專利名稱：細胞凋亡的特異性量化檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種細胞凋亡的特異性量化檢測技術(shù)。
背景技術(shù)：
細胞凋亡是一個受到嚴密調(diào)控的通路，其目的在于當(dāng)機體處于一系列包括腫瘤壓力的生物學(xué)過程時，清除機體不需要的細胞。因此，當(dāng)機體的正常細胞凋亡途徑出現(xiàn)紊亂時，凋亡異常調(diào)控就成為了腫瘤發(fā)生的一個主要機理。更重要的是，細胞凋亡的水平已經(jīng)不僅成為了檢測癌癥治療效果的強有力標(biāo)記，也成為了預(yù)測臨床治療預(yù)后的重要標(biāo)記。因此， 更精確的細胞凋亡檢測技術(shù)的開發(fā)就成為了腫瘤生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)中一個關(guān)鍵的必要環(huán)節(jié)。原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)是用于檢測凋亡細胞中的原位DNA降解的常用方法，其原理在于核染色質(zhì)的斷裂是細胞凋亡晚期的標(biāo)志之一，會導(dǎo)致DNA雙鏈產(chǎn)生大量 3'-羥基末端，因此可以利用這個性質(zhì)來鑒定凋亡細胞。具體做法是通過熒光標(biāo)記的脫氧鳥苷酸(F-dUTP)對DNA斷裂處進行標(biāo)記來鑒定的。脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)可以利用DNA鏈上暴露的3'-羥基末端催化不依賴模板的脫氧核苷酸到雙鏈DNA或者單鏈DNA 的3'-羥基末端從而生成雙鏈DNA。另外，脫氧胸腺嘧啶核苷類似物5-溴代-2'-脫氧鳥苷5 ‘-三磷酸(BrdUTP)也適用于TdT反應(yīng)來標(biāo)記斷裂位點。BrdU —結(jié)合到DNA中，就可以通過一種抗BrdU抗體通過免疫組化技術(shù)進行檢測。非凋亡細胞就沒有結(jié)合大量F-dUTP 的能力，因為這類細胞缺少暴露的DNA 3'-羥基末端。然而，近年來隨著細胞凋亡技術(shù)的發(fā)展，對TUNEL技術(shù)的精確性出現(xiàn)了越來越多的爭論，主要原因在于這項技術(shù)會錯誤地將壞死細胞也標(biāo)記為凋亡細胞，例如原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)不能區(qū)分細胞凋亡、細胞壞死和細胞自溶。近年來已經(jīng)有一些改善原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)的敏感性和非特異性的研究進展。例如，細胞經(jīng)過微波輻照預(yù)處理緊隨著蛋白酶K進行消化處理后，檢測結(jié)果顯示可以大大改善檢測的敏感性和特異性。然而，這些改善僅在正在培養(yǎng)的細胞中起作用，而對檢測細胞凋亡、細胞壞死和組織切片等引起的非特異性DNA斷裂不起任何作用。利用形態(tài)學(xué)分析方法去辨認凋亡細胞確實可以幫助改善特異性，但是這使得整個過程費時又費力。而且， 細胞凋亡形態(tài)的評定是一個主觀性的鑒定過程。所以，迫切需要一種可以特異性地檢測和測量由于凋亡特異性的DNA片段碎裂而不是由壞死或者非特異性斷裂引起的DNA片段碎裂的技術(shù)方法。在腫瘤活組織檢查中，由腫瘤治療誘導(dǎo)的DNA片段碎裂已經(jīng)成為一種重要的預(yù)測腫瘤臨床反應(yīng)的標(biāo)志。因此，可以準確和可重復(fù)性地檢測凋亡特異性的DNA碎片的方法具有至關(guān)重要的作用。不幸的是，商業(yè)上可用的原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)不僅會檢測出由于細胞凋亡導(dǎo)致的DNA碎片，還會檢測出由組織切片引起的非特異性DNA斷裂產(chǎn)生的DNA片段碎裂，因此研發(fā)特異檢測細胞凋亡的技術(shù)具有十分重要的意義。本發(fā)明正基于以上的思路而來。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述問題的迫切性，本發(fā)明提供了一種新的凋亡檢測技木，該技術(shù)可以準確 并可重復(fù)地檢測凋亡特異性的DNA碎片斷裂。利用這種技術(shù)在腫瘤活組織檢測中可以提高 細胞凋亡檢測的準確性，從而可以預(yù)測治療效率和治療結(jié)果，它也將在臨床檢查和基礎(chǔ)實 驗研究中提高檢測細胞凋亡的特異性。
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是
ー種用于檢測細胞凋亡的細胞預(yù)孵育試劑盒，其特征在于所述細胞預(yù)孵育試劑盒
用于DNA的3'末端標(biāo)記的末端轉(zhuǎn)移酶(Terminal transferase, TdT)； 未進行標(biāo)記的雙脫氧核苷酸三磷酸(ddNTP)或三磷酸脫氧核糖核苷(dNTP)，用于 細胞膜通透后斷裂的DNA片段3'末端加入一個雙脫氧核苷酸三磷酸對(ddNTP)或三磷酸 脫氧核糖核苷對(dNTP)中的堿基而得到預(yù)先標(biāo)記。
優(yōu)選的，所述細胞預(yù)孵育試劑盒以其組分的反應(yīng)終濃度計為
包括:
IO-IOOmM ； I-IOOmM ；
I-IOOmM ； 0.I-IOmM ； 1-500U ； IO-IOOOUM ； 0.Ol-IOOnM0
優(yōu)選的，所述細胞預(yù)孵育試劑盒以其組分的反應(yīng)終濃度計為
KCl
Tris-HCl MgCl2
DTT, pH 7. 9 TdT
未標(biāo)記的dCTP 熒光標(biāo)記的dUTP
優(yōu)選的，所述細胞預(yù)孵育試劑盒以其組分的反應(yīng)終濃度計為



KCl
Tris-HCl MgCl2
DTT, pH 7. 9 TdT
未標(biāo)記的ddCTP 熒光標(biāo)記的dUTPIO-IOOmM ； I-IOOmM ； I-IOOmM ； 0.I-IOmM ； 1-500U ； I-IOOnM ； 0. Ol-IOOnM0
KClTris-HCl50mM ； 20mM ；IOmM ； ImM ； 50U ；
IO-IOOOUM ； 0. OHOOnM。
優(yōu)選的，所述雙脫氧核苷酸三磷酸(ddNTP)選自ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP的一 種，且ddNTP的反應(yīng)終濃度為500 U M ；所述三磷酸脫氧核糖核苷(dNTP)選自dATP、dGTP、 dCTP、dTTP的ー種；且dNTP的反應(yīng)終濃度為10nM。
MgCl2
DTT, pH 7. 9 TdT
未標(biāo)記的ddCTP 熒光標(biāo)記的dUTP
本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用所述的細胞預(yù)孵育試劑盒進行檢測細胞凋亡的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)將待檢測細胞在具有所述的細胞預(yù)孵育試劑盒的條件下在離體培養(yǎng)液中進行預(yù)孵育，預(yù)孵育的溫度為37°C，孵育時間為1小時，在進行孵育的同時對待檢測細胞進行細胞膜通透化處理；(2)在孵育后的待檢測細胞離體培養(yǎng)液中加入熒光標(biāo)記的dUTP進行末端脫氧核苷?；D(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP切口末端標(biāo)記(TUNEL試驗)，dUTP終濃度為IOnM ；(3)檢測孵育后的待檢測細胞中熒光標(biāo)記信號強度；通過檢測得到的熒光標(biāo)記信號強度和確定待檢測細胞中細胞凋亡狀況。優(yōu)選的，所述方法中待檢測細胞為HT-29細胞，所述熒光標(biāo)記信號強度通過激光掃描細胞流式儀(LSC)來測定。優(yōu)選的，所述方法步驟⑴中采用的細胞膜通透化處理的試劑為DNaseI和Triton X-100 ；先用5 20 μ g/ml的DNase I進行待檢測細胞的孵育后，用0. 1 1 % Triton X-100 對細胞膜脂質(zhì)進行溶解處理，處理時間為10分鐘，處理溫度為37°C。優(yōu)選的，所述方法步驟(2)中熒光標(biāo)記的dUTP為Cy5_dUTP或FITC_dUTP。本發(fā)明的又一目的在于提供一種所述的細胞預(yù)孵育試劑盒在檢測細胞凋亡方面的應(yīng)用。優(yōu)選的，本發(fā)明中所述細胞預(yù)孵育試劑盒的反應(yīng)緩沖液部分可以通過 IXNEBuffer 4進行調(diào)配。優(yōu)選的，所述末端轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)終濃度為50U(單位)。優(yōu)選的， 所述試劑盒中雙脫氧核苷酸三磷酸(ddNTP)的反應(yīng)終濃度為500 μ M ；或者所述試劑盒中三磷酸脫氧核糖核苷(dNTP)的反應(yīng)終濃度為ΙΟηΜ。
Tris-HCl MgCl2
DTT, pH 7. 9 TdT ddCTP Cy5-dUTP
本發(fā)明優(yōu)選的細胞預(yù)孵育試劑盒為以下組份和含量 KClIO-IOOnM ；
I-IOOmM ； I-IOOmM ； 0.I-IOmM ； 1-500U ； ΙΟ-ΙΟΟΟμΜ ； 0.Ol-lOOnM。
在早期凋亡細胞中，其細胞膜仍然保持完整，但在溶胞作用下細胞在被裂解前就被巨噬細胞或者周圍細胞迅速吞噬。然而，細胞壞死是另一種細胞死亡過程，是典型的非半胱天冬酶依賴性過程，具有細胞膜通透性增加、細胞和細胞器增大的典型特征。凋亡細胞與壞死細胞不一樣，凋亡細胞保持了細胞膜的完整性，因此未標(biāo)記的ddCTP和TdT與細胞進行預(yù)孵育可以讓壞死細胞的DNA缺口得到預(yù)先標(biāo)記，隨后進行的熒光標(biāo)記的dUTP和TdT將只會在凋亡細胞中檢測到DNA斷裂而不會在壞死細胞中檢測到。本發(fā)明細胞凋亡檢測方法特異性高，它可以檢測凋亡誘導(dǎo)的DNA片段碎裂(而不是壞死或者組織切片導(dǎo)致的DNA碎片)。該檢測方法將不僅大大改善在研究中準確檢測細胞凋亡的發(fā)生，而且可以對腫瘤個性化治療提供更為可靠的指導(dǎo)原則。本發(fā)明的目的是開發(fā)一種更精確的細胞凋亡檢測技術(shù)本發(fā)明充分利用壞死細胞
6的膜缺陷特點，來達到特異性鑒定凋亡細胞的目的。未標(biāo)記的ddCTP(2' 3'-雙脫氧胞苷)和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)的預(yù)處理可以使得壞死細胞中的DNA斷裂處被標(biāo)記， 而對凋亡細胞和正常細胞則沒有標(biāo)記，因為這些細胞的細胞膜對那兩種分子都是不可透過的。這樣，預(yù)保溫步驟保證了細胞凋亡誘導(dǎo)的DNA片段碎裂被特異標(biāo)記，而細胞壞死或者非特異性組織切片引起的DNA碎片則不被標(biāo)記。本發(fā)明利用未標(biāo)記的ddCTP對細胞進行預(yù)孵育是區(qū)分非特異性DNA斷裂和細胞凋亡誘導(dǎo)的DNA斷裂的必要手段本發(fā)明對未標(biāo)記的ddCTP進行預(yù)孵育能夠阻斷對預(yù)先形成的DNA斷裂進行檢測，可以先進行末端脫氧核苷?；D(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP切口末端標(biāo)記實驗 (TUNEL)，然后再進行LSC分析；測量了 DNA斷裂的程度并與一個體外細胞系統(tǒng)進行了比較。本發(fā)明以HT-29細胞為例，預(yù)孵育未標(biāo)記的ddCTP (500 μ M)和TdT大大地降低了預(yù)先形成的DNA斷裂的檢出率。此定量觀察表明在預(yù)孵育未標(biāo)記的ddCTP (500 μ Μ)和 TdT的細胞中，與FITC相關(guān)的信號平均強度相對沒有進行預(yù)孵育的細胞下降了 73%。盡管 FITC-dUTP被廣泛的用于組織培養(yǎng)和活組織檢查，但是組織中的高自發(fā)熒光，尤其是FIFC 發(fā)射的波譜，使得判別信號和背景異常困難。為了克服這一難題，本發(fā)明優(yōu)選使用Cy5-dUTP 作為TdT底物的首選，因為Cy5發(fā)射的近紅外區(qū)在腫瘤活檢中只產(chǎn)生很淺的背景。如圖3 所示，與對未標(biāo)記的ddCTP和TdT沒有進行預(yù)孵育的細胞相比，在對未標(biāo)記的ddCTP和TdT 進行預(yù)孵育的細胞中，Cy5相關(guān)聯(lián)的信號下降了 55%。本發(fā)明還使用了 LSC(激光掃描細胞流式儀)來測定每個中心活組織檢查中腫瘤細胞處于細胞凋亡時期的百分比。為了便于分析，每個載玻片都放置在由電腦控制的自動化平臺上。被掃描的目的區(qū)域可以通過裝置上的顯微鏡進行視覺定位，腫瘤的區(qū)域可以通過Wincyte軟件進行繪制。載玻片掃描和細胞核波狀輪廓的構(gòu)建是通過氬激光器和紅色探測器(溴化丙啶)掃描完成的。FITC/Cy5陽性細胞是通過氬激光器和綠色探測器檢測到的。與流式細胞儀計數(shù)(熒光活化細胞分選系統(tǒng))相似，熒光強度相對水平被記錄在四象限散布圖中。一個陰性對照的載玻片用來測定每個樣品的分析門。用再定位在視覺上確定 FITC或Cy5陽性細胞。一旦門被設(shè)定，數(shù)據(jù)文件將自動進行處理從而測定FITC或Cy5陽性細胞在中心活組織檢查中的百分率。如圖3B所示，通過使用Cy5-dUTP和FITC-dUTP的末端脫氧核苷?；D(zhuǎn)移酶介導(dǎo)性dUTP切口末端標(biāo)記實驗，分別導(dǎo)致了 6648和6877的陽性計數(shù)。然而，ddCTP的預(yù)孵育緊接著成功的消除了非特異性DNA斷裂。總之，這些數(shù)據(jù)明確地表明，預(yù)孵育未標(biāo)記的ddCTP和TdT能夠阻斷通過隨后的熒光標(biāo)記的ddCTP和TdT對預(yù)先存在的DNA斷裂熒光標(biāo)記。因此，預(yù)孵育對于降低壞死細胞中由于膜破裂導(dǎo)致的DNA切口形成的信號是極為重要的。為了區(qū)別Cy5_dUTP和FITC-dUTP的特異性在量化細胞凋亡誘導(dǎo)的DNA斷裂中的作用，本發(fā)明還進行Cy5-dUTP、FITC-dUTP對腫瘤活組織檢查DNA斷裂特異性比較試驗。本發(fā)明通過上述檢測方法來比較使用Cy5-dUTP和FITC-dUTP測定在腫瘤活組織檢查中DNA 斷裂信號的強度。LSC(激光掃描細胞儀)可用來檢測Cy5-(或FITC-)陽性事件和中等熒光強度(MFI)的比率。中等熒光強度代表組織中熒光探針的總強度的均值。因此，陽性熒光事件和中等熒光強度之間的比率表明了測量的信噪比。如前所述，此項目標(biāo)的原理，即在末端脫氧核苷?；D(zhuǎn)移酶介導(dǎo)性dUTP切口末端標(biāo)記實驗中通用FITC-dUTP，在腫瘤活組織檢查產(chǎn)生自發(fā)熒光，并且由于對光漂白作用的敏感性從而會有相對不穩(wěn)定性。同時，Cy5是一個更加穩(wěn)定和低背景熒光探針，可以增強本發(fā)明檢測細胞凋亡相關(guān)DNA斷裂的特異性。因此Cy5-dUTP(圖4)在檢測方法中的信噪比顯著高于FITC-dUTP細胞凋亡試劑盒，這表明該細胞凋亡檢測方法提供了一個更具特異性的細胞凋亡檢測途徑。本發(fā)明使用的DNase I，即Deoxyribonuclease I，中文名稱為脫氧核糖核酸酶I， 是一種可以消化單鏈或雙鏈DNA產(chǎn)生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內(nèi)切酶。DNase I水解單鏈或雙鏈DNA后的產(chǎn)物，5‘端為磷酸基團，3'-端為羥基。DNase I活性依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價錳離子激活。鎂離子存在條件下，DNase I可隨機剪切雙鏈DNA的任意位點；二價錳離子存在條件下，DNase I可在同一位點剪切DNA雙鏈，形成平末端，或1-2個核苷酸突出的粘末端。DNase I不含RNase (RNase free)，可以用于各種RNA樣品的處理。提供了用于 DNase I失活所需的EDTA。DNase I用于制備不含DNA的RNA樣品；RT-PCR反應(yīng)前RNA樣品中去除基因組DNA等可能的DNA污染；體外T7，T3，SP6等RNA Polymerases催化的RNA 轉(zhuǎn)錄后去除DNA模板；DNase I footprinting研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用；缺口平移(nick translatioin)；產(chǎn)生DNA隨機片斷文庫；細胞凋亡TUNEL檢測中部分剪切基因組DNA作為陽性對照。DNase I來源于牛胰腺，經(jīng)從牛胰腺純化得到。如需對酶進行稀釋，可以用酶儲存液(50mM Tris-acetate(pH 7. 5), IOmM CaCl2, 50% (v/v) glycerol)進行稀釋。Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)是一種非離子型表面活性劑(或稱去污劑)。分子量為646. 86 (C34H62O11)。它能溶解脂質(zhì)，以增加抗體對細胞膜的通透性。免疫細胞化學(xué)中Triton X-100常用濃度為和0. 3%，其中的Triton X-100常用于漂洗組織標(biāo)本，0. 3%的Triton X-100則常用于稀釋血清，0. 的Triton X-100常用于LAMP (環(huán)介導(dǎo)等溫擴增)，配制BSA等。但通常是先配制成30%的Triton X_100儲備液，臨用時稀釋至所需濃度。


下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述圖1為本發(fā)明試劑盒檢測細胞凋亡的DNA斷裂的方法和TUNEL方法的流程比較；圖2為不同濃度ddCTP預(yù)孵育(預(yù)先在DNA斷裂出進行block處理)對HT-29細胞中平均熒光強度(MFI)的影響；圖3為未進行ddCTP預(yù)孵育和采用ddCTP預(yù)孵育對HT-29細胞中熒光標(biāo)記dUTP 的影響；圖4為利用Cy5_dUTP通過采用本發(fā)明的方法與傳統(tǒng)TUNEL方法檢測人腫瘤活組織中DNA的斷裂情況的微觀照片；綠色為細胞核，紅色為DNA片段；圖5為利用Cy5_dUTP通過采用本發(fā)明的方法與傳統(tǒng)TUNEL方法檢測人腫瘤活組織中細胞核和DNA的斷裂情況比較；綠色為細胞核，紅色為DNA片段；圖6為采用不同熒光標(biāo)記的dUTP對本發(fā)明的方法以及傳統(tǒng)TUNEL方法檢測人腫瘤活組織中DNA的斷裂情況的影響；其中上面一組為Cy5-dUTP ；下面一組為FITC-dUTP ；圖7為采用不同熒光標(biāo)記的dUTP對本發(fā)明的方法以及傳統(tǒng)TUNEL方法檢測人腫瘤活組織中DNA的斷裂情況的不同微觀照片；包括Cy5-dUTP、FITC-dUTP ；圖8為本發(fā)明試劑盒檢測細胞凋亡的DNA斷裂的方法和TUNEL方法的具體流程比
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例對上述方案做進一步說明 。應(yīng)理解，這些實施例是用于說明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做進一步調(diào)整，未注明的實施條件通常為常規(guī)實驗中的條件。實施例1細胞凋亡中斷裂的DNA片段選擇性標(biāo)記試驗在早期凋亡細胞中，其細胞膜仍然保持完整，但在溶胞作用下細胞在被裂解前就被巨噬細胞或者周圍細胞迅速吞噬。然而，細胞壞死是另一種細胞死亡過程，是典型的非半胱天冬酶依賴性過程，具有細胞膜通透性增加、細胞和細胞器增大的典型特征。因此，本實施例充分利用壞死細胞的膜缺陷特點，來達到特異鑒定凋亡細胞的目的。具體做法是將5X103/孔的HT-29細胞在37°C下用H2O2處理一小時，誘導(dǎo)細胞壞死；然后用PBS清洗，并在含10%FCS(胎牛血清)的培養(yǎng)基中進行孵育?；畹?X103/孔的 HT-29細胞然后加入到H2O2誘導(dǎo)的壞死細胞組中，接著用5Gy的、輻射或者IOOnM紫杉醇處理來誘導(dǎo)細胞凋亡。沒有經(jīng)任何處理的細胞被作為陰性對照組。HT-29細胞在細胞預(yù)孵育試劑盒的條件下(具體做法是將未熒光標(biāo)記的500 μ M ddCTP和5U TdT中加到細胞上)， 置于離體培養(yǎng)液中，37°C預(yù)孵育lh。未標(biāo)記的ddCTP(2' 3'-雙脫氧胞苷)和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)的預(yù)處理可以使得壞死細胞中的DNA斷裂處被標(biāo)記，而對凋亡細胞和正常細胞則沒有標(biāo)記，因為這些細胞的細胞膜對ddCTP分子是不可透過的(圖1)。然后， 再將5 μ M Cy5-dUTP和TdT加到細胞中，于37°C孵育30分鐘。這樣，由于壞死細胞已經(jīng)被 ddCTP標(biāo)記，Cy5-dUTP將只對凋亡細胞進行標(biāo)記。因此，預(yù)孵育的步驟保證了細胞凋亡誘導(dǎo)的DNA片段碎裂被特異熒光標(biāo)記，而細胞壞死或者非特異性組織切片引起的DNA碎片則不被特異熒光標(biāo)記。如圖1所示，本發(fā)明方法檢測了細胞凋亡的DNA斷裂，但不檢測來自壞死細胞的 DNA斷裂。正常細胞(N)在細胞核中沒有DNA斷裂，而壞死細胞(Nec)、凋亡細胞(Apo)有 DNA斷裂。凋亡細胞和壞死細胞在各自的細胞核內(nèi)都含有DNA斷裂。在壞死細胞中未標(biāo)記的dUTP和TdT預(yù)孵育標(biāo)記DNA斷裂。在細胞膜透化處理后，熒光探針偶聯(lián)(或稱標(biāo)記)的 dUTP和TdT在細胞核中標(biāo)記DNA斷裂。使用多種檢測系統(tǒng)，都表明本發(fā)明方法只檢測凋亡細胞的DNA斷裂。而TUNEL試驗檢測凋亡細胞和壞死細胞的DNA斷裂。實施例2檢測HT-29細胞中細胞凋亡情況用未標(biāo)記的ddCTP對細胞進行預(yù)孵育是區(qū)分非特異性DNA斷裂和細胞凋亡誘導(dǎo)的 DNA斷裂的必要手段。為了驗證本發(fā)明的假設(shè)即對未標(biāo)記的ddCTP進行預(yù)孵育能夠阻斷對預(yù)先形成的 DNA斷裂進行檢測，可以先進行末端脫氧核苷?；D(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP切口末端標(biāo)記實驗 (TUNEL)。也就是說，用DNase I處理細胞后(本發(fā)明采用了 HT-29細胞)，可以在細胞內(nèi)產(chǎn)生DNA斷裂，用常規(guī)TUNEL細胞凋亡檢測技術(shù)將會檢測出這種非細胞凋亡導(dǎo)致的DNA斷裂。 但是，經(jīng)過與ddCTP預(yù)孵育后，這種假陽性率顯著降低。具體操作如下HT-29細胞置于4孔載玻片(10000細胞/孔)中，先用10 μ g/L
CN 102382893 A
說明書6/9頁較圖。
9的DNase I于37°C孵育30分鐘后，用0. 2% Triton X-100對細胞在37°C條件下處理10分鐘，從而就可以產(chǎn)生通透的細胞膜和非特異性DNA片段。接下來，HT-29細胞在細胞預(yù)孵育試劑盒的條件下(將未熒光標(biāo)記的500 μ M ddCTP和5U TdT中加到細胞上)，置于離體培養(yǎng)液中，37°C預(yù)孵育lh。未標(biāo)記的ddCTP(2' 3'-雙脫氧胞苷)和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)的預(yù)處理可以使得壞死細胞中的DNA斷裂處被標(biāo)記，而對凋亡細胞和正常細胞則沒有標(biāo)記。然后，再將5μ M Cy5-dUTP和TdT加到細胞中，于37°C孵育30分鐘。這樣，由于壞死細胞已經(jīng)被ddCTP標(biāo)記，Cy5-dUTP將只對凋亡細胞進行標(biāo)記。從圖2和圖3上的數(shù)據(jù)可以看出，通過Cy5-dUTP和TdT來檢測HT-29細胞中DNA的斷裂情況。預(yù)孵育未標(biāo)記的 ddCTP (500 μ Μ)和TdT大大地降低了預(yù)先形成的DNA斷裂的檢出率。此LSC定量觀察表明在預(yù)孵育未標(biāo)記的ddCTP (500 μ Μ)和TdT的細胞中，與FITC相關(guān)的信號平均強度相對沒有進行預(yù)孵育的細胞下降了 73%。實施例3檢測腫瘤細胞中細胞凋亡情況為了證明在腫瘤活檢中此項技術(shù)同樣能夠用來檢測特異性DNA斷裂，將腫瘤組織切片包埋在載玻片上(這其中包括壞死的細胞)，對于組織切片，先進行如下處理1、脫蠟二甲苯脫蠟2次，每次5-10分鐘；乙醇水合(將脫蠟好的的切片依次放入 100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各2分鐘)2、把切片浸入PBS漂洗3次，每次5分鐘。3、橫放切片，在組織塊上加入蛋白酶K工作液，21-37°C作用15-30分鐘。(蛋白酶 K工作液的配制2 μ L 50X蛋白酶K+98yL PBS)4、把蛋白酶K處理好的樣本浸入PBS漂洗3次，每次5分鐘。5、把切片浸入封閉液中，室溫(15_25°C )封閉10分鐘。(封閉液的配制3% H2O2 溶于甲醇)6、把切片浸入PBS漂洗2次，每次5分鐘。緊接著將組織切片在未標(biāo)記的ddCTP和TdT中37°C預(yù)孵育lh，然后用Cy5_dUTP和 TdT進行溫育。免疫熒光顯微鏡使用的是裝配有窄通頻帶感光濾光片架的落射熒光顯微鏡， 這種熒光顯微鏡能夠通過滾輪來選擇紅色熒光和綠色熒光。圖像是使用低溫CCD相機來獲取的。如圖4所示，壞死的細胞被Cy5-dUTP末端脫氧核苷酰基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)性dUTP切口末端標(biāo)記深度染色，同時ddCTP能夠阻斷由非特異性DNA斷裂產(chǎn)生的信號。對經(jīng)γ射線治療的患者的頸腫瘤活組織用于DNA斷裂的檢測時，如圖4所示，其中Green = Nuc 1 ei細胞核，Red = DNA fragmentation DNA片段。包埋腫瘤組織脫蠟并固定。通過HeNe射線和紅外檢測器進行 LSC 分析，接著用 Cy5-dUTP 和 TdT (Cy5_dUTP (+TdT)) 37°C 孵育 Ih。用單獨的 Cy5_dUTP 孵育作為陰性對照。LSC分析結(jié)果上一組采用的Cy5-dUTP(博生吉醫(yī)藥科技(蘇州)有限公司)，方法條件是=PMT = 25，Thresh. = 2500 ；下一組采用的FITC-dUTP (Promega公司)，方法條件是PMT = 13，Thresh. = 1500。本發(fā)明還使用了 LSC(激光掃描細胞流式儀)來測定每個中心活組織檢查中腫瘤細胞處于細胞凋亡時期的百分比。每個載玻片都放置在由電腦控制的自動化平臺上。被掃描的目的區(qū)域可以通過裝置上的顯微鏡進行視覺定位，腫瘤的區(qū)域可以通過Wincyte軟件進行繪制。載玻片掃描和細胞核波狀輪廓的構(gòu)建是通過氬激光器和紅色探測器(溴化丙啶)掃描完成的。FITC/Cy5陽性細胞是通過氬激光器和綠色探測器檢測到的。與流式細胞儀計數(shù)(熒光活化細胞分選系統(tǒng))相似，熒光強度相對水平被記錄在四象限散布圖中。一個陰性對照的載玻片用來測定每個樣品的分析門。用再定位在視覺上確定FITC或Cy5陽性細胞。一旦門被設(shè)定，數(shù)據(jù)文件將自動進行處理從而測定FITC或Cy5陽性細胞在中心活組織檢查中的百分率。如圖5所示，通過Cy5-dUTP和TdT來檢測人腫瘤活組織中DNA的斷裂情況。通過使用Cy5-dUTP和FITC-dUTP的末端脫氧核苷酰基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)性dUTP切口末端標(biāo)記實驗，分別導(dǎo)致了 6648和6877的陽性計數(shù)。然而，ddCTP的預(yù)孵育緊接著成功的消除了非特異性DNA斷裂。圖6中Cy5熒光探針具有低背景特征，人類宮頸癌病檢標(biāo)本制備成石蠟切片后，經(jīng)過脫蠟和固定處理，分別與Cy5-dUTP和Cy5-dUTP+TdT，在37°C孵育1小時?？梢钥吹皆赥dT作用下Cy5-dUTP標(biāo)記上腫瘤細胞，而沒有TdT的存在時，Cy5表現(xiàn)出了極低的背景。實施例4檢測細胞凋亡情況時熒光標(biāo)記的優(yōu)化條件盡管FITC-dUTP被廣泛的用于組織培養(yǎng)和活組織檢查，但是組織中的高自發(fā)熒光，尤其是FIFC發(fā)射的波譜，使得判別信號和背景異常困難。為了克服這一難題，本實施例提供了比FITC-dUTP更高的腫瘤活組織檢查DNA斷裂特異性的Cy5_dUTP。Cy5_dUTP作為 TdT底物的優(yōu)越性是因為Cy5發(fā)射的近紅外區(qū)在腫瘤活檢中只產(chǎn)生很淺的背景。通過本實施例的方法來比較使用Cy5-dUTP和FITC-dUTP測定在腫瘤活組織檢查中DNA斷裂信號的強度。LSC (激光掃描細胞儀)可用來檢測Cy5-(或FITC-)陽性事件和中等熒光強度(MFI) 的比率。中等熒光強度代表組織中熒光探針的總強度的均值。因此，陽性熒光事件和中等熒光強度之間的比率表明了測量的信噪比。如前所述，此項目標(biāo)的原理，即在末端脫氧核苷?；D(zhuǎn)移酶介導(dǎo)性dUTP切口末端標(biāo)記實驗中通用FITC-dUTP，在腫瘤活組織檢查產(chǎn)生自發(fā)熒光，并且由于對光漂白作用的敏感性從而會有相對不穩(wěn)定性。同時，Cy5是一個更加穩(wěn)定和低背景熒光探針，可以增強本發(fā)明的方法檢測細胞凋亡相關(guān)DNA斷裂的特異性(圖7)。在具體實施時，參照實施例2和實施例3，唯一不同之處是將Cy5-dUTP用FTIC_dUTP來代替。圖8為本發(fā)明方法的具體流程圖；其中使用本發(fā)明的方法檢測凋亡誘導(dǎo)的而非壞死誘導(dǎo)的DNA斷裂，以此來檢測此試驗設(shè)計的可行性。細胞在本發(fā)明方法或TUNEL試驗處理后將用5Gy輻射劑量的、-射線(IR)，IOOnM的紫杉醇或H2O2處理。對于混合試驗，部分細胞用IR或紫杉醇處理后，部分細胞用H2O2處理，再與活細胞共孵育。正常細胞在細胞核中沒有DNA斷裂(藍色)；凋亡細胞和壞死細胞在細胞核內(nèi)都含有DNA斷裂(灰色)。在壞死細胞中未標(biāo)記的dUTP和TdT預(yù)孵育標(biāo)記DNA斷裂(綠色)。在細胞膜透化處理后，熒光探針偶聯(lián)(或稱標(biāo)記)的dUTP和TdT在細胞核中標(biāo)記DNA斷裂(紅色)。本發(fā)明方法進行的細胞凋亡試驗將只檢測凋亡細胞的DNA斷裂。相反，TUNEL試驗檢測凋亡細胞和壞死細胞的DNA斷裂?？傊?，通過與壞死細胞不一樣，凋亡細胞保持了細胞膜的完整性這一特點，本發(fā)明假設(shè)未標(biāo)記的ddCTP和TdT與細胞進行預(yù)孵育可以讓壞死細胞的DNA缺口得到預(yù)先標(biāo)記， 隨后進行的熒光標(biāo)記的dUTP和TdT將只會在凋亡細胞中檢測到DNA斷裂而不會在壞死細胞中檢測到?；谶@種假設(shè)，本發(fā)明研制了一種高特異性的分析技術(shù)，它可以檢測凋亡誘導(dǎo)的DNA片段碎裂(而不是壞死或者組織切片導(dǎo)致的DNA碎片)(圖8)。本發(fā)明方法應(yīng)用于凋亡檢測技術(shù)，將不僅大大改善在研究中準確檢測細胞凋亡的發(fā)生，而且可以對腫瘤個性化治療提供更為可靠的指導(dǎo)原則。
上述實例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人是能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測細胞凋亡的細胞預(yù)孵育試劑盒，其特征在于所述細胞預(yù)孵育試劑盒包括用于DNA的3’末端標(biāo)記的末端轉(zhuǎn)移酶(Terminal transferase, TdT)； 未進行標(biāo)記的雙脫氧核苷酸三磷酸(ddNTP)或三磷酸脫氧核糖核苷(dNTP)，用于細胞膜通透后斷裂的DNA片段3’末端加入一個雙脫氧核苷酸三磷酸對(ddNTP)或三磷酸脫氧核糖核苷對(dNTP)中的堿基而得到預(yù)先標(biāo)記。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測細胞凋亡的細胞預(yù)孵育試劑盒，其特征在于所述細胞預(yù)孵育試劑盒以其組分的反應(yīng)終濃度計為KCl 10-100 mM ； Tris-HCl 1-100 mM ； MgCl2 1-100 mM ； DTT, pH 7. 9 0. 1-10 mM ； TdT 1-500U ；未標(biāo)記的 ddCTP 10-1000 μ M ； 熒光標(biāo)記的dUTP 0. Ol-lOOnM。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測細胞凋亡的細胞預(yù)孵育試劑盒，其特征在于所述細胞預(yù)孵育試劑盒以其組分的反應(yīng)終濃度計為KCl 10-100 mM ； Tris-HCl 1-100 mM ； MgCl2 1-100 mM ； DTT, pH 7. 9 0. 1-10 mM ； TdT 1-500U ；未標(biāo)記的dCTP I-IOOnM ； 熒光標(biāo)記的dUTP 0. Ol-lOOnM。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測細胞凋亡的細胞預(yù)孵育試劑盒，其特征在于所述細胞預(yù)孵育試劑盒以其組分的反應(yīng)終濃度計為KCl 50 mM;Tris-HCl 20 mM ;MgCl2 10 mM ；DTT, pH 7. 9 ImM ；TdT 50U ；未標(biāo)記的 ddCTP 10-1000 μ M ；熒光標(biāo)記的 dUTP 0.Ol-lOOnM。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測細胞凋亡的細胞預(yù)孵育試劑盒，其特征在于所述雙脫氧核苷酸三磷酸(ddNTP)選自ddATP、ddGTP ,ddCTP,ddTTP的一種，且ddNTP的反應(yīng)終濃度為500 μ M ；所述三磷酸脫氧核糖核苷(dNTP)選自dATP、dGTP、dCTP、dTTP的一種；且 dNTP的反應(yīng)終濃度為10nM。
6.一種利用權(quán)利要求1 5任意一項所述的細胞預(yù)孵育試劑盒進行檢測細胞凋亡的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)將待檢測細胞在具有權(quán)利要求廣5任意一項所述的細胞預(yù)孵育試劑盒的條件下在離體培養(yǎng)液中進行預(yù)孵育，預(yù)孵育的溫度為37°C，孵育時間為1小時，在進行孵育的同時對待檢測細胞進行細胞膜通透化處理；(2)在孵育后的待檢測細胞離體培養(yǎng)液中加入熒光標(biāo)記的dUTP進行末端脫氧核苷酰基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP切口末端標(biāo)記(TUNEL試驗)，dUTP終濃度為IOnM ；(3)檢測孵育后的待檢測細胞中熒光標(biāo)記信號強度；通過檢測得到的熒光標(biāo)記信號強度和確定待檢測細胞中細胞凋亡狀況。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述方法中待檢測細胞為HT-29細胞，所述熒光標(biāo)記信號強度通過激光掃描細胞流式儀(LSC)來測定。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述方法步驟(1)中采用的細胞膜通透化處理的試劑為DNase I和Triton X-100 ；先用5 20 μ g/ml的DNase I進行待檢測細胞的孵育后，用0. Γ % Triton X_100對細胞膜脂質(zhì)進行溶解處理，處理時間為10分鐘，處理溫度為37°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述方法步驟(2)中熒光標(biāo)記的dUTP為 Cy5-dUTP 或 FITC-dUTP。
10.一種權(quán)利要求廣5任意一項所述的細胞預(yù)孵育試劑盒在檢測細胞凋亡方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測細胞凋亡的細胞預(yù)孵育試劑盒，其特征在于所述細胞預(yù)孵育試劑盒包括用于DNA的3'末端標(biāo)記的末端轉(zhuǎn)移酶(Terminaltransferase，TdT)；未進行標(biāo)記的雙脫氧核苷酸三磷酸(ddNTP)或三磷酸脫氧核糖核苷(dNTP)，用于細胞膜通透后斷裂的DNA片段3'末端加入一個雙脫氧核苷酸三磷酸對(ddNTP)或三磷酸脫氧核糖核苷對(dNTP)中的堿基而得到預(yù)先標(biāo)記。該方法提供了一個更具特異性的細胞凋亡檢測途徑。
文檔編號C12Q1/68GK102382893SQ20111037447
公開日2012年3月21日 申請日期2011年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月23日
發(fā)明者楊林 申請人:博生吉醫(yī)藥科技(蘇州)有限公司, 西安交通大學(xué)蘇州研究院