專利名稱：一種海藻糖載入紅細(xì)胞內(nèi)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種海藻糖載入紅細(xì)胞內(nèi)的方法，特別是用電脈沖滲 透將海藻糖載入紅細(xì)胞內(nèi)的方法。
背景技術(shù)：
海藻糖是一種優(yōu)良的凍干保護(hù)劑，當(dāng)適當(dāng)提高細(xì)胞內(nèi)海藻糖濃度 時(shí)，可以提高細(xì)胞凍干后的存活率，因此人們希望提高細(xì)胞內(nèi)海藻糖 的濃度。但由于細(xì)胞膜是一種非滲透性膜，對(duì)于海藻糖這種非滲透性 的物質(zhì)很難進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，即使能夠用一般的方法載入，效果也不是 太理想。目前常用的方法主要有
1 、利用內(nèi)吞作用(endocytosis)分別將海藻糖弓I入人間葉干細(xì)胞 (MSCs， mesenchymal stem cells)禾口血小板中。此方法載入量較少。
2、 利用轉(zhuǎn)基因的葡萄狀球菌a-溶血素，它是一種可打孔的蛋 白質(zhì)，通過(guò)它產(chǎn)生橫跨膜孔(transmembrane pores)來(lái)使細(xì)胞膜有可 逆的滲透性。此方法操作復(fù)雜且得到的樣品量較少。
3、 Gyana提出一種有效的、方便的將海藻糖引入紅細(xì)胞的方法， 我們稱此法為"Gyana孵育法"。該方法利用紅細(xì)胞膜的熱力學(xué)特性 (thermal properties),在37。C條件下孵育7h可以將足量的海藻糖 載入紅細(xì)胞內(nèi)。在胞外海藻糖濃度為800mM時(shí)，胞內(nèi)海藻糖濃度可以 達(dá)到34mM，溶血率為15%。此方法的載入效果比以前的方法都好，但 是耗時(shí)長(zhǎng)，溶血率較大，并且載入效果有待進(jìn)一步提高。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述方法中存在的操作煩瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)樣品量少、
載入效果不太明顯等問(wèn)題，本發(fā)明提出了一種通過(guò)電滲透的方法將海 藻糖載入紅細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)選擇合適的細(xì)胞外海藻糖濃度和控制電滲透 的參數(shù)，可以達(dá)到理想的載入效果。 本發(fā)明采用的技術(shù)方案
電脈沖滲透將海藻糖載入紅細(xì)胞內(nèi)的方法
(1) 電滲透前細(xì)胞的處理
先將新鮮血液以2500r/min離心5min，棄去血漿及白膜，將紅 細(xì)胞用等滲pH=7. 4的磷酸鹽緩沖溶液以2500r/min離心5min，反復(fù) 洗滌3次，棄去上清液，得洗滌紅細(xì)胞。將得到的洗滌紅細(xì)胞與800mM 的海藻糖溶液以1:1. 5的比例混合均勻，得到紅細(xì)胞溶液。
(2) 紅細(xì)胞溶液的電脈沖滲透 將得到的加入了海藻糖的紅細(xì)胞溶液取400微升放入間距為2mm
的電擊杯中，將此電擊杯放入電擊池中，并將電脈沖滲透的參數(shù)設(shè)置 如下電壓300v、脈寬lms、頻率為1次/分鐘，共四次。在此參數(shù) 下進(jìn)行紅細(xì)胞的電脈沖實(shí)驗(yàn)。
(3) 細(xì)胞內(nèi)海藻糖濃度的提取 將經(jīng)過(guò)電滲透的紅細(xì)胞溶液用pH=7.4的等滲磷酸鹽緩沖液以
2500r/min離心5min，反復(fù)洗滌3次，棄去上清液，得到電脈沖滲透 紅細(xì)胞溶液。取電脈沖滲透過(guò)的紅細(xì)胞溶液lml加入10%的三氯乙酸 3ml混合均勻，在8(TC恒溫水浴箱中用生膠帶密封加熱lh后再以 3500r/min離心5min，收集上清液，如此提取3次，得到細(xì)胞內(nèi)的海 藻糖的提取液。 本發(fā)明的技術(shù)效果
本發(fā)明的一種電滲透的載糖方法在紅細(xì)胞中的使用，通過(guò)三氯 乙酸提取后，經(jīng)過(guò)硫酸蒽酮法測(cè)定，細(xì)胞內(nèi)的海藻糖濃度最高可高達(dá)
63. 68mM，與目前現(xiàn)有技術(shù)中報(bào)道的紅細(xì)胞在細(xì)胞外海藻糖濃度為 800mM的"Gyana孵育法"的載糖濃度為34mM相比(測(cè)定方法同樣是 硫酸蒽酮法)，得到了很大的提高，且此方法還具有操作方便，省時(shí) 省力的特點(diǎn)。


圖1，海藻糖濃度與吸光度對(duì)應(yīng)關(guān)系圖；
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)描述，但不限制本發(fā)明。 實(shí)施例
電脈沖儀美國(guó)BTX公司BCM-830脈沖儀(電穿孔儀) 胞內(nèi)海藻糖濃度的計(jì)算
(1) 海藻糖濃度與吸光度的關(guān)系圖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取已知各濃度海藻糖的溶液lml加入2g/L硫酸蒽酮溶液4ml，
在冰水浴中搖勻冷卻，沸水精確煮沸10min，再用流水冷卻10min。 在625nm處以空白管調(diào)零，用lcm光徑的比色皿測(cè)定各管吸光度值， 繪制海藻糖濃度與吸光度的關(guān)系，見(jiàn)附圖l。
(2) 細(xì)胞內(nèi)的海藻糖濃度計(jì)算 用標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定出提取液中的海藻糖濃度，按照如下公式計(jì)
算出細(xì)胞內(nèi)的海藻糖濃度
其中 <formula>formula see original document page 5</formula>
Ci——細(xì)胞內(nèi)海藻糖濃度，mmol/L, C一萃取液中海藻糖的濃度，m——海藻糖的分子量，取378. 33g/mol， n——紅細(xì)胞的計(jì)數(shù)，xl0(12)/L, V——紅細(xì)胞的平均體積，fL，
Vb——紅細(xì)胞不可滲透體積，fL，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道取值為55. 21%V
利用電脈沖滲透將海藻糖載入紅細(xì)胞內(nèi)的方法
(1) 電滲透前細(xì)胞的處理
先將健康人新鮮血液以2500r/min離心5min,棄去血漿及白膜， 將紅細(xì)胞用等滲pH=7. 4的磷酸鹽緩沖溶液以2500r/min離心5min， 反復(fù)洗滌3次，棄去上清液，得洗滌紅細(xì)胞。將得到的洗滌紅細(xì)胞與 800mM的海藻糖溶液以1:1.5的比例混合均勻，得到紅細(xì)胞溶液。
(2) 紅細(xì)胞溶液的電滲透 將得到的加入了海藻糖的紅細(xì)胞溶液取400微升，放入間距為
2mm的電擊杯中，將此電擊杯放入電擊池中，并將電脈沖滲透的參數(shù) 設(shè)置如下電壓300v、脈寬lms、頻率為1次/1分鐘，共4次。在 此參數(shù)下進(jìn)行紅細(xì)胞的電脈沖實(shí)驗(yàn)。
(3) 細(xì)胞內(nèi)海藻糖濃度的提取 將經(jīng)過(guò)電滲透的紅細(xì)胞溶液用PH=7. 4的等滲磷酸鹽緩沖液溶液
以2500r/min離心5min，反復(fù)洗滌3次，棄去上清液，得到電滲透 紅細(xì)胞溶液。取電滲透過(guò)的紅細(xì)胞溶液lml加入10%的三氯乙酸3ml 混合均勻，在8(TC恒溫水浴箱中用生膠帶密封加熱lh后再以 3500r/min離心5min，收集上清液，如此提取3次，得到細(xì)胞內(nèi)的海 藻糖的提取液，細(xì)胞內(nèi)海藻糖濃度的最大值為63. 68mM。
本發(fā)明的電脈沖滲透將海藻糖載入紅細(xì)胞內(nèi)的方法與目前現(xiàn)有 技術(shù)中報(bào)道的紅細(xì)胞在細(xì)胞外海藻糖濃度為800mM的"Gyana孵育 法"的載糖濃度為34raM相比，載入效果得到了很大的提高，且此方 法還具有操作方便，省時(shí)省力的特點(diǎn)。
權(quán)利要求
1、一種利用電脈沖滲透將海藻糖載入紅細(xì)胞內(nèi)的方法，其特征在于含有如下操作步驟(1)電脈沖滲透前細(xì)胞的處理將新鮮血液以2500r/min離心5min，棄去血漿及白膜，將紅細(xì)胞用pH＝7.4的等滲磷酸鹽緩沖溶液在離心機(jī)中以2500r/min離心5min，反復(fù)洗滌3次，棄去上清液，得紅細(xì)胞，將此紅細(xì)胞與配置好的海藻糖濃度為800mM、KCl為5mM的溶液以1:1.5的體積比混合均勻，得到紅細(xì)胞溶液；(2)電脈沖滲透控制參數(shù)的選擇取上述步驟(1)中所得的紅細(xì)胞溶液400微升，放入間距為2mm的電擊杯中，將此電擊杯放入電擊池中，并設(shè)定電脈沖滲透時(shí)的控制參數(shù)為電壓300v、脈寬1ms、頻率1次/1分鐘，共四次；(3)電脈沖滲透后紅細(xì)胞的處理將上述步驟(2)中經(jīng)過(guò)電脈沖滲透過(guò)的紅細(xì)胞溶液，用pH＝7.4的等滲磷酸鹽緩沖液以2500r/min離心5min，反復(fù)洗滌3次，棄去上清液，得到載入海藻糖的紅細(xì)胞懸濁液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種電脈沖滲透將海藻糖載入紅細(xì)胞內(nèi)的方法。包括電脈沖滲透前細(xì)胞的處理，即將新鮮血液離心，棄去血漿及白膜，用pH＝7.4的等滲磷酸鹽緩沖溶液在離心機(jī)中離心，洗滌，棄上清液，再與配置好的海藻糖以一定的體積比混合均勻，得到紅細(xì)胞溶液，取一定量，放入電脈沖儀的電擊杯中，進(jìn)行電脈沖滲透，控制電壓300v、脈寬1ms、頻率1次/1分鐘，共四次，經(jīng)過(guò)電脈沖滲透過(guò)的紅細(xì)胞溶液，用pH＝7.4磷酸鹽緩沖液洗滌三次得到電脈沖載糖溶液，并測(cè)得細(xì)胞內(nèi)的海藻糖濃度達(dá)到63.68mM。與目前較好方法為高滲法(細(xì)胞外的海藻糖濃度為800mM時(shí)，載入的效果為34mM)相比，本發(fā)明方法的海藻糖載入濃度明顯的提高了，從而有利于紅細(xì)胞的凍干保存。
文檔編號(hào)C12N5/078GK101381705SQ20081020142
公開日2009年3月11日 申請(qǐng)日期2008年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月21日
發(fā)明者劉寶林, 劉建峰, 周國(guó)燕, 周新麗, 晨 宋, 驥 袁, 煥 黃 申請(qǐng)人:上海理工大學(xué)