專利名稱：一種分離培養(yǎng)人腦膜瘤細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，具體涉及腦膜瘤細(xì)胞分離與培養(yǎng)的方法，尤其涉及一種從離體的人腦膜瘤組織分離和傳代培養(yǎng)腦膜瘤細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
據(jù)報(bào)道，腦膜瘤 為常見的顱內(nèi)腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤總數(shù)的20%，其中，女性發(fā)病率更高。研究顯示，腦膜瘤多數(shù)為良性，其病程長(zhǎng)，分布大致與蛛網(wǎng)膜粒的分布情況相似，通常以大腦半球矢狀竇旁為最多。手術(shù)切除是首選的臨床治療方法，治療實(shí)踐顯示，部分腦膜瘤切除之后5年復(fù)發(fā)率較高；而部分腫瘤因部位較深或鄰近重要腦部結(jié)構(gòu)，術(shù)中很難做到手術(shù)全切，其中不能切除的、部分切除、或術(shù)后復(fù)發(fā)的常以放射治療為主。目前臨床不能做手術(shù)的和放射治療的病人，其他治療選擇余地很小，已成為神經(jīng)外科醫(yī)師治療腦膜瘤的一大難題。腦膜瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)是研究其發(fā)病及藥物治療的基礎(chǔ)，但原代及傳代培養(yǎng)人腦膜瘤細(xì)胞要比其它腫瘤細(xì)胞困難得多，迄今尚未建立起穩(wěn)定高效的腦膜瘤培養(yǎng)方法。然而，腦膜瘤的臨床前研究依賴于體外細(xì)胞模型和體內(nèi)腫瘤模型的建立，體內(nèi)模型的建立又依賴于高效率的體外細(xì)胞模型的建立，因此建立高效的腦膜瘤體外細(xì)胞模型成為研究腦膜瘤的必要手段。據(jù)研究報(bào)道，腦膜瘤組織細(xì)胞在體外很難長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者所進(jìn)行的腦膜瘤細(xì)胞的研究大都以原代細(xì)胞為主。國(guó)外有研究建立了幾株腦膜瘤細(xì)胞株，但其中除了惡性者外，大都進(jìn)行了基因干預(yù)才達(dá)到永生化，這樣勢(shì)必改變腫瘤細(xì)胞原有的特性，故而在這種細(xì)胞上研究所獲得的結(jié)論不能準(zhǔn)確反應(yīng)體內(nèi)的信息。因此建立高效的腦膜瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)體系，對(duì)研究其發(fā)病機(jī)制及開發(fā)新的藥物治療方法具有重要意義。目前，導(dǎo)致難以大量獲得腦膜瘤原代細(xì)胞和傳代培養(yǎng)細(xì)胞的因素有以下幾方面:
(I)腦膜瘤組織細(xì)胞間質(zhì)包括基質(zhì)/纖維多，采用機(jī)械分離或單一酶的方法難以消化腦膜瘤組織，硬性機(jī)械分離或酶長(zhǎng)時(shí)間消化，導(dǎo)致細(xì)胞破碎，因此自組織中不能獲得大量活細(xì)胞；(2)由于腦膜瘤大多數(shù)為良性，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，不能爬行到離組織塊較遠(yuǎn)的無細(xì)胞區(qū)生長(zhǎng)，只能在組織塊周邊爬出生長(zhǎng)。所以細(xì)胞很難長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底；(3)由于細(xì)胞生長(zhǎng)速度較慢，單層細(xì)胞貼壁培養(yǎng)時(shí)，以常規(guī)細(xì)胞接種密度接種傳代培養(yǎng)，難以長(zhǎng)期傳代下去；(4)未建立一種適合腦膜瘤細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)，能促進(jìn)腦膜瘤細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)因子或激素尚不清楚。本發(fā)明針對(duì)上述問題，建立了一套高效分離和傳代培養(yǎng)人腦膜瘤的方法，獲得了大量腦膜瘤細(xì)胞，經(jīng)腦膜瘤特征性標(biāo)志物波形蛋白(Vimentin)、上皮膜抗原(EMA)表達(dá)鑒定，證明所獲得的細(xì)胞均為腦膜瘤細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的 是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一種腦膜瘤細(xì)胞分離與培養(yǎng)的方法，尤其是一種從人腦膜瘤組織高效分離培養(yǎng)腦膜瘤原代細(xì)胞的方法。本發(fā)明進(jìn)一步目的是提供一種穩(wěn)定傳代培養(yǎng)腦膜瘤細(xì)胞的方法。
本發(fā)明提供了腦膜瘤細(xì)胞原代大規(guī)模培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)的方法，采用雞尾酒式組合酶將人腦膜瘤組織經(jīng)分步消化法，獲得腦膜瘤細(xì)胞懸液，然后在特定的培養(yǎng)液中低氧培養(yǎng)，獲得大量的原代腦膜瘤細(xì)胞；這些原代腦膜瘤細(xì)胞能在特定培養(yǎng)液及低氧條件下，懸浮培養(yǎng)至15代以上。本發(fā)明中，所述的組合酶包括中性蛋白酶(dispase)、膠原酶(collagenase)、DNA酶(DNase)，所述的組合酶以雞尾酒式配方組成酶消化液；本發(fā)明中，所述的人腦膜瘤組織源于離體的病人腦膜瘤組織；本發(fā)明中，所述的分步消化法包括四步消化，每步消化后獨(dú)立收集消化的懸液進(jìn)行離心收集細(xì)胞；本發(fā)明中，所述的特定培養(yǎng)液包括下述組分:DMEM-F12，按1: 50添加B27補(bǔ)劑，20ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)，20ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，10ng/ml白血病抑制因子(LIF)、5 μ g/ml 肝素(Heparin), 20nM 孕麗(Progesterone), IOOmM 雄稀二麗(Androstenedione)，50U/ml 青霉素-鏈霉素(penici 11 in-streptomycin)。本發(fā)明中，培養(yǎng)過程是采用1-5% O2, 5% CO2的低氧二氧化碳培養(yǎng)系統(tǒng)。具體而言，本發(fā)明的一種分離培養(yǎng)人腦膜瘤細(xì)胞的方法，其特征在于，其包括步驟:(I)人腦膜瘤原代細(xì)胞的分離:采用三種酶成分(dispase、collagenase、DNase)組成的雞尾酒式酶消化液結(jié)合機(jī)械吹打，分步消化腦膜瘤組織以收集腦膜瘤細(xì)胞；(2)人腦膜瘤原代細(xì)胞的接種培養(yǎng):配制特定的腦膜瘤細(xì)胞培養(yǎng)液以5X IO5個(gè)/ml接種進(jìn)行原代細(xì)胞懸浮培養(yǎng)；

所述的特定的腦膜瘤細(xì)胞培養(yǎng)液含:DMEM-F12，添加B27 (I: 50)，20ng/mlbFGF,20ng/ml EGF,10ng/ml LIF>5 μ g/ml Heparin,20nM Progesterone ,IOOmMAndrostenedione ；(3)人腦膜瘤原代細(xì)胞的條件性培養(yǎng):當(dāng)培養(yǎng)液變黃，更換新鮮培養(yǎng)液時(shí)，每次更換一半新鮮培養(yǎng)液，以對(duì)腦膜瘤細(xì)胞實(shí)施條件性培養(yǎng)，該一半新鮮培養(yǎng)液與一半舊的培養(yǎng)液組成的配方稱為條件性培養(yǎng)液；培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2,1-5% O2 ；(4):人腦膜瘤細(xì)胞的傳代培養(yǎng)a.人腦膜瘤細(xì)胞的懸浮傳代培養(yǎng):當(dāng)細(xì)胞球直徑大于200 μ m時(shí)，用TrypLE Express ( 一種改良胰酶)消化為單細(xì)胞后1: 2傳代，培養(yǎng)液為條件性培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為 37°C，5% CO2,1-5% O2 ；b.人腦膜瘤細(xì)胞的貼壁傳代培養(yǎng):當(dāng)細(xì)胞球直徑大于200 μ m時(shí)，用TrypLE Express消化為單細(xì)胞后1: 2傳代，培養(yǎng)液為條件性培養(yǎng)液添加10% FBS，培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2,1-5% O2 ;細(xì)胞消化傳代采用0.05%的Trypsin (胰酶)，消化后以1: 2傳代接種。(5):人腦膜瘤細(xì)胞的鑒定對(duì)腦膜瘤細(xì)胞進(jìn)行體外特征鑒定，包括vimentin、EMA> nestin(巢蛋白)、β -tublin(微管蛋白)、GFAP(神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白)、⑶31、⑶34、⑶45免疫熒光染色等指標(biāo)檢測(cè)；(6):人腦膜瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇
采用10% DMS0+90% FBS凍存人腦膜瘤細(xì)胞，采用常規(guī)復(fù)蘇方法復(fù)蘇腦膜瘤細(xì)胞。本發(fā)明所提供的雞尾酒式組合酶及分步消化法有利于保存細(xì)胞活力，使消化所得的細(xì)胞基本為活細(xì)胞，為腦膜瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)提供了細(xì)胞來源。該方法提供的雞尾酒式組合酶、酶分步消化法、特定培養(yǎng)液體系及低氧培養(yǎng)系統(tǒng)有利于腦膜瘤細(xì)胞的分離及增殖，為進(jìn)一步開展腦膜瘤機(jī)制及藥物篩選研究提供了細(xì)胞來源。本發(fā)明的方法具有如下優(yōu)點(diǎn)，1、有助于獲取到大量可用于基礎(chǔ)研究的腦膜瘤細(xì)胞。在本發(fā)明中，采用數(shù)種酶的雞尾酒式配方消化液，有助于消化細(xì)胞間質(zhì)及纖維；四步消化法有利于保存細(xì)胞活力，使消化所得的細(xì)胞基本為活細(xì)胞，為腦膜瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)提供了細(xì)胞來源。2、提供了一種能促進(jìn)人腦膜瘤細(xì)胞體外增殖的培養(yǎng)液。有證據(jù)表明約60% -90%的腦膜瘤表達(dá)孕酮受體，60%的腦膜瘤表達(dá)雄激素受體。為了促進(jìn)腦膜瘤細(xì)胞的增殖，本發(fā)明所采用的培養(yǎng)液為 DMEM-F12，添加 B27 (I: 50)，20ng/mlbFGF, 20ng/ml EGF, 10ng/mlLIF>5 μ g/ml heparin, 50U/ml penicillin-streptomycin,以及 20nM Progesterone, IOOmMAndrostenedione 兩種激素。3、本發(fā)明還提供了一種相對(duì)高效的腦膜瘤體外培養(yǎng)系統(tǒng)，培養(yǎng)條件為37°C，5%CO2,1-5% O20
4、本發(fā)明還檢測(cè)了人腦膜瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征和功能，為所述腦膜瘤發(fā)病機(jī)制的研究和藥物篩選應(yīng)用提供了可靠的數(shù)據(jù)，采用本發(fā)明獲得的人腦膜瘤細(xì)胞不需經(jīng)過基因干預(yù)即能傳代培養(yǎng)至15代以上，為開展腦膜瘤發(fā)病機(jī)制提供了大量的細(xì)胞來源。


圖1.顯示了自腦膜瘤組織消化后接種的單細(xì)胞懸液，其中仍含有未完全消化的組織塊。圖2.顯示了原代長(zhǎng)成的細(xì)胞球。圖3.顯示了原代細(xì)胞球消化傳代后長(zhǎng)成的細(xì)胞球。圖4.顯示了原代細(xì)胞球消化傳代后呈單層培養(yǎng)的細(xì)胞。圖5.普通熒光顯微鏡顯示視野中的細(xì)胞均表達(dá)腦膜瘤細(xì)胞標(biāo)志物vimentin。圖6.共聚焦顯微鏡顯示細(xì)胞表達(dá)腦膜瘤細(xì)胞標(biāo)志物vimentin。圖7.共聚焦顯微鏡顯示了腦膜瘤細(xì)胞標(biāo)志物vimentin與EMA共標(biāo)記突光鑒定結(jié)果O圖8.共聚焦顯微鏡顯示了腦膜瘤細(xì)胞標(biāo)志物vimentin與VEGF共標(biāo)記突光鑒定結(jié)果。圖9.顯示了腦膜瘤細(xì)胞標(biāo)志物western-blot鑒定結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1I材料與方法:
1.1試劑均為細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)試劑，除另有說明外均為GIBCO產(chǎn)品。1.2材料來自復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院神經(jīng)外科腦膜瘤患者手術(shù)切除的離體的腦膜瘤組織,共6例。1.3 方法(I)人腦膜瘤原代細(xì)胞的分離:a.無菌收集離體人腦膜瘤組織，將手術(shù)切除的腦膜瘤組織在冰預(yù)冷的HBSS中洗滌5次以上。b.用剪刀剪碎組織，將組織在含Dispase/Collegnase和0.04%的DNase的PBS中于37°C孵育30分鐘，巴斯德吸管吹吸十次以上，然后垂直靜止離心管5分鐘，收集上層消化懸液，離心收集消化下來的細(xì)胞；c.添加適量酶于下層未消化完全的組織，放入培養(yǎng)箱消化15分鐘，巴斯德吸管吹吸十次以上，然后垂直靜止離心管5分鐘，收集上層消化懸液，離心收集消化下來的細(xì)胞；d.重復(fù)步驟c兩次(2)人腦膜瘤原代細(xì)胞的接種培養(yǎng):以5X IO5個(gè)/ml接種在培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液為DMEM-F12，添加 B27(l: 50)，20ng/ml bFGF, 20ng/ml EGF, 10ng/ml LIF,5y g/ml Heparin,20nM Progesterone, IOOmM Androstenedione。培養(yǎng)條件為 371,5% CO2, 3% 02。(3)人腦膜瘤原代細(xì)胞的條件性培養(yǎng):當(dāng)培養(yǎng)液變黃，更換新鮮培養(yǎng)液時(shí)，每次更換一半新鮮培養(yǎng)液，以對(duì)腦膜瘤細(xì)胞實(shí)施條件性培養(yǎng)，該一半新鮮培養(yǎng)液與一半老的培養(yǎng)液組成的配方稱為條件性培養(yǎng)液。培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2, 3% 02。
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(4):人腦膜瘤細(xì)胞的傳代培養(yǎng)對(duì)所有離體人腦膜瘤組織的腦膜瘤細(xì)胞實(shí)施兩種傳代培養(yǎng)方式:a.人腦膜瘤細(xì)胞的條件性懸浮傳代培養(yǎng):當(dāng)細(xì)胞球直徑大于200μπι時(shí)，用TrypLE Express消化為單細(xì)胞后1: 2傳代。培養(yǎng)液為條件性培養(yǎng)液。培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2, 3% O20b.人腦膜瘤細(xì)胞的貼壁傳代培養(yǎng):當(dāng)細(xì)胞球直徑大于200 μ m時(shí)，用TrypLETMEXpreSS消化為單細(xì)胞后1: 2傳代。培養(yǎng)液為條件性培養(yǎng)液添加10% FBS。培養(yǎng)條件為37°C，5% C02，3% 02。待細(xì)胞完全長(zhǎng)滿后，0.05%的Trypsin消化后以1: 2傳代接種。(5):人腦膜瘤細(xì)胞的鑒定a.細(xì)胞免疫突光鑒定腦膜瘤標(biāo)志物表達(dá):檢測(cè)的標(biāo)記物包括vimentin、EMA、nestin、β _tublin、GFAP、CD31、CD34、CD45免疫熒光染色等指標(biāo)檢測(cè)。細(xì)胞經(jīng)PBS清洗，室溫下4%多聚甲醛中固定10分鐘。于含0.2% Triton X-100的PBS中室溫下孵育5分鐘后，經(jīng)PBS清洗兩次，細(xì)胞于含4% BSA、10% FBS的PBS中室溫下封閉60分鐘。所用的一抗、二抗均以含4% BSAUO % FBS的PBS稀釋。一抗孵育過夜，經(jīng)PBS洗滌三次后，加入相應(yīng)的二抗于室溫孵育3小時(shí)，PBS洗滌三次。用含DAPI的抗熒光淬滅劑復(fù)染后，封片觀察。b.western-blot鑒定腦膜瘤標(biāo)志物表達(dá):檢測(cè)的蛋白包括vimentin、EMA>nestin、β-tublin、GFAP、⑶31、⑶34、⑶45免疫熒光染色等指標(biāo)檢測(cè)。離心收集細(xì)胞后，用蛋白裂解液裂解細(xì)胞，蛋白定量后，上樣電泳、轉(zhuǎn)膜。然后經(jīng)一抗、二抗依次孵育標(biāo)記，化學(xué)發(fā)光，顯影，定影，觀察拍照。
(6):人腦膜瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇500g離心收集細(xì)胞，吸去上清，加入細(xì)胞凍存液(10% DMS0+90% FBS)，分裝于細(xì)胞凍存管，每管500μ 1，放入凍存盒于-80°c冰箱中過夜。第二天轉(zhuǎn)移入液氮中長(zhǎng)期保存。將細(xì)胞在37°C水浴中解凍，然后300g離心去除冷凍液，加入人腦膜瘤細(xì)胞培養(yǎng)液，放入37°C，5% CO2, 3% O2進(jìn)行培養(yǎng)。2.結(jié)果顯示2.1.細(xì)胞分離與傳代培養(yǎng)概況采用三種酶的雞尾酒式配方消化液消化腦膜瘤組織，結(jié)合機(jī)械吹打的方法，自每位患者的腦膜瘤組織均獲得了大量的單細(xì)胞(如圖1所示)。這些細(xì)胞在特定的培養(yǎng)液(DMEM-F12，添加 B27(l: 50)，20ng/ml bFGF, 20ng/ml EGF，10ng/mlLIF、5 μ g/ml heparin,50U/ml penicillin-streptomycin,20nM Progesterone,IOOmMAndrostenedione0 )中，37°C,5% CO2, 3% O2低氧培養(yǎng)系統(tǒng)中能形成細(xì)胞球生長(zhǎng)。細(xì)胞球消化后可繼續(xù)呈細(xì)胞球或單層細(xì)胞生長(zhǎng)(如圖2、3所示)，但細(xì)胞增殖較慢，一般需8-9天可傳代一次；本發(fā)明中的條件性特定培養(yǎng)液能促進(jìn)腦膜瘤細(xì)胞呈細(xì)胞球或單層細(xì)胞增殖，傳代達(dá)15代以上。細(xì)胞在10% DMS0,90% FBS中凍存后，可復(fù)蘇繼續(xù)培養(yǎng)增殖。2.2.免疫熒光鑒定腦膜瘤細(xì)胞標(biāo)志物

免疫熒光分析結(jié)果顯示6位患者的離體腦膜瘤組織培養(yǎng)的腦膜瘤細(xì)胞均表達(dá)vimentin,圖5顯示在普通突光顯微鏡下(低倍)，視野中的細(xì)胞均表達(dá)vimentin,證明所獲得的細(xì)胞均為腦膜瘤細(xì)胞；熒光共聚焦顯微鏡進(jìn)一步顯示vimentin的表達(dá)特征(呈絲狀微觀分布，如圖6所示)、以及其與EMA的共表達(dá)(如圖7所示)；鑒定結(jié)果還發(fā)現(xiàn)腦膜瘤細(xì)胞表達(dá)VEGF(如圖8所示)，提示腦膜瘤細(xì)胞具備潛在的血管生成能力；鑒定結(jié)果顯示所獲得的細(xì)胞均不表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)志物nestin、β -tubI in,GFAP,以及⑶31、⑶34、⑶45等膜抗原；所有結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明獲得的細(xì)胞為腦膜瘤組織來源的腦膜瘤細(xì)胞。2.3.western-blot鑒定腦膜瘤細(xì)胞蛋白表達(dá)western-blot結(jié)果顯示6位患者的離體腦膜瘤組織培養(yǎng)的腦膜瘤細(xì)胞均表達(dá)vimentin、EMA，VEGF(如圖 8 所示)，不表達(dá) nestin、β _tublin、GFAP、CD31、CD34、CD45，結(jié)果證明獲得的細(xì)胞均為腦膜瘤細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.一種分離培養(yǎng)人腦膜瘤細(xì)胞的方法，其特征在于，采用雞尾酒式組合酶將離體的人腦膜瘤組織進(jìn)行分步消化，獲得腦膜瘤細(xì)胞懸液，在特定的培養(yǎng)液中低氧培養(yǎng)，獲得原代腦膜瘤細(xì)胞；獲得原代腦膜瘤細(xì)胞在特定的培養(yǎng)液及低氧條件下，懸浮培養(yǎng)至15代以上。
2.按權(quán)利要求書I所述的方法，其特征在于，該方法包括步驟: (1)分離人腦膜瘤原代細(xì)胞:采用組合酶組成的雞尾酒式酶消化液結(jié)合機(jī)械吹打，分步消化離體的腦膜瘤組織以收集腦膜瘤細(xì)胞； (2)接種培養(yǎng)人腦膜瘤原代細(xì)胞:配制腦膜瘤細(xì)胞特定培養(yǎng)液以5X IO5個(gè)/ml接種進(jìn)行原代細(xì)胞懸浮培養(yǎng)， (3)條件性培養(yǎng)人腦膜瘤原代細(xì)胞:當(dāng)培養(yǎng)液變黃，更換一半新鮮培養(yǎng)液，該一半新鮮培養(yǎng)液與另一半舊的培養(yǎng)液組成條件性培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2,1-5% O2 ； (4):傳代培養(yǎng)人腦膜瘤細(xì)胞 a.人腦膜瘤細(xì)胞的懸浮傳代培養(yǎng):當(dāng)細(xì)胞球直徑大于200μ m時(shí),用TrypLE Express改良胰酶消化為單細(xì)胞后1: 2傳代，培養(yǎng)液為條件性培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為37°C，5% C02，1-5% O2 ； b.人腦膜瘤細(xì)胞的貼壁傳代培養(yǎng):當(dāng)細(xì)胞球直徑大于200μ m時(shí),用TrypLE Express消化為單細(xì)胞后1: 2傳代，培養(yǎng)液為條件性培養(yǎng)液添加10% FBS，培養(yǎng)條件為37°C，5%CO2,1-5% O2 ;細(xì)胞消化傳代采用0.05%的胰酶(Trypsin)，消化后以1: 2傳代接種。
(5):人腦膜瘤細(xì)胞的鑒定 采用vimentin、EMA、巢蛋白(nestin)、微管蛋白(β-tublin)、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、⑶31、⑶34和⑶45指標(biāo)檢測(cè)腦膜瘤細(xì)胞體外特征。`
3.按權(quán)利要求書I或2所述的方法，其特征在于，所述的組合酶包括中性蛋白酶、膠原酶和DNA酶。
4.按權(quán)利要求書I或2所述的方法，其特征在于，所述的分步消化包括四步消化，每步消化后獨(dú)立收集消化的懸液進(jìn)行離心收集細(xì)胞。
5.按權(quán)利要求書I或2所述的方法，其特征在于，所述的特定培養(yǎng)液包括下述組分:DMEM-Fl2,按I: 50添力口 B27補(bǔ)劑，20ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)，20ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(EGF), 10ng/ml白血病抑制因子(LIF)、5 μ g/ml肝素(Heparin), 20nM孕酮(Progesterone), IOOmM 雄烯二酮(Androstenedione), 50U/ml 青霉素-鏈霉素(penici11 in-streptomycin)。
6.按權(quán)利要求書I或2所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)過程中采用1-5%O2, 5%CO2的低氧二氧化碳培養(yǎng)系統(tǒng)。
7.按權(quán)利要求書2所述的方法，其特征在于，所述的懸浮培養(yǎng)是指細(xì)胞在特定培養(yǎng)液及低氧系統(tǒng)中呈細(xì)胞球生長(zhǎng)。
8.按權(quán)利要求書2所述的方法，其特征在于，所述的貼壁培養(yǎng)是指細(xì)胞在特定培養(yǎng)液添加10%血清及低氧系統(tǒng)中呈單層細(xì)胞貼壁培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及腦膜瘤細(xì)胞分離與培養(yǎng)的方法，尤其涉及一種從離體的人腦膜瘤組織分離和傳代培養(yǎng)腦膜瘤細(xì)胞的方法。本發(fā)明方法采用雞尾酒式組合酶將離體的人腦膜瘤組織進(jìn)行分步消化，獲得腦膜瘤細(xì)胞懸液，在特定的培養(yǎng)液中低氧培養(yǎng)，獲得原代腦膜瘤細(xì)胞；獲得的原代腦膜瘤細(xì)胞在特定的培養(yǎng)液及低氧條件下，懸浮培養(yǎng)至15代以上。本發(fā)明的雞尾酒式組合酶及分步消化法有利于保存細(xì)胞活力，使消化所得的細(xì)胞基本為活細(xì)胞，為腦膜瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)提供了細(xì)胞來源。該方法有利于腦膜瘤細(xì)胞的分離及增殖，為進(jìn)一步開展腦膜瘤機(jī)制及藥物篩選研究提供了細(xì)胞來源。
文檔編號(hào)C12N5/09GK103103162SQ20111036212
公開日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2011年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月15日
發(fā)明者宮曄, 沙紅英, 湯海亮, 謝清, 鄭名哲, 汪戴軍, 陳銜城, 毛穎, 周良輔 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院