專利名稱：一種抗菌脂肽的制備方法及其在獸醫(yī)藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗菌脂肽的制備方法及其在獸醫(yī)藥中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)某些細(xì)菌分泌的產(chǎn)物也具有抗菌活性，目前研究較多的主要有兩種(陽(yáng)離子抗菌肽和脂肽)。脂肽主要來源于一些由細(xì)菌、酵母菌、真菌分泌的代謝產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)上含親水的肽鍵和親油的脂肪烴鏈兩部分。其中肽鏈上的氨基酸能以內(nèi)酯或酰胺鍵形式與脂肪烴鏈的羧基、羥基或氨基結(jié)合形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。脂肽分子中脂肪鏈部分的碳原子數(shù)一般在12 19之間，肽鏈部分的氨基酸殘基數(shù)在6 13之間?？莶菅挎邨U菌在自然生長(zhǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)后期產(chǎn)生的脂肽類抗生素是其最重要的抗菌物質(zhì)。脂肽類抗生素包括伊枯草菌素(iturins)、泛革素(fengycins)和表面活性素(surfactin)，其中伊枯草菌素和泛革素具有很強(qiáng)的抗真菌活性，而表面活性素對(duì)病毒、腫瘤、支原體都有很高的抑制活性?？咕膶儆诳咕募易逯械囊环N，具有抗菌活性高、抗菌譜廣、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，對(duì)人、獸、畜無害等特性。其抗菌機(jī)理和一般抗生素有所不同，它是在微生物的細(xì)胞膜上形成孔洞而使細(xì)胞內(nèi)容物流出從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡或螯合一、二價(jià)陽(yáng)離子從而抑制了細(xì)菌代謝過程中多種酶類活性，不易產(chǎn)生耐藥性。此外，由于是肽類物質(zhì)在自然界中容易分解，極具潛力開發(fā)為一種新型、環(huán)境友好的生物藥物。迄今已有近千種天然抗菌肽被分離出來，但是天然抗菌肽的分離純化過程煩瑣且費(fèi)用較高，另外多數(shù)抗菌肽的活性較弱難以達(dá)到應(yīng)用的水平，有些抗菌肽還具有副作用。當(dāng)前制備抗菌脂肽的方法主要有生物材料提取法，化學(xué)合成法和基因工程表達(dá)等方法。天然抗菌脂肽在生物材料中含量低，分離也較煩瑣，采用這種方法獲得的樣品難以滿足應(yīng)用需求?；瘜W(xué)合成雖可以完成，但成本較高。因此，研發(fā)新型、廣譜、易于大量制備與純化而又有較高活性的抗菌脂肽將有利于降低成本，并為開發(fā)代替抗生素的抗菌藥物提供更大的發(fā)揮空間。本發(fā)明提供了一種抗菌脂肽的生物制備方法，產(chǎn)量高，生產(chǎn)成本低。所得抗菌脂肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有較好的抗菌活性，應(yīng)用于獸醫(yī)藥臨床實(shí)踐中，取得了良好的效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種抗菌脂肽的制備方法。本發(fā)明的另外一種目的是提供一種抗菌脂肽的純化方法。本發(fā)明方法制備的抗菌脂肽應(yīng)用于獸醫(yī)藥領(lǐng)域取得了良好的效果，提供了一種抗菌脂肽的新用途。本發(fā)明所述的抗菌脂肽制備方法為種子菌的培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)、抗菌脂肽的粗提、抗菌脂肽的純化、抗菌脂肽的鑒定與制備結(jié)果評(píng)價(jià)。
上述種子菌培養(yǎng)中的種子菌包括枯草芽孢桿菌(B. subtilis Al株，購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心)。其中，種子菌的制備方法為B. subtilisAl株菌種轉(zhuǎn)接至LB平板上，37°C培養(yǎng) 24h ；用接種環(huán)取活化菌種，接種于含有100ml LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，培養(yǎng)過夜作為種子菌。上述的發(fā)酵培養(yǎng)中的培養(yǎng)基包括NS-L-I培養(yǎng)基(葡萄糖20.0g，L-谷氨酸鈉 5. 0g, MgS040. 5g, KCl 0. 5g, KH2P04 lg, FeS04 0. 15mg, MnS04 5. Omg, CuS04 0. 16mg，蒸餾水 1000ml，pH 7. 0。)。其中，NS-L-I培養(yǎng)基可用其中葡萄糖含量調(diào)整，乳糖，L-谷氨酸鈉，微量元素等及培養(yǎng)基PH值進(jìn)行調(diào)整后的培養(yǎng)基取代。其中，發(fā)酵條件為種子菌接種量(1% 15%)，發(fā)酵溫度(20°C 37°C)，發(fā)酵時(shí)間(24 72h)，發(fā)酵轉(zhuǎn)速(50 300r/min)，發(fā)酵初始pH為pH 5. 0 9. 0。上述抗菌脂肽的粗提過程為取制備的發(fā)酵菌液在PH2.0 5.0條件下經(jīng) 7000rpm離心lOmin，去除菌體，取上清用6mol/L HCL分別調(diào)節(jié)所需pH，再以7000rpm離心 lOmin，收集沉淀。將沉淀在70°C的烘箱中下燥20h，即得抗菌脂肽粗提物。上述抗菌脂肽的純化過程采用酸-醇法，具體步驟為取未烘干的抗菌脂肽粗提物，加入醇類物質(zhì)后用NaOH調(diào)節(jié)pH至5. O 8. 0，再用醇類物質(zhì)抽提2次并將其抽提液合并，然后將其a^phadex LH-20層析柱，最后用離心濃縮儀濃縮至完全干燥，即得抗菌脂肽的純化物。上述抗菌脂肽的鑒定過程為取抗菌脂肽純化物溶解在少量醇類中，再取一定量的該抗菌脂肽溶液分多次點(diǎn)樣于硅膠板上，待點(diǎn)樣點(diǎn)風(fēng)干后，放入盛有展開劑的層析缸中飽和30min，展開劑的組成為氯仿甲醇水=65 25 4 (體積比)，然后，待展開劑到達(dá)距硅膠板上層邊緣2cm左右時(shí)取出，待有機(jī)溶劑充分揮發(fā)后，再采用含有0. 5%茚三酮的丙酮溶液噴霧顯色。上述抗菌脂肽的的制備結(jié)果評(píng)價(jià)方法為70°C的烘箱中干燥所得純化的抗菌脂肽，產(chǎn)量需大于6. 8g/L。上述提純的抗菌脂肽的抗菌效果評(píng)價(jià)方法如下選用如下表的10種動(dòng)物病原菌，將其培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，分別制備成菌懸液，活菌數(shù)大于106CFU/ml，備用。將素瓊脂固體培養(yǎng)基融化后倒入培養(yǎng)皿，待冷卻凝固后，等距平穩(wěn)地將3個(gè)已經(jīng)滅菌的牛津杯放在固體培養(yǎng)基平面上，再將分別培養(yǎng)細(xì)菌的LB半固體培養(yǎng)基融化，冷卻至40°C 50°C，移取Iml菌懸液到培養(yǎng)基中，混勻，然后用移液管移取8ml含菌培養(yǎng)基至素瓊脂平板上。待凝固后，拔出牛津杯，用移液槍取30 μ 1不同濃度的純抗菌脂肽加入牛津孔內(nèi)，以生理鹽水作對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)3次，最后細(xì)菌放置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24h。培養(yǎng)完成后，取出培養(yǎng)皿測(cè)量抑菌圈的直徑大小。純抗菌脂肽的抗菌譜
權(quán)利要求
1.一種抗菌脂肽的制備方法，其特征在于該方法包括種子菌的培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)、抗菌脂肽的粗提、抗菌脂肽的純化、抗菌脂肽的鑒定與制備結(jié)果評(píng)價(jià)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于上述種子菌培養(yǎng)中的種子菌包括枯草芽孢桿菌(B. subtilis Al株，購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于種子菌的制備方法為B.subtilis Al株菌種轉(zhuǎn)接至LB平板上，37°C培養(yǎng)24h ；用接種環(huán)取活化菌種，接種于含有100ml LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，培養(yǎng)過夜作為種子菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于上述的發(fā)酵培養(yǎng)中的培養(yǎng)基包括 NS-L-I 培養(yǎng)基(葡萄糖 20. 0g, L-谷氨酸鈉 5. 0g, MgS040. 5g，KCl 0. 5g，KH2P04 lg，F(xiàn)eS04 0. 15mg, MnS04 5. Omg, CuS04 0. 16mg，蒸餾水 1000ml，pH 7. 0。)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于=NS-L-I培養(yǎng)基可用葡萄糖含量調(diào)整， 乳糖，L-谷氨酸鈉，微量元素及培養(yǎng)基pH值進(jìn)行調(diào)整后的培養(yǎng)基取代。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于種子菌接種量是 15%，發(fā)酵溫度是20°C 37°C，發(fā)酵時(shí)間為M 72小時(shí)，發(fā)酵轉(zhuǎn)速為50 300轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵初始pH 為 pH 5. 0 9. 0。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于抗菌脂肽粗提物的制備過程是發(fā)酵菌液在pH2. 0 5. 0條件下經(jīng)7000rpm離心10分鐘，去除菌體，取上清用6mol/L HCL分別調(diào)節(jié)所需PH，再以7000rpm離心10分鐘，收集沉淀，將沉淀在70°C的烘箱中干燥20小時(shí)，即得。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于抗菌脂肽的純化過程采用酸-醇法， 具體步驟是取未烘干的抗菌脂肽粗提物，加入醇類物質(zhì)后用NaOH調(diào)節(jié)pH至5. 0 8. 0，再用醇類物質(zhì)抽提2次并將其抽提液合并，然后將其過kphadex LH-20層析柱，最后用離心濃縮儀濃縮至完全干燥，即得抗菌脂肽的純化物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于抗菌脂肽的鑒定方法為抗菌脂肽純化物溶解在少量醇類中，再取一定量的該抗菌脂肽溶液分多次點(diǎn)于硅膠板上，待點(diǎn)樣點(diǎn)風(fēng)干后，放入盛有展開劑的層析缸中飽和30分鐘，展劑的組成為氯仿甲醇水= 65 25 4(體積比)，然后，待展開劑到達(dá)距硅板上層邊緣2厘米時(shí)取出，待有機(jī)溶劑充分揮發(fā)后，再采用含有0.5%茚三酮丙酮溶液噴霧顯色。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所得純化的抗菌脂肽，量大于6.8 克/升。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于該制備方法獲得的抗菌肽可用于抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于該制備方法獲得的抗菌肽可用于對(duì)斷奶仔豬和白羽肉雞細(xì)菌病的治療作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗菌脂肽的制備方法及其在獸醫(yī)藥中的應(yīng)用，通過抗菌脂肽制備工藝的優(yōu)化，使抗菌脂肽產(chǎn)量較高，達(dá)到了6.8g/L。該制備方法獲得的抗菌脂肽具有廣譜抗菌作用，尤其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌(葡萄球菌和鏈球菌)效果更佳。將其應(yīng)用到獸醫(yī)臨床試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)其對(duì)豬病原菌(副嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、鏈球菌、多殺性巴氏桿菌、肺炎雙球菌等)和雞病原菌(沙門氏菌、大腸桿菌、巴氏桿菌等)均有良好的抗菌效果，具有無毒副作用，無耐藥性和抗菌譜廣的優(yōu)點(diǎn)，更無化學(xué)藥物類抗菌素殘留等食品安全問題，可成為新型抗生素替代品，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12R1/125GK102559816SQ20111036165
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月13日
發(fā)明者韓健寶 申請(qǐng)人:韓健寶