專利名稱：一種造血嵌合體實時定量pcr檢測及其標(biāo)本收集方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種造血嵌合體實時定量PCR (Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))檢測方法，特別涉及一種利用熒光染料STOR green來檢測造血嵌合體的PCR檢測及其標(biāo)本收集方法。
背景技術(shù)：
隨著異體造血干細(xì)胞用來治療各種惡性和非惡性的血液疾病，許多病人延長了總的存活時間和無病生存時間。導(dǎo)致治療失敗的主要原因是疾病復(fù)發(fā)，移植物被排斥，移植物抗宿主病。因此定量分析病人異體干細(xì)胞移植后供體嵌合體是用來診斷移植物成活，早期檢測和治療疾病復(fù)發(fā)，移植物排斥反應(yīng)的重要工具。異體造血干細(xì)胞移植后的嵌合體的監(jiān)測已成為常規(guī)檢查手段，特別是在RIC (Reduced Intensity Conditioning,降低強度條件) 的異體移植，異體干細(xì)胞移植后供體嵌合體的結(jié)果可用來指導(dǎo)是否進(jìn)行干預(yù)治療，特別在改變免疫抑制治療和治療疾病的復(fù)發(fā)起到了決定性作用。造血嵌合體的檢測可以利用受體和供體多態(tài)性遺傳標(biāo)記或它的產(chǎn)物的不同來測量。目前廣泛應(yīng)用的方法包括細(xì)胞遺傳學(xué)，紅細(xì)胞分型，限制性片段長度多態(tài)性分析和免疫熒光原位雜交(Fluorescence In Situ Hybridization, FISH)技術(shù)通過XY染色體探頭來測定。但是以上方法或者費時，或者不適用于所有病人。比如免疫熒光原位雜交(FISH)技術(shù)是通過XY染色體探頭來測定造血嵌合體的，因此只適用于受體和供體是不同性別的異體造血干細(xì)胞移植；而紅細(xì)胞分型方法只適用于不同血型的受體和供體。近年來用PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))實時定量檢測造血嵌合體的方法因其應(yīng)用的廣泛和高靈敏度而越來越多地被使用。目前被接受的分子生物學(xué)方法是用PCR方法檢測Microsatellite序列一一種短而重復(fù)不編碼的序列。因為在不同的受體和供體中，此序列的重復(fù)數(shù)量不同從而造成PCR產(chǎn)物的大小不同。進(jìn)而用丙烯酰胺凝膠電泳和自動序列分析PCR產(chǎn)物。此方法靈敏度相對較低(1 5%)，而且費時，費力， 價格昂貴。最近一種新的應(yīng)用TaqMan技術(shù)檢測單核甘酸多態(tài)性(SNP，Single Nucleotide Polymorphisms)的實時定量PCR方法被建立起來。SNP是等位基因變異，廣泛表達(dá)在人的染色體編碼與非編碼區(qū)。大約每1000個堿基對就有一個單核苷酸多態(tài)性發(fā)生，因此為嵌合體的分析提供了一個廣泛的信息標(biāo)記庫。此TaqMan技術(shù)的實時定量PCR方法需要應(yīng)用特異的TaqMan探頭，有價格昂貴而且保質(zhì)期短的缺點。相比而言，能納入雙鏈PCR產(chǎn)物的熒光染料STOR green因其便宜，高靈敏度而被廣泛應(yīng)用于實時定量PCR方法上。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立了一種利用熒光染料STOR green來檢測造血嵌合體的PCR 檢測新方法及其標(biāo)本收集方法，所述PCR檢測方法可以提高PCR方法檢測的靈敏度，耗時低且節(jié)省費用。
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為達(dá)到本發(fā)明的目的，本發(fā)明的檢測造血嵌合體的實時定量PCR檢測方法包括以下步驟Si.收集標(biāo)本；S2.選擇多態(tài)性遺傳標(biāo)記設(shè)計引物和探針(probe)；S3.實時定量PCR檢測造血嵌合體；S4.人工合成12個不同稀釋濃度的造血嵌合體；以及S5.統(tǒng)計學(xué)分析。造血嵌合體的檢測關(guān)鍵在于選擇可以區(qū)分受體和供體的特異性多態(tài)性遺傳標(biāo)記。 本發(fā)明中介紹了 12個可以用于實時熒光定量PCR(Real time Q-PCR)來檢測造血嵌合體的特異性多態(tài)性遺傳標(biāo)記。用此12個多態(tài)性遺傳標(biāo)記對37對供體和受體進(jìn)行篩選，結(jié)果表明每個多態(tài)性標(biāo)記的信息性(informativity)在3%至47%之間。12個多態(tài)性遺傳標(biāo)記可以區(qū)別94%的供體和受體。除一對同卵雙胞胎外，所有37對供體和受體都可以找到適合的特異性多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)一步進(jìn)行定量PCR來檢測造血嵌合體。為了彌補熒光染料STOR green納入雙鏈DNA是非特異性的，同時運行熔解曲線 (melting curve)可以用來驗證PCR產(chǎn)物的特異性。進(jìn)一步用人工合成12個不同稀釋濃度的造血嵌合體(從0. 01 %至100% )，利用供體DNA來稀釋受體DNA或受體DNA來稀釋供體DNA，標(biāo)準(zhǔn)的擴增曲線由供體或受體特異的等位基因位點的PCR來擴增以上人工合成的造血嵌合體來作出。供體或受體的陰性等位基因可以用來作為陰性對照。移植后的供體細(xì)胞的百分比可以從標(biāo)準(zhǔn)的擴增曲線計算出來。本申請案的發(fā)明人對此方法和TaqMan probe的實時定量PCR進(jìn)行比較，結(jié)果表明其靈敏度及準(zhǔn)確度與iTaqMan probe的實時定量PCR方法一樣高。由于Sybr green價格便宜，保質(zhì)期長，使其在實際應(yīng)用上更優(yōu)于Taqman PCR0本申請案的發(fā)明人用此新方法檢測了 18個病例，檢測結(jié)果與用傳統(tǒng)的Microsatellite/FISH的結(jié)果是一致的。但本方法應(yīng)用廣泛，適用于各類異體干細(xì)胞移植(包括同性別和不同性別)，且靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于另兩種方法。綜上所述，本專利申請所建立的檢測造血嵌合體實時定量PCR檢測方法是一種快捷簡便而可靠的方法。


通過下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述，本發(fā)明前述的和其他的目的、特征和優(yōu)點將變得顯而易見。其中圖1所示為本發(fā)明的檢測造血嵌合體的實時定量PCR檢測方法的步驟示意圖；圖2所示為PCR產(chǎn)物產(chǎn)生的兩個等位基因顯示出兩個明顯不同的熔解曲線；圖3所示為由供體或受體特異的等位基因位點的PCR來擴增人工合成的造血嵌合體作出標(biāo)準(zhǔn)擴增曲線。
具體實施例方式如圖1所示，根據(jù)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的一個實施例建立的一種利用熒光染料 SYBR green來檢測造血嵌合體的新方法，包括以下步驟
Si.收集標(biāo)本臨床采集供體和受體移植之前和移植后一個月的血樣，用常規(guī)方法從中直接提取genomic DNA (基因組DNA)，用Nanodrop分光光度儀測量DNA濃度，而后存于4°C備用。S2.選擇多態(tài)性遺傳標(biāo)記設(shè)計引物和探針(probe)多態(tài)性遺傳標(biāo)記的核甘酸序列人類等位基因短的插入/缺失多態(tài)性(human biallelic short insertion/deletion polymorphisms)從 Marshfiled Clinic (http://research, marshf ieldclinic. org/ genetics/Genetic Research)獲得。其中，選擇標(biāo)準(zhǔn)為包括含有至少兩個以上連續(xù)的堿基不同的等位基因多態(tài)性，在一般人群中顯示高度的雜合性。以此標(biāo)準(zhǔn)選擇如表1中所示的 12個多態(tài)性遺傳標(biāo)記。用軟件Prime 3來設(shè)計引物，針對每個等位基因多態(tài)性標(biāo)記，需要設(shè)計兩對引物，一個針對兩個等位基因的共同位點，一個針對獨特的多態(tài)位點。TaqMan probe 探針被選定在兩個等位基因之間；然后對每個PCR產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析。表1.用于實時定量PCR的特異標(biāo)記的特征
權(quán)利要求
1.一種利用熒光染料STOR green來進(jìn)行造血嵌合體的實時定量PCR檢測的標(biāo)本收集方法，包括以下步驟通過臨床采集供體和受體移植之前和移植后一個月的血樣； 用常規(guī)方法從中直接提取基因組DNA ；以及用分光光度儀測量DNA濃度，而后存于4°C備用。
2.一種利用熒光染料STOR green來進(jìn)行造血嵌合體的實時定量PCR檢測方法，其包括51.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法收集標(biāo)本；52.選擇多態(tài)性遺傳標(biāo)記設(shè)計引物和探針；53.實時定量PCR檢測造血嵌合體；54.人工合成不同稀釋濃度的造血嵌合體；以及55.統(tǒng)計學(xué)分析。
3.如權(quán)利要求2所述的造血嵌合體的實時定量PCR檢測方法，其中，所述步驟S2中，選擇多態(tài)性遺傳標(biāo)記設(shè)計引物和探針的選擇標(biāo)準(zhǔn)為包括含有至少兩個以上連續(xù)的堿基不同的等位基因多態(tài)性。
4.如權(quán)利要求2所述的造血嵌合體的實時定量PCR檢測方法，其中，所述步驟S4中，是利用供體DNA來稀釋受體DNA或受體DNA來稀釋供體DNA進(jìn)行人工合成12個不同稀釋濃度的造血嵌合體。
5.如權(quán)利要求4所述的造血嵌合體的實時定量PCR檢測方法，其中，所述人工合成12 個不同稀釋濃度的造血嵌合體的濃度從0.01%至100%。
6.如權(quán)利要求4所述的造血嵌合體的實時定量PCR檢測方法，其中，還包括同時運行熔解曲線驗證PCR產(chǎn)物的特異性。
全文摘要
本發(fā)明提出一種利用熒光染料SYBR green的來檢測造血嵌合體的PCR實時定量檢測方法，所述包括步驟收集標(biāo)本；選擇多態(tài)性遺傳標(biāo)記設(shè)計引物和探針；實時定量PCR檢測造血嵌合體；人工合成不同稀釋濃度的造血嵌合體；以及進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。其中所述收集標(biāo)本的步驟包括通過臨床采集供體和受體移植之前和移植后一個月的血樣；以及用常規(guī)方法從中直接提取基因組DNA。本發(fā)明中介紹了12個可以用于Q-PCR來檢測造血嵌合體的特異性多態(tài)性遺傳標(biāo)記。另外為了彌補熒光染料SYBR green納入雙鏈DNA是非特異性的，同時運行熔解曲線來驗證PCR產(chǎn)物的特異性。本發(fā)明的實時定量PCR方法所需費用便宜，保質(zhì)期長，且靈敏度，為一種快捷簡便而可靠的造血嵌合體的檢測方法。
文檔編號C12Q1/68GK102399879SQ20111036293
公開日2012年4月4日 申請日期2011年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月14日
發(fā)明者虞強 申請人:江蘇邁健生物科技發(fā)展有限公司