權利要求4所述的硫酸軟骨素酶B融合蛋白，其中，所述連接部分具有SEQIDNO:3所示的序列。
6.根據(jù)權利要求4所述的硫酸軟骨素B融合蛋白，其中所述連接部分連接在SEQIDNO:1的氨基酸的N端。
7.根據(jù)權利要求1 6中任一項所述的硫酸軟骨素融合蛋白B，其中所述融合蛋白具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸。
8.一種硫酸軟骨素酶B的替代物，其是權利要求1 7中任一項所述的硫酸軟骨素酶B融合蛋白。
9.一種純化硫酸軟骨素酶B融合蛋白的方法，其包括: a.利用直鏈淀粉樹脂吸附含權利要求1 7中任一項所述的硫酸軟骨素酶B融合蛋白的粗產(chǎn)物，以及 b.利用麥芽糖洗脫純化硫酸軟骨素酶B融合蛋白。
10.硫酸軟骨素酶B融合蛋白的用途,用來代替硫酸軟骨素酶B。
全文摘要
本文公開了一種硫酸軟骨素酶B融合蛋白、其編碼基因以及其構(gòu)建方法。本文提供的硫酸軟骨素酶B融合蛋白包括麥芽糖結(jié)合蛋白。此外本文還提供了一種純化硫酸軟骨素酶B融合蛋白的方法。另外，本文還涉及一種生產(chǎn)低分子量硫酸軟骨素B的方法。
文檔編號C12N5/10GK103103173SQ20111035813
公開日2013年5月15日 申請日期2011年11月11日 優(yōu)先權日2011年11月11日
發(fā)明者吳敬君, 李曄, 邢新會, 張翀 申請人:清華大學