專利名稱：根特異啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因 ZMPIP2a表達(dá)載體及構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種根特異啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因 ZMPIP2a表達(dá)載體及構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
啟動子是基因表達(dá)調(diào)控因子中最重要的因子，基本決定一個基因是否表達(dá)、何時表達(dá)和何處表達(dá)。按作用方式和功能，啟動子大體可以分為組成型啟動子、特異性啟動子和誘導(dǎo)型啟動子三大類。目前，組織特異性啟動子的調(diào)控機(jī)制己進(jìn)入深入研究階段，該類啟動子除具有基本結(jié)構(gòu)外，通常還有一些調(diào)控特異表達(dá)的序列，這些序列為轉(zhuǎn)錄因子提供了結(jié)合位點(diǎn)，通過與蛋白質(zhì)的相互作用來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。在組織特異性啟動子的驅(qū)動下，基因的表達(dá)通常只發(fā)生在特定的組織或器官，并往往表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。根是植物吸收水分和營養(yǎng)物質(zhì)的重要器官，根特異表達(dá)系統(tǒng)可用于研究植物的高滲脅迫耐受、植物修復(fù)和根際分泌等。擬南芥的磷酸轉(zhuǎn)移酶基因啟動子與^依融合， 在農(nóng)桿菌介導(dǎo)下轉(zhuǎn)化擬南芥和擬南芥，組織化學(xué)分析顯示蛋白只在擬南芥和擬南芥的根毛及根表皮表達(dá)，說明該啟動子是根特異的。Borisjuk等用根特異啟動子mas2、GFP和煙草鈣網(wǎng)蛋白基因(calreticulin)構(gòu)建融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)基因煙草水培研究結(jié)果表明，根細(xì)胞不僅能高效產(chǎn)生某些目的蛋白質(zhì)，而且可將目的蛋白質(zhì)分泌到液體培養(yǎng)基中。水通道蛋白是一種水的分子通道，植物細(xì)胞吸水必須要通過水通道蛋白的功能實(shí)現(xiàn)。爪蟾卵母細(xì)胞中的研究顯示，水通道蛋白ZmPIP2a能夠使爪蟾母卵細(xì)胞細(xì)胞膜透水性提高至原來的8倍，大大增加了細(xì)胞吸水能力。玉米水通道蛋白家族有14個質(zhì)膜水通道蛋白(plasma membrane intrinsic proteins, PIPs)，其中包含PIPl與PIP2。其中玉米水通道蛋白ZmPIP2_5(即ZmPIP2a)的運(yùn)輸活性已經(jīng)得到檢驗(yàn)其表現(xiàn)出高度水分運(yùn)輸活性。人工模擬的水分虧缺條件下，ZmPIP2a 基因表達(dá)量有增加的趨勢。其表達(dá)量的高低有可能與根系吸水能力的強(qiáng)弱以及作物抗旱性的強(qiáng)弱有關(guān)。植物的根系在植物抗旱中起著重要的作用，根系吸水力的提升和根系形態(tài)的建成，無疑對提高植物的吸水力，增強(qiáng)其抗旱性具有重要的意義。多數(shù)的植物功能基因如激素合成、代謝相關(guān)基因，植物生長、發(fā)育調(diào)控基因在植物的地上部分和地下部分均有表達(dá)，通過簡單的轉(zhuǎn)基因或者基因沉默的方式只能從整體上調(diào)節(jié)基因在植物體的表達(dá)，不能特異性的實(shí)現(xiàn)對植物根系功能和發(fā)育的調(diào)控。為了解決上述問題，需要利用植物根系特異性表達(dá)的啟動子驅(qū)動水通道蛋白功能基因的表達(dá)，以達(dá)到既能提高植物吸水性、增加植物根系長度和數(shù)量，又不影響植物地上部生長、不損害植物營養(yǎng)生長的目的，由此通過轉(zhuǎn)基因的手段能夠獲得相應(yīng)的抗旱植株。目前的研究中需要構(gòu)建一種根特異啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因表達(dá)載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種根特異啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因ZMPIP2a表達(dá)載體，所述的根特異啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因ZMPIP2a表達(dá)載體的出發(fā)載體為PGreen0229質(zhì)粒載體， 并包含有水稻根特異性啟動子基因々和水通道蛋白基因Z#/Y/^a。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種根特異啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因刀^/戶為表達(dá)載體，所述的根特異啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因ZMPIP2a表達(dá)載體的出發(fā)載體為PGreen0229質(zhì)粒載體，所述的根特異啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因ZMPIP2a表達(dá)載體的啟動子是水稻根特異性啟動子基因從所述的水稻根特異性啟動子基因々的下游包含有水通道蛋白基因 ZMPIP2a 。所述的水稻根特異性啟動子基因々的序列為序列表中的SEQ ID No :4 ；所述的水通道蛋白基因刀TZT^a的序列為序列表中的SEQ ID No :5。所述的根特異啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因ZMPIP2a表達(dá)載體的構(gòu)建方法包括以下步驟
I、UBQI-Nos-35Sbar -PGreen0229 質(zhì)粒載體構(gòu)建
A、將基因35Sbar連接到PGreen0229質(zhì)粒載體，得到35Sbar-PGreen0229質(zhì)粒載體；
B、將基因Nos連接到所述的35Sbar_PGreen0229質(zhì)粒載體，得到Nos- 35Sbar -PGreen0229質(zhì)粒載體；
C、將基因UBQI連接到所述的Nos-35Sbar-PGreen0229質(zhì)粒載體，得到UBQI-Nos-35Sbar -PGreen0229 質(zhì)粒載體；
II、EXP18-D"ZMPIP2a-PGM"0229 質(zhì)粒載體構(gòu)建；
A、將所述的UBQI-Nos-35Sbar _PGreen0229質(zhì)粒載體進(jìn)行酶切反應(yīng)，切除基因UBQI， 得到 Nos- 35Sbar -PGreen0229 質(zhì)粒載體 B
B、克隆水稻根特異性啟動子基因E)(P18-D，并連接到PMD18-Tsimple質(zhì)粒載體，得到 EXP18-D-T質(zhì)粒載體；
C、用所述的EXP18-D-T質(zhì)粒載體和Nos-35Sbar _PGreen0229質(zhì)粒載體B構(gòu)建 EXP18-D-PGM-0229 質(zhì)粒載體；
D、克隆水通道蛋白基因ZMPIP2a，并連接到PMD18-Tsimple質(zhì)粒載體，得到ZMPIP2a_T 質(zhì)粒載體；
E、用所述的ZMPIP2a-T質(zhì)粒載體和EXP18-D-PGM-0229質(zhì)粒載體構(gòu)建EXP18-D-ZMPIP2a-PGM-0229質(zhì)粒載體，即為所述的啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因ZMPIP2ei表達(dá)載體。所述的基因35Sbar的序列包含在序列表中的SEQ ID No :1中；所述的基因Nos的序列包含在序列表中的SEQ ID No :2中。圖1為所述的啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因ZMPIP2a表達(dá)載體的簡圖。本發(fā)明的有益效果為
因?yàn)楸景l(fā)明的表達(dá)載體采用水稻根特異性啟動子基因i^/^s-iM故為啟動子，驅(qū)動水通道蛋白基因ZiTTT^3的表達(dá)，所以該表達(dá)載體具有特定地改變植物的根部形態(tài)、獲得相應(yīng)的抗旱植株潛力轉(zhuǎn)入該啟動子的植株，在同等干旱條件下，存活率比相比對照組的野生型植株高60-70%。


圖ι 本發(fā)明所述的圖1為所述的啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因ZMPIP2a表達(dá)載體的簡
圖2 實(shí)施例1中，UBQI-Nos- 35Sbar _PGreen0229質(zhì)粒載體菌液PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖3 實(shí)施例1中，UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229質(zhì)粒載體酶切產(chǎn)物電泳圖； 圖4 實(shí)施例1中，UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229質(zhì)粒載體的圖譜； 圖5 實(shí)施例1中，UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229質(zhì)粒載體酶切產(chǎn)物電泳圖； 圖6 實(shí)施例1中，大片段G連接產(chǎn)物電泳圖7 實(shí)施例1中，水稻啟動子基因EXP18-D的PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖
圖8 實(shí)施例1中，EXP18-D-T質(zhì)粒載體菌液PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖9 實(shí)施例1中，EXP18-D-T質(zhì)粒載體酶切產(chǎn)物電泳圖10 實(shí)施例1中，Nos- 35Sbar -PGreen0229質(zhì)粒載體B酶切產(chǎn)物電泳圖11 實(shí)施例1中，EXP18-D-PGM-0229質(zhì)粒載體菌液PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖12 實(shí)施例1中，EXP18-D-PGM-0229質(zhì)粒載體酶切產(chǎn)物電泳圖13 實(shí)施例1中，水通道蛋白基因ZMPIP2a的PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖14 實(shí)施例1中，ZMPIP2a-T質(zhì)粒載體菌液PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖15 實(shí)施例1中，ZMPIP2a-T質(zhì)粒載體酶切產(chǎn)物電泳圖16 實(shí)施例1中，EXP18-D-PGM-0229質(zhì)粒載體酶切產(chǎn)物電泳圖17 實(shí)施例1中，EXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229質(zhì)粒載體菌液PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳
圖18 實(shí)施例1中，EXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229質(zhì)粒載體酶切產(chǎn)物電泳圖； 圖19 實(shí)施例1中，培養(yǎng)10天時的各種擬南芥植株根長的對比圖； 圖20 實(shí)施例1中，培養(yǎng)20天時的各種擬南芥植株根長的對比圖； 圖21 實(shí)施例1中，干旱處理后各種擬南芥植株生長狀態(tài)的對比圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
一種根特異啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因ZMPIP23表達(dá)載體，出發(fā)載體為PGreen0229 質(zhì)粒載體，所述的根特異啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因ZMPIP2a表達(dá)載體的啟動子是水稻根特異性啟動子基因i^WS-々，所述的水稻根特異性啟動子基因々的下游包含有水通道蛋白基因Zi^/Z^a。所述的根特異啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因ZMPIP2a表達(dá)載體的構(gòu)建方法包括以下步驟
I、UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229 質(zhì)粒載體構(gòu)建
A、將基因35Sbar連接到PGreen0229質(zhì)粒載體，得到35Sbar- PGreen0229質(zhì)粒載體； a.將puc57-35Sbar質(zhì)粒用SacI內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，得到帶有SacI酶切位點(diǎn)的基因 35Sbar ；所述的帶有SacI酶切位點(diǎn)的基因35Sbar的序列為序列表中SEQ ID No :1 ；所述的基因35Sbar由生工生物有限公司合成并連接在puc57質(zhì)粒上，以puc57-35Sbar質(zhì)粒的形式購買得到；
所述的酶切反應(yīng)中，酶切體系為
IOXbuffer 2μ 1 ；SacI :2μ 1，質(zhì)粒:10μ 1，ddH20 ；6 μ 1 ；于 37°C 反應(yīng) 3 小時；
b.將PGreen0229質(zhì)粒載體用SacI內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，得到大小約為4451bp的片段B;
所述的酶切反應(yīng)中，酶切體系為
IOXbuffer :2μ 1 ；SacI :2μ 1，質(zhì)粒:10μ 1，ddH20 ；6 μ 1 ；于 37°C反應(yīng) 3 小時；
c.對上述帶有SacI酶切位點(diǎn)的基因35Sbar、大小約為4451bp的片段B進(jìn)行回收處理，再進(jìn)行連接反應(yīng)，得到35Sbar -PGreen0229質(zhì)粒載體；
上述連接反應(yīng)中，連接體系為10Xbuffer :1 μ 1，片段A :7 μ 1，片段B :1 μ 1，
T4DNA連接酶1μ 1 ； 16 °C連接過夜；
B、將基因Nos連接到所述的35Sbar-PGreen0229質(zhì)粒載體，得到Nos- 35Sbar -PGreen0229質(zhì)粒載體；
a.將puc57-Nos質(zhì)粒用HindIII、cspl內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，得到帶有HindII、cspl 酶切位點(diǎn)的基因Nos ；
所述的帶有HindIILcspI酶切位點(diǎn)基因Nos的序列為序列表中SEQ ID No 2 ；所述的基因Nos由生工生物有限公司合成并連接在puc57質(zhì)粒上，以puc57-NOS質(zhì)粒的形式購買得到；
所述的酶切反應(yīng)中，酶切體系為
IOXbuffer 2μ 1 ； Hind III :1 μ 1，cspl :1 μ 1，質(zhì)粒10 μ 1，ddH20 ;6 μ 1 ；于 37°C反應(yīng)3小時；
b.將所述的35Sbar-PGreen0229質(zhì)粒載體用Hind III、cspl內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，得到大小約為5804bp的大片段C和70bp左右的小片段D ；
所述的酶切反應(yīng)中，酶切體系為
IOXbuffer 2μ 1 ； Hind III :1 μ 1，cspl :1 μ 1，質(zhì)粒10 μ 1，ddH20 ;6 μ 1 ；于 37°C反應(yīng)3小時；
c.對大小約為5804bp的大片段C進(jìn)行回收處理，再與所述的帶有Hindll、cspl酶切位點(diǎn)的基因Nos進(jìn)行連接反應(yīng)，得到所述的Nos-35Sbar -PGreen0229質(zhì)粒載體；
上述連接反應(yīng)中，連接體系為10Xbuffer :1 μ 1，所述的帶有Hindll、cspl酶切位點(diǎn)的基因Nos 7 μ 1，大片段C :1 μ 1，T4DNA連接酶1 μ 1 ； 16°C連接過夜；
C、將基因UBQI連接到所述的Nos-35Sbar-PGreen0229質(zhì)粒載體，得到UBQI-Nos-35Sbar -PGreen0229 質(zhì)粒載體；
a.將puc57-UBQI質(zhì)粒用HindIII內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，得到帶有HindIII酶切位點(diǎn)的基因UBQI，即大小約為2000bp的片段E ；
所述的酶切反應(yīng)中，酶切體系為
IOXbuffer 2μ 1 ； Hind III :2 μ 1，質(zhì)粒10 μ 1，ddH20 ;6 μ 1 ；于 37°C反應(yīng) 3 小時;
所述的帶有HindIII酶切位點(diǎn)的基因UBQI的序列為序列表中SEQ ID No 3 ；所述的基因UBQI由生工生物有限公司合成并連接在puc57質(zhì)粒上，以UBQI- puc57質(zhì)粒的形式購買得到；
b.將所述的35Sbar-PGreen0229質(zhì)粒載體用HindIII內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，得到大小約為5695bp的大片段F ；
所述的酶切反應(yīng)中，酶切體系為
IOXbuffer 2μ 1 ； Hind III :2 μ 1，質(zhì)粒10 μ 1，ddH20 ;6 μ 1 ；于 37°C反應(yīng) 3 小時;
c.對大小約為5695bp的大片段F進(jìn)行回收處理，再與所述的帶有HindIII酶切位點(diǎn)的基因UBQI進(jìn)行連接反應(yīng)，得到所述的UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229質(zhì)粒載體；
d.將所述UBQI-Nos-35Sbar -PGreen0229質(zhì)粒載體通過熱激法轉(zhuǎn)化至所述的大腸桿菌E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，再進(jìn)行振蕩培養(yǎng)處理、再進(jìn)行涂板處理，得到PGM_0229_1 轉(zhuǎn)化平板；再將所述的UBQI-Nos- 35Sbar _PGreen0229轉(zhuǎn)化平板中的單菌落進(jìn)行菌液PCR 反應(yīng)檢測并制備得到含有UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229質(zhì)粒載體的甘油菌，置于_20°C 凍存。具體的操作為
取IOOul的E. coli感受態(tài)細(xì)胞置于冰上自然融化；將6μ 1的UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229質(zhì)粒載體分別加入感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻后，冰浴靜置30分鐘。于42°C水浴，90s熱激，再置于冰上放置1 2分鐘；得到轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞；無菌環(huán)境下，向轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞中，加入800 μ 1 LB液體培養(yǎng)基，37°C 150rpm振蕩培養(yǎng)lh，得到振蕩培養(yǎng)物；
取200ul上述振蕩培養(yǎng)物涂布于含有氨芐青霉素(100mg/L)的LB瓊脂平板上；涂布均勻，置于室溫直至液體被完全吸收，得到轉(zhuǎn)化平板；從上述轉(zhuǎn)化平板上挑取若干生長狀況良好的單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，同時將挑取的單菌落于4ml含有Amp (100mg/L)的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)驗(yàn)證正確的為陽性克隆菌落培養(yǎng)物，吸取Iml過夜培養(yǎng)物，加入0. 5ml 50%甘油于1. 5ml離心管中，作為含有UBQI-Nos- 35Sbar _PGreen0229質(zhì)粒載體的甘油菌， 置于-20°C凍存。d.將含有UBQI-Nos- 35Sbar _PGreen0229質(zhì)粒載體的甘油菌進(jìn)行復(fù)蘇處理、振蕩培養(yǎng)處理，質(zhì)粒提取處理，得到UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229質(zhì)粒載體；
具體的操作為
挑取所述的含有UBQI-Nos- 35Sbar _PGreen0229質(zhì)粒載體的甘油菌，在含有氨芐青霉素(100mg/L)的LB瓊脂平板上劃線，于37°C過夜培養(yǎng)；再挑取生長狀況良好的單菌落，在含有氨芐青霉素(100mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C搖床培養(yǎng)過夜，得到含有UBQI-Nos-35Sbar _PGreen0229 質(zhì)粒載體的菌液；再將含有 UBQI-Nos- 35Sbar _PGreen0229 質(zhì)粒載體的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取處理，得到UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229質(zhì)粒載體；所述的質(zhì)粒提取處理采用質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒，型號為DV801A，購自用寶生物工程(大連)有限公司；通過菌液PCR反應(yīng)和酶切反應(yīng)驗(yàn)證所述的raQI-Nos- 35Sbar _PGreen0229質(zhì)粒載體構(gòu)建正確 先進(jìn)行菌液PCR反應(yīng)，設(shè)計引物為
upper CCCTGTTGTTTGGTGTTACT, lower :TGGGTGGGGGTCCATCT ；
欲擴(kuò)增得到始于基因UBQI起始處的下游1957bp，終于基因35Sbar起始處的下游 370bp,長度為750左右的目的片段；圖2為上述菌液PCR反應(yīng)檢測產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖1中，泳道M中為 Takara DL5000 Marker bp，泳道1、2中為擴(kuò)增產(chǎn)物，亮度最高的條帶為750左右的片段；
將菌液PCR呈陽性的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取處理，再采用EcoRI限制性內(nèi)切酶對該質(zhì)粒進(jìn)行酶切反應(yīng)檢測；
圖3為酶切產(chǎn)物的1 %瓊脂糖凝膠電泳圖；圖3中，泳道M中為Takara DL5000 Marker, 泳道1-2中為酶切產(chǎn)物，條帶由上至下分別為6765bp的片段和942bp的片段； II、EXP18-D" ZMPIP2a-PGM"0229 質(zhì)粒載體構(gòu)建
A、將所述的UBQI-Nos-35Sbar _PGreen0229質(zhì)粒載體進(jìn)行酶切反應(yīng)，切除基因UBQI， 得到 Nos- 35Sbar -PGreen0229 質(zhì)粒載體 B
a.將所述的UBQI-Nos-35Sbar _PGreen0229質(zhì)粒載體進(jìn)行酶切反應(yīng)，切掉基因UBQI， 得到大小為8170bp左右的大片段G和2000bp左右的小片段H ；所述的酶切反應(yīng)中，使用限制性內(nèi)切酶Hind III ；
所述的酶切反應(yīng)中，酶切體系為=IOXbuffer : 2μ 1 ； Hind III :2 μ 1，質(zhì)粒10 μ 1， ddH20 ；6 μ 1 ；于 37°C反應(yīng) 3 小時；
圖5為以上酶切反應(yīng)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖5中，泳道M中為DNA Mark II，泳道1和泳道2中為酶切產(chǎn)物，條帶由上至下分別為大小約為8170bp左右的大片段G和2000bp左右的小片段H ；
b.對上述大小約為8170bp左右的大片段G進(jìn)行回收處理，再進(jìn)行連接反應(yīng)，得到Nos-35Sbar -PGreen0229 質(zhì)粒載體 B ；
所述的回收處理中，所用試劑盒為寶生物工程(大連)有限公司的DNA凝膠回收試劑盒，型號為DV805A ；
上述連接反應(yīng)中，連接體系為10 X buffer 1 μ 1，大片段G :8 μ 1， T4DNA連接酶1μ 1 ； 16 °C連接過夜；
圖6為連接產(chǎn)物1 %瓊脂糖凝膠電泳圖；圖6中，泳道M中為Wide Range DNA Marker, 泳道1和泳道2中為連接產(chǎn)物大小為8170bp左右的大片段G ；
B、克隆水稻根特異性啟動子基因^rWS-々，并連接并連接到PMD18-Tsimple質(zhì)粒載體，得到EXP18-D-T質(zhì)粒載體
a.從水稻植株中提取水稻基因組DNA，再進(jìn)行PCR反應(yīng)，并引入酶切位點(diǎn)Hind III、 Spe I，得到帶有酶切位點(diǎn)Hind III、Spe I的水稻根特異性啟動子基因；所述的水稻植株的品種為日本晴,粳亞種flrj^a sativa ssp. japonica ；
所述的水稻根特異性啟動子基因雙iPAi-i 的序列(未引入Hind IILSpe I酶切位點(diǎn))為序列表中的SEQ ID No 4 ； 具體的操作為
取生長15天的水稻植株為材料，用CTAB法提取水稻基因組DNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到帶有酶切位點(diǎn)Hind III、Spe I的水稻啟動子基因EXP18-D ；
所述的 PCR 反應(yīng)的引物為序列為Upper 5-AAGCTTCAAGGCATGTCAAAGTC-3, Lower 5-ACTAGTGTTCCCCATTTCCTCTTAG-3 ；上述 PCR 反應(yīng)的體系為5Xbuffer :5μ 1，dNTP :2μ 1，弓 I 物2μ 1，水稻基因組 DNA 1 μ 1，PrimeSTAR 0. 25 μ 1，ddH20 14. 75 μ 1，上述PCR反應(yīng)的程序?yàn)?4°C預(yù)變性5 min ;98°C變性10 s，50°C退火15 s，72°C延伸2 min，共30個循環(huán)；72°C延伸IOmin ；4°C保存；
圖7為上述PCR反應(yīng)產(chǎn)物的1 %瓊脂糖凝膠電泳圖；圖7中，泳道M中為DNA Marker III， 泳道1和泳道2中為擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為1957bp的片段；
b.將所述的帶有酶切位點(diǎn)HindIII、Spe I的水稻啟動子基因EXP18-D與PMD18-T simple質(zhì)粒載體進(jìn)行連接反應(yīng)，得到EXP18-D-T質(zhì)粒載體；
c.將所述的EXP18-D-T質(zhì)粒載體通過熱激法轉(zhuǎn)化至所述的大腸桿菌E.coliDH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，再進(jìn)行振蕩培養(yǎng)處理、再進(jìn)行涂板處理，得到EXP18-D-T轉(zhuǎn)化平板；再將所述的EXP18-D-T轉(zhuǎn)化平板中的單菌落進(jìn)行菌液PCR反應(yīng)檢測，并制備得到含有EXP18-D-T質(zhì)粒載體的甘油菌，置于_20°C凍存。具體的操作為
取100 μ 1的E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞置于冰上自然融化；將6 μ 1的EXP18-D-T質(zhì)粒載體分別加入感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻后，冰浴靜置30分鐘。于42°C水浴，90s熱激，再置于冰上放置1 2分鐘；得到轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞；無菌環(huán)境下，向轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞中， 加入800 μ 1 LB液體培養(yǎng)基，370C 150rpm振蕩培養(yǎng)lh，得到振蕩培養(yǎng)物；取200 μ 1上述振蕩培養(yǎng)物涂布于含有氨芐青霉素(100mg/L)的LB瓊脂平板上；涂布均勻，置于室溫直至液體被完全吸收，得到轉(zhuǎn)化平板；從上述轉(zhuǎn)化平板上挑取若干生長狀況良好的單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，同時將挑取的單菌落于4ml含有Amp (100mg/L)的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)驗(yàn)證正確的為陽性克隆菌落培養(yǎng)物，吸取Iml過夜培養(yǎng)物，加入0. 5ml 50%甘油于1. 5ml離心管中，作為含有EXP18-D-T質(zhì)粒載體的甘油菌，置于_20°C凍存。圖8為上述菌液PCR反應(yīng)檢測產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖8中，M泳道為 Marker III，泳道1和泳道2中亮度最高的條帶為大小為1957bp的片段；
d.將所述的含有EXP18-D-T質(zhì)粒載體的甘油菌進(jìn)行復(fù)蘇處理、振蕩培養(yǎng)處理，質(zhì)粒提取處理，得到EXP18-D-T質(zhì)粒載體；
具體的操作為
挑取所述的含有EXP18-D-T質(zhì)粒載體的甘油菌，在含有氨芐青霉素(100mg/L)的LB 瓊脂平板上劃線，于37°C過夜培養(yǎng)；再挑取生長狀況良好的單菌落，在含有氨芐青霉素 (100mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C搖床培養(yǎng)過夜，得到含有EXP18-D-T質(zhì)粒載體的菌液；再將含有EXP18-D-T質(zhì)粒載體的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取處理，得到EXP18-D-T質(zhì)粒載體；所述的質(zhì)粒提取處理采用質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒，型號為DV801A，購自用寶生物工程(大連)有限公司；
C、用所述的EXP18-D-T質(zhì)粒載體和Nos- 35Sbar _PGreen0229質(zhì)粒載體B構(gòu)建 EXP18-D-PGM-0229 質(zhì)粒載體
a.將所述的EXP18-D-T質(zhì)粒載體進(jìn)行酶切反應(yīng)，得到大小約為2500bp的大片段I和約為1957bp的小片段J ；所述的酶切反應(yīng)中，使用限制性內(nèi)切酶HindIILSpe I ；
所述的酶切反應(yīng)中，酶切體系為IOXbuffer: 2μ 1 ； Hind III :1 μ 1，Spe I :1μ1， 質(zhì)粒10μ 1，ddH20 ；6 μ 1 ；于 37°C反應(yīng) 3 小時；
圖9為以上酶切反應(yīng)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖9中，泳道M中為DNA Marker III，泳道1中為酶切產(chǎn)物，條帶由上至下分別為大小約為2500bp的大片段I和大小約為1957bp的小片段J ；b.將所述的Nos-35Sbar -PGreen0229質(zhì)粒載體B載體進(jìn)行酶切反應(yīng)，得到大小約為 8040bp的大片段K;所述的酶切反應(yīng)中，使用限制性內(nèi)切酶HindIILSpe I ；
所述的酶切反應(yīng)中，酶切體系為=IOXbuffer : 2μ 1 ； HindIII :1 μ 1，Spe I :1μ1，質(zhì)粒10 μ 1，ddH20 ；6 μ 1 ；于 37°C反應(yīng) 3 小時；
圖10為以上酶切反應(yīng)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖10中，泳道M中為Wide Range DNA Marker,泳道1中為酶切產(chǎn)物，條帶為大小約為8040bp的大片段K ；
c.將所述的大小約為8040bp的大片段K與約為1957bp的小片段J進(jìn)行回收處理，再進(jìn)行連接反應(yīng)，得到EXP18-D-PGM-0229質(zhì)粒載體；
所述的連接反應(yīng)中，連接體系為10 X buffer 1 μ 1，大片段K 1 μ 1，小片段J :7 μ 1， T4DNA連接酶1μ 1 ； 16 °C連接過夜；
d.將所述的EXP18-D-PGM-0229質(zhì)粒載體通過熱激法轉(zhuǎn)化至所述的大腸桿菌E.coli BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，再進(jìn)行振蕩培養(yǎng)處理、再進(jìn)行涂板處理，得到EXP18-D-PGM-0229 質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化平板；再將所述的EXP18-D-PGM-0229質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化平板中的單菌落進(jìn)行菌液PCR反應(yīng)檢測，并制備得到含有EXP18-D-PGM-0229質(zhì)粒載體的甘油菌，置于_20°C凍存。 具體的操作參見步驟B-c。通過菌液PCR反應(yīng)和酶切反應(yīng)驗(yàn)證所述的EXP18-D-PGM-0229質(zhì)粒載體構(gòu)建正確
圖11為上述菌液PCR反應(yīng)檢測產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖11中，泳道M中為 DNA Marker III，泳道1、2中為擴(kuò)增產(chǎn)物，亮度最高的條帶為大小約為1957的片段；
上述菌液PCR呈陽性的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取處理，再采用Hind III、Spe I限制性內(nèi)切酶對該質(zhì)粒進(jìn)行酶切反應(yīng)檢測；
圖12為酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖12中，泳道M中為DNA Marker III，泳道 1、2、3中為擴(kuò)增產(chǎn)物，最下面的條帶為大小約為1957的小片段J ；
e.將含有EXP18-D-PGM-0229質(zhì)粒載體的甘油菌進(jìn)行復(fù)蘇處理、振蕩培養(yǎng)處理，質(zhì)粒提取處理，得到EXP18-D-PGM-0229質(zhì)粒載體；具體的操作為具體的操作參見步驟B_d。D、克隆水通道蛋白基因ZMPIP2a，并連接到PMD18-T simple質(zhì)粒載體，得到 ZMPIP2a-T質(zhì)粒載體
a.從玉米植株中提取玉米基因組DNA，再進(jìn)行PCR反應(yīng)，并引入酶切位點(diǎn)Spe I， Not I，得到帶有酶切位點(diǎn)Spe I , Not I的水通道蛋白基因ZMPIP2a ；所述的玉米植株的品種為中農(nóng)99 ；所述的水通道蛋白基因ZMPIP2a序列(未引入Spe I , Not I酶切位點(diǎn))的序列為序列表中的SEQ ID No 5 ； 具體的操作為
取生長15天的玉米植株為材料，用CTAB法提取玉米基因組DNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到帶有酶切位點(diǎn)Spe I ,Not I的水通道蛋白基因ZMPIP2a ； 所述的PCR反應(yīng)的引物為序列為 Upper 5—ACTAGT GCACAGCAAGTCTCACCAG—3， Lower 5—GCGGCCGC GGCAACCAACGACGACAGG—3 ；
上述PCR反應(yīng)的體系為5Xbuffer :5μ 1，dNTP :2μ 1，引物2 μ 1，玉米基因組DNA 1 μ 1，PrimeSTAR 0. 25 μ 1, ddH20 14. 75 μ 1，上述PCR反應(yīng)的程序?yàn)?4°C預(yù)變性5 min;98°C變性10 s，50°C退火15 s，72°C延伸 lmin，共30個循環(huán)；72°C延伸IOmin ；4°C保存；
圖13為上述PCR反應(yīng)產(chǎn)物的1 %瓊脂糖凝膠電泳圖；圖13中，泳道M中為DNA Marker II，泳道1中為擴(kuò)增產(chǎn)物，大小約為999bp的片段；
b.將上述帶有酶切位點(diǎn)SpeI ,Not I的水通道蛋白基因ZMPIP2a與PMD18-T simple 質(zhì)粒載體進(jìn)行連接反應(yīng)，得到ZMPIP2a-T質(zhì)粒載體；
c.將所述的ZMPIP2a_T質(zhì)粒載體通過熱激法轉(zhuǎn)化至所述的大腸桿菌E.coliDH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，再進(jìn)行振蕩培養(yǎng)處理、再進(jìn)行涂板處理，得到EXP18-D-T轉(zhuǎn)化平板；再將所述的ZMPIP2a-T轉(zhuǎn)化平板中的單菌落進(jìn)行菌液PCR反應(yīng)檢測并制備得到含有ZMPIP2a_T質(zhì)粒載體的甘油菌，置于_20°C凍存。具體的操作為
取IOOul的E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞置于冰上自然融化；將6ul的ZMPIP2a_T質(zhì)粒載體分別加入感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻后，冰浴靜置30分鐘。于42°C水浴，90s熱激，再置于冰上放置1 2分鐘；得到轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞；無菌環(huán)境下，向轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞中，加入800ul LB液體培養(yǎng)基，370C IOOrpm振蕩培養(yǎng)lh，得到振蕩培養(yǎng)物；
取200ul上述振蕩培養(yǎng)物涂布于含有氨芐青霉素(100mg/L)的LB瓊脂平板上；涂布均勻，置于室溫直至液體被完全吸收，得到轉(zhuǎn)化平板；從上述轉(zhuǎn)化平板上挑取若干生長狀況良好的單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，同時將挑取的單菌落于4ml含有Amp (100mg/L)的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)驗(yàn)證正確的為陽性克隆菌落培養(yǎng)物，吸取Iml過夜培養(yǎng)物，加入0. 5ml 50%甘油于1. 5ml離心管中，作為含有ZMPIP2a-T質(zhì)粒載體的甘油菌，置于_20°C凍存。圖14為上述菌液PCR反應(yīng)檢測產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖14中，M泳道為 Marker II，泳道1_3中亮度最高的條帶為大小約為999bp的片段；
d.將含有ZMPIP2a-T質(zhì)粒載體的甘油菌進(jìn)行復(fù)蘇處理、振蕩培養(yǎng)處理，質(zhì)粒提取處理， 得到EXP18-D-T質(zhì)粒載體；
具體的操作為
挑取所述的含有ZMPIP2a-T質(zhì)粒載體的甘油菌，在含有氨芐青霉素(100mg/L)的LB 瓊脂平板上劃線，于37°C過夜培養(yǎng)；再挑取生長狀況良好的單菌落，在含有氨芐青霉素 (100mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C搖床培養(yǎng)過夜，得到含有ZMPIP2a_T質(zhì)粒載體的菌液；再將含有ZMPIP2a-T質(zhì)粒載體的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取處理，得到ZMPIP2a_T質(zhì)粒載體；所述的質(zhì)粒提取處理采用質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒，型號為DV801A，購自用寶生物工程(大連)有限公司；
E、用所述的ZMPIP2a-T質(zhì)粒載體和EXP18-D-PGM-0229質(zhì)粒載體構(gòu)建EXP18-D-ZMPIP2a-PGM-0229質(zhì)粒載體，即為所述的根特異啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因ZMPIP2a表達(dá)載體
a.將所述的ZMPIP2a-T質(zhì)粒載體進(jìn)行酶切反應(yīng)，得到大小約為2500bp的大片段L和約為999bp的小片段M ；所述的酶切反應(yīng)中，使用限制性內(nèi)切酶Spe I , Not I ；
所述的酶切反應(yīng)中，酶切體系為IOXbuffer: 2μ 1 ； Not I :1μ l,Spe I :1μ1，質(zhì)粒10 μ 1，ddH20 ；6 μ 1 ；于 37°C反應(yīng) 3 小時；
圖15為以上酶切反應(yīng)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖15中，泳道M中為DNAMarker III，泳道1_2中為酶切產(chǎn)物，條帶由上至下分別為大小約為2500bp的大片段L和約為999bp的小片段Μ;
b.將所述的EXP18-D-PGM-0229質(zhì)粒載體進(jìn)行酶切反應(yīng)，得到大小約為IOOOObp的大片段N;所述的酶切反應(yīng)中，使用限制性內(nèi)切酶Spe I ,Not I ；
所述的酶切反應(yīng)中，酶切體系為=IOXbuffer 2μ 1 ； Not I :1μ 1, Spe I :1μ1，質(zhì)粒10 μ 1，ddH20 ；6 μ 1 ；于 37°C反應(yīng) 3 小時；
圖16為以上酶切反應(yīng)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖16中，泳道M中為Wide Range DNA Marker，泳道1_2中為酶切產(chǎn)物，條帶為大小約為IOOOObp的大片段N ；
c.將所述的大小約為999bp的小片段M與大小約為IOOOObp的大片段N進(jìn)行回收處理，再進(jìn)行連接反應(yīng)，得到EXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229質(zhì)粒載體；
所述的連接反應(yīng)中，連接體系為10Xbuffer :1 μ 1，大片段N :1 μ 1 :小片段Μ:7μ 1， T4DNA連接酶1μ 1 ； 16 °C連接過夜；
d.將所述的EXP18-D-ZMPIP2a-PGM-0229質(zhì)粒載體通過熱激法轉(zhuǎn)化至所述的大腸桿菌E. coli BL2KDE3)感受態(tài)細(xì)胞中，再進(jìn)行振蕩培養(yǎng)處理、再進(jìn)行涂板處理，得到質(zhì)粒載體 EXP18-D-ZMPIP2a-PGM-0229 轉(zhuǎn)化平板；再將所述的 EXP18-D-ZMPIP2a-PGM_0229 質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化平板中的單菌落進(jìn)行菌液PCR反應(yīng)檢測，并制備得到含有EXP18-D-ZMPIP2a-PGM-0229 質(zhì)粒載體的甘油菌，置于_20°C凍存。具體的操作參見步驟B-c。通過菌液PCR反應(yīng)和酶切反應(yīng)驗(yàn)證所述的EXP18-D-ZMPIP2a-PGM_0229質(zhì)粒載體構(gòu)建正確
圖17為上述菌液PCR反應(yīng)檢測產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖17中，泳道M中為 DNA Marker II，泳道1、2中為擴(kuò)增產(chǎn)物，條帶為大小為999bp左右的片段；
上述菌液PCR呈陽性的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取處理，再采用Not I ,Spe I限制性內(nèi)切酶對該質(zhì)粒進(jìn)行酶切反應(yīng)檢測；
圖18為酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖18中，泳道M中為Wide Range DNA Marker，泳道1_4中為酶切產(chǎn)物，條帶由上至下分別為大小約IOOOObp左右的大片段N和約為999bp的小片段Μ;
e.將含有EXP18-D-ZMPIP2a-PGM_0229質(zhì)粒載體的甘油菌進(jìn)行復(fù)蘇處理、振蕩培養(yǎng)處理，質(zhì)粒提取處理，得到EXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229質(zhì)粒載體，即為所述的根特異啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因ZMPIP2a表達(dá)載體；
具體的操作為具體的操作參見步驟B-d。圖1 實(shí)施例1中，EXP18-D- ZMPIP2a_PGM_0229質(zhì)粒載體的簡III、將所述的EXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入擬南芥，得到有抗旱性的擬南芥植株。A、通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花粉管通道法將所述的EXP18-D- ZMPIP2a-PGM_0229質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染擬南芥；
試驗(yàn)材料擬南芥(Arabidopsis thaliana)為Columbia-O野生型，菌株與質(zhì)粒大腸桿菌(Esche-richia coli^DH^a 菌株、農(nóng)桿菌(Agrobacterium turnefaciens)EHA105 (GV3101)菌株；
主要試劑70%消毒酒精、漂白消毒劑(50%家用漂白劑、50 %無菌水、0. 05%Tween-20)、Silwet L-77、蔗糖(試劑級)、葡萄糖(試劑級)、食用蔗糖、甘露醇等；
培養(yǎng)基
LB 培養(yǎng)基 1L:10 g 胰蛋白胨(Tryptone) ；5 g 酵母提取物(Yeast Extract) ；5 g NaCl ；
滲透培養(yǎng)基5% 蔗糖，0. 3%-0. 5% Silwet L-77，PH 5. 7 ； 篩選培養(yǎng)基1 / 2MS ;8 g / L 瓊脂；50 μ g Kan ；pH 5. 8。(a).擬南芥的培養(yǎng)與處理
將春化3 4 d的擬南芥種子播種于用PNS (Plant Nutrition Solution)培養(yǎng)液浸濕的人工土中(腐殖土 蛭石=1 :1)，并用保鮮膜罩上，置于人工培養(yǎng)室中光照培養(yǎng)，1個月后揭膜(培養(yǎng)室條件相對濕度70%，恒溫(23士2) °C，光照強(qiáng)度4 000 lx，光照周期為黑暗 8 h、光照16 h)；待植物培養(yǎng)至初生花序約5 15 cm、次生花序剛剛形成花芽狀時，去除初生花序，有益于次生花序的生長發(fā)育，便于滲透轉(zhuǎn)化；滲透轉(zhuǎn)化處理應(yīng)在去除初生花序3 5 d內(nèi)完成；并且在滲透轉(zhuǎn)化的前1 d植物需充分澆水，以便植物氣孔在轉(zhuǎn)化時充分張開；
(b).菌液的培養(yǎng)將制備好的已轉(zhuǎn)化了6種EXP18D啟動子缺失體GUS表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液10mL，在轉(zhuǎn)化前1 d晚上，轉(zhuǎn)入大瓶過夜培養(yǎng)；第2天取出使用時農(nóng)桿菌液0D600 為約2. 0 ；于室溫離心處理(5000rpm，15 min),棄上清液，將農(nóng)桿菌沉淀懸浮于約3倍體積的滲透培養(yǎng)液中，使0D600在0. 8左右；
(c).農(nóng)桿菌侵染擬南芥花序?qū)⒅参锏牡厣喜糠纸朕r(nóng)桿菌懸浮液中侵染15秒；或用膠頭滴管吸取農(nóng)桿菌懸浮液一滴一滴對每朵花進(jìn)行侵染；再用保鮮膜將侵染過的植物 (TO代植物)罩起來以保持濕度，置人培養(yǎng)室中暗培養(yǎng)10 h，然后置于正常培養(yǎng)條件，2 3 d后可去掉保鮮膜；轉(zhuǎn)化后1周左右方可澆水，并定期繼續(xù)侵染幾次，繼續(xù)培養(yǎng)至植物成熟， 收種子(Tl代)放在干燥環(huán)境中1周左右，即可篩選到轉(zhuǎn)化子；
(d).擬南芥Tl代種子的篩選將Tl代種子先用70%的酒精浸泡消毒，再用漂白消毒劑溶液處理；消毒后的種子均勻地涂布在篩選培養(yǎng)基表面，于4°C放置2 3 d后，移至人工培養(yǎng)室中培養(yǎng)；然后將確定的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)入土壤中培養(yǎng)至成熟，收獲種子(T2代種子)；
(e).將上述T2代種子按照(d)中的方法進(jìn)行篩選、培養(yǎng)，收獲T3代種子；
(f).將上述T3代種子經(jīng)過兩次篩選得到T3代純合種子，消毒后在MS培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到T3代擬南芥轉(zhuǎn)化體植株；
b.將所述的T3代擬南芥轉(zhuǎn)化體植株與野生型，及已證明具有抗旱作用的突變體eW 進(jìn)行比較；
(a).將以上各種種子消毒后，在MS培養(yǎng)基培養(yǎng)10天時，觀察擬南芥植株根長；
圖19為培養(yǎng)10天時的擬南芥植株根長的對比圖；圖19中，通過比較可見，EXP18-D-ZMPIP2a-PGM-0229轉(zhuǎn)基因植株的根長明顯大于野生型植株。
(b).將以上各種種子消毒后，在蛭石與營養(yǎng)土為2:1的介質(zhì)中種植30天時，觀察擬南芥植株根長；
圖20為培養(yǎng)30天時的擬南芥植株根長的對比圖；圖20中，通過比較可見， EXP18-D-ZMPIP2a-PGM-0229轉(zhuǎn)基因植株的根長明顯大于野生型植株。(c).以上各種種子在蛭石與營養(yǎng)土為2 1的介質(zhì)中種植30天時進(jìn)行干旱處理，方式為停止?jié)菜簧鲜龈珊堤幚磉M(jìn)行15天時，觀察各種擬南芥植株表型。圖21為進(jìn)行干旱處理后的擬南芥植株生長狀態(tài)的對比圖，分為上下兩部分，反映了同一盆野生型擬南芥植株和同一盆EXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229轉(zhuǎn)基因植株干旱處理之前和干旱處理第15天后的生長狀況；圖21中，通過比較可見，上述干旱處理15天后， EXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229轉(zhuǎn)基因植株均成活，野生型擬南芥植株均死亡。本實(shí)施例中，使用各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶均購自Takara公司；各種 Marker購自Takara公司；各種PCR反應(yīng)試劑盒購自Takara公司；DNA純化試劑盒、PMD18-T 質(zhì)粒載體試劑盒、PGreen0229質(zhì)粒載體試劑盒均購自Promega公司；DNA凝膠回收試劑盒型號為DV805A，購自寶生物工程(大連)有限公司；CTAB等其他常規(guī)生化試劑和試劑盒購自北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)公司和北京欣經(jīng)科生物技術(shù)公司。本實(shí)施例中，各種PCR引物合成和DNA測序工作均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。本實(shí)施例中，各種PCR反應(yīng)使用PTC-100 Peltier Thermal Cycler基因擴(kuò)增儀， 購自MJ Research Inc公司；所述的瓊脂糖凝膠電泳使用UVP Gel Documentation凝膠分析系統(tǒng)，購自基因公司；所述的瓊脂糖凝膠電泳使用DYCP-31DN電泳儀，購自北京六一儀器公司。本實(shí)施例中，采用的DNA提取、PCR、酶切、連接、轉(zhuǎn)化等基因工程基本操作方法記載于各個試劑盒的說明書中；上述基本操作方法也可以參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版》中 ((美〕J.薩姆布魯克等著，科學(xué)出版社，2002年出版)，和《植物基因工程原理與技術(shù)》中(王關(guān)林，方宏筠著，科學(xué)出版社，1998)。
權(quán)利要求
1.一種根特異啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因ZiTTT^3表達(dá)載體，其特征在于所述的根特異啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因ZMPIP23表達(dá)載體的出發(fā)載體為PGreen0229質(zhì)粒載體， 所述的根特異啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因ZMPIP2a表達(dá)載體的啟動子是水稻根特異性啟動子基因EXP18-D，所述的水稻根特異性啟動子基因i^WS-i 的下游包含有水通道蛋白基齒 ZMPIP2a。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的根特異啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因ZiTTT^3表達(dá)載體，其特征在于所述的水稻根特異性啟動子基因擬々的序列為序列表中的SEQ ID No:4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的根特異啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因ZiTTT^3表達(dá)載體， 其特征在于所述的水通道蛋白基因ZMY/^a的序列為序列表中的SEQ ID No :5。
4.一種根特異啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因ZiTTT^3表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于所述的根特異啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因ZiTTT^3表達(dá)載體的出發(fā)載體為 PGreen0229質(zhì)粒載體，所述的根特異啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因ZiTTT^3表達(dá)載體的啟動子是水稻根特異性啟動子基因AXWS-々，所述的水稻根特異性啟動子基因i^iPM-i 的下游包含有水通道蛋白基因ZMPIP2ei ；所述的根特異啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因ZMPIP2a表達(dá)載體的構(gòu)建方法包括以下步驟I、UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229 質(zhì)粒載體構(gòu)建A、將基因35Sbar連接到PGreen0229質(zhì)粒載體，得到35Sbar-PGreen0229質(zhì)粒載體；B、將基因Nos連接到所述的35Sbar-PGreen0229質(zhì)粒載體，得到Nos- 35Sbar -PGreen0229質(zhì)粒載體；C、將基因UBQI連接到所述的Nos-35Sbar-PGreen0229質(zhì)粒載體，得到UBQI-Nos-35Sbar -PGreen0229 質(zhì)粒載體；IKEXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229 質(zhì)粒載體構(gòu)建；A、將所述的UBQI-Nos-35Sbar _PGreen0229質(zhì)粒載體進(jìn)行酶切反應(yīng)，切除基因UBQI， 得到 Nos- 35Sbar -PGreen0229 質(zhì)粒載體 B B、克隆水稻根特異性啟動子基因E)(P18-D，并連接到PMD18-Tsimple質(zhì)粒載體，得到 EXP18-D-T質(zhì)粒載體；C、用所述的EXP18-D-T質(zhì)粒載體和Nos-35Sbar _PGreen0229質(zhì)粒載體B構(gòu)建 EXP18-D-PGM-0229 質(zhì)粒載體；D、克隆水通道蛋白基因ZMPIP2a，并連接到PMD18-Tsimple質(zhì)粒載體，得到ZMPIP2a_T 質(zhì)粒載體；E、用所述的ZMPIP2a-T質(zhì)粒載體和EXP18-D-PGM-0229質(zhì)粒載體構(gòu)建EXP18-D-ZMPIP2a-PGM-0229質(zhì)粒載體，即為所述的啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因ZMPIP2ei表達(dá)載體。
5.據(jù)權(quán)利要求4所述的根特異啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因ZiTTT^3表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于所述的基因35Sbar的序列包含在序列表中的SEQ ID No :1中。
6.據(jù)權(quán)利要求4或5所述的根特異啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因ZiTTT^3表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于所述的基因Nos的序列包含在序列表中的SEQ ID No :2中。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種根特異啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因ZMPIP2a表達(dá)載體及構(gòu)建方法。所述的根特異啟動子驅(qū)動水通道蛋白基因ZMPIP2a表達(dá)載體的出發(fā)載體為PGreen0229質(zhì)粒載體，并包含有水稻根特異性啟動子基因EXP18-D和水通道蛋白基因ZMPIP2a。因?yàn)楸景l(fā)明的表達(dá)載體采用水稻根特異性啟動子基因EXP18-D做為啟動子，驅(qū)動水通道蛋白基因ZMPIP2a的表達(dá)，所以該表達(dá)載體具有特定地改變植物的根部形態(tài)、獲得相應(yīng)的抗旱植株潛力轉(zhuǎn)入該啟動子的植株，在同等干旱條件下，存活率比相比對照組的野生型植株高60-70％。
文檔編號C12N15/66GK102433355SQ20111037312
公開日2012年5月2日 申請日期2011年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月22日
發(fā)明者李冰冰, 李自超, 李金杰, 梁莉艷, 賈文鎖, 趙艷俠 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)