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      一種通過誘變提高紅霉素生產(chǎn)菌對正丙醇的耐受性的方法

      文檔序號:533175閱讀:432來源:國知局
      專利名稱:一種通過誘變提高紅霉素生產(chǎn)菌對正丙醇的耐受性的方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及一種生物工程領(lǐng)域、特別涉及一種通過微生物誘變手段提高紅霉素產(chǎn)量的方法。
      背景技術(shù)
      紅霉素屬大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,具有廣譜抗菌作用。對G+菌有強大抗菌作用,尤其對耐青霉素的金葡菌有效。對立克次體、支原體、螺旋體有較強的抑制作用。對阿米巴原蟲、滴蟲也有抑制作用。紅霉素是從紅霉素鏈霉菌的培養(yǎng)液中分尚出來的一種堿性抗生素,后來從發(fā)酵液中分離出來紅霉素A、B、C、D、E等組分,其中以紅霉素A為主要組分,抗菌活性強、且毒副作用較??;其它組分抗菌活性弱,而毒副作用又較A大。通常所稱的紅霉素即指紅霉素A及其鹽類。紅霉素是白色或類白色的結(jié)晶性粉末,微有吸濕性,味苦,易溶于醇類、丙酮、氯仿、酯類(如乙酯、丁酯、戊酯等),微溶于乙醚。紅霉素在水中極微溶解,其溶解度隨溫度的升高而減小,以55°C時為最小。紅霉素屬大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,大環(huán)內(nèi)酯抗生素生物合成途徑由三個基本步驟組成:糖苷配基的形成;糖部分的生物合成和終端反應。該終端反應包括糖的連接和大環(huán)內(nèi)酯中間體的一些細微變化。前體是指加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中的某些化合物,能被微生物直接結(jié)合到產(chǎn)物分子中去,而自身的結(jié)構(gòu)無多大變化,且具有促進產(chǎn)物合成的作用。在大環(huán)內(nèi)酯抗生素生物合成中,內(nèi)酯環(huán)的形成往往是限制性因素。已知內(nèi)酯環(huán)是以一些低級脂肪酸為前提單位所構(gòu)成的,這些脂肪酸前體物,有的不易被菌體合成,因而就成為抗生素形成的限制性因素。正丙醇在發(fā)酵過程中的作 用,一部分是用作合成紅霉內(nèi)酯,因而對紅霉素的合成顯刺激作用,還有一部分是消耗于其他代謝途徑和損失。在紅霉素發(fā)酵過程中,加正丙醇作為生物合成的前體物質(zhì),可增加紅霉素產(chǎn)量。但是,在發(fā)酵前期加入正丙醇會干擾菌絲生長,從而降低抗生素的合成,外源前提在發(fā)酵液中的殘留濃度過高,會使生產(chǎn)菌中毒,不利于抗生素的合成。但前體不足也不行。因此,解決這兩者之間的矛盾,一個比較好的辦法就是提高紅霉素生產(chǎn)菌對正丙醇的耐受性,從而提高菌體產(chǎn)素能力。

      發(fā)明內(nèi)容
      目前,提高紅霉素生產(chǎn)菌產(chǎn)紅霉素的能力,仍以誘變育種為主要手段。針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題,本發(fā)明提供一種通過誘變提高紅霉素生產(chǎn)菌對正丙醇的耐受性,從而提
      高紅霉素產(chǎn)量的方法。本發(fā)明的一種通過誘變提高紅霉素生產(chǎn)菌對正丙醇的耐受性的方法,其包括以下步驟:
      (1)將紅霉素生產(chǎn)菌在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng),培養(yǎng)7天后獲得新鮮成熟孢子;
      (2)將紅霉素生產(chǎn)菌新鮮成熟斜面制成孢子懸液,孢子量在IX IO6個/mL,取5mL孢子懸液移至培養(yǎng)皿中,于15W紫外線燈管和固定距離20cm照射3分鐘,誘變后進行梯度稀釋立即涂培養(yǎng)基平板;
      (3)挑取步驟(2)誘變后活菌落進行離子束輻照誘變:誘變溫度為25°C,誘變劑量為55Gy,誘變后進行梯度稀釋涂培養(yǎng)基平板初篩。挑單菌落至斜面培養(yǎng)基,34°C,培養(yǎng)7天,再經(jīng)搖瓶發(fā)酵方法進行復篩,所得突變菌即為對正丙醇具耐受性的高產(chǎn)紅霉素生產(chǎn)菌;
      (4)步驟(I)或步驟(3)斜面養(yǎng)基的配方為:可溶性淀粉6g,玉米漿7g,硫酸銨3g,氯化鈉3g,瓊脂粉20g,加水定容至1000ml,調(diào)pH值至7.2,分析純碳酸鈣2.5g。步驟(2)的平板培養(yǎng)基的配方為:可溶性淀粉6g,玉米漿7g,硫酸銨3g,氯化鈉3g,瓊脂粉20g,100%正丙醇15ml,加水定容至1000ml,調(diào)pH值至7.2,分析純碳酸鈣2.5g ;
      (5)步驟(3)平板培養(yǎng)基配方為:可溶性淀粉6g,玉米漿7g,硫酸銨3g,氯化鈉3g,瓊脂粉20g, 100%正丙醇20m l,加水定容至1000ml,調(diào)pH值至7.2,分析純碳酸鈣2.5g ;
      (6)步驟(3)的搖瓶發(fā)酵是將紅霉素生產(chǎn)菌在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)成熟的種子液接入發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基;
      (7)步驟(3)種子培養(yǎng)基配方為:玉米淀粉28g,糊精7g,中溫黃豆餅粉12.6g,硫酸銨1.2g,硝酸銨1.2g,氯化鈉3g,玉米楽;7.1g,分析純碳酸韓6g,豆油2ml,加水定容至1000ml,調(diào)pH值至7.0。種子液培養(yǎng)條件為:34°C, 220轉(zhuǎn)/分,振蕩培養(yǎng)42_46h ;
      (8)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:玉米淀粉18g,糊精24g,中溫黃豆餅粉18g,硫酸銨2g,輕質(zhì)碳酸1丐6g,豆油4ml, 100%正丙醇20ml,加水定容至1000ml,調(diào)pH值至7.0 ;
      (9)按照搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方配制搖瓶發(fā)酵液50mL,放入500mL帶擋板的三角瓶中;
      (10)將培養(yǎng)成熟的紅霉素生產(chǎn)菌種子液5mL接入發(fā)酵搖瓶中,340C,260轉(zhuǎn)/分,振蕩培養(yǎng)7天左右,得紅霉素,利用HPLC測定效價;
      (11)發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方為:玉米淀粉1.5kg,糊精0.25kg,中溫黃豆餅粉1.29kg,硫酸銨0.1kg,氯化鈉0.15kg,玉米衆(zhòng)0.75kg,輕質(zhì)碳酸I丐0.3kg,豆油350ml, 100%正丙醇1320ml,加水定容至60L,調(diào)pH值至7.0 ;
      (12)將培養(yǎng)成熟的紅霉素生產(chǎn)菌種子液按照10%(V/V)的接種量接入100L發(fā)酵罐中,340C,培養(yǎng)7天左右,得紅霉素,利用HPLC測定效價。本發(fā)明的優(yōu)點:
      本發(fā)明通過兩種誘變、兩次篩選,得到對較高濃度正丙醇充分耐受的突變紅霉素生產(chǎn)菌,其對正丙醇的耐受濃度達到2%以上。提高了紅霉素生產(chǎn)菌對正丙醇的耐受性,使在培養(yǎng)基中可顯著增加正丙醇濃度,在生產(chǎn)菌種轉(zhuǎn)化率不變的情況下,正丙醇濃度提高使紅霉素的產(chǎn)量得到提高,100L發(fā)酵罐放罐效價可達到13000u/ml。
      具體實施例方式普通紅霉素生產(chǎn)菌難以耐受高濃度正丙醇。將紅霉素生產(chǎn)菌誘變后會形成表型各異的紅霉素生產(chǎn)菌突變庫,其中很可能含有少量對正丙醇耐受者,關(guān)鍵是將這部分在突變庫中占極少比例的正丙醇耐受型突變紅霉素生產(chǎn)菌從大量無義突變中篩選出來,如果正丙醇耐受型突變紅霉素生產(chǎn)菌確實在突變庫中存在,將突變庫接入高濃度正丙醇培養(yǎng)基后,正丙醇耐受型突變紅霉素生產(chǎn)菌就會生長,而大量無義突變紅霉素生產(chǎn)菌則死亡,從而通過誘變及篩選得到正丙醇耐受型突變紅霉素生產(chǎn)菌。
      以下通過實施例進一步對本發(fā)明進行描述:
      實施例1:
      第一次誘變與篩選:將紅霉素生產(chǎn)菌在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng),培養(yǎng)7天后獲得新鮮成熟孢子;利用紅霉素生產(chǎn)菌新鮮成熟斜面制IOml孢子懸液,孢子量在I X IO6個/mL,分成兩份。取一份(作為對照)涂平板培養(yǎng)基,平板培養(yǎng)基的配方為:可溶性淀粉6g,玉米漿7g,硫酸銨3g,氯化鈉3g,瓊脂粉20g,100%正丙醇15ml,加水定容至IOOOml,調(diào)pH值至7.2,分析純碳酸鈣2.5g。培養(yǎng)7天,顯示紅霉素生產(chǎn)菌未生長。另取一份(作為誘變份)孢子懸液移至培養(yǎng)皿中,于15W紫外線燈管和固定距離20cm照射3分鐘,誘變后進行梯度稀釋立即涂培養(yǎng)基平板,平板培養(yǎng)基的配方為:可溶性淀粉6g,玉米漿7g,硫酸銨3g,氯化鈉3g,瓊脂粉20g,100%正丙醇15ml,加水定容至1000ml,調(diào)PH值至7.2,分析純碳酸鈣2.5g。在平板上生長的菌落即為初次誘變成功的能耐受1.5%正丙醇的突變紅霉素生產(chǎn)菌。第二次誘變與篩選:對第一次誘變成功的能耐受1.5%正丙醇的初次突變紅霉素生產(chǎn)菌進行離子束輻照誘變。將初次突變紅霉素生產(chǎn)菌在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng),培養(yǎng)7天后獲得新鮮成熟孢子;利用初次突變紅霉素生產(chǎn)菌新鮮成熟斜面制IOml孢子懸液,孢子量在I X IO6個/mL,分成兩份。取一份(作為對照)涂平板培養(yǎng)基,平板培養(yǎng)基的配方為:可溶性淀粉6g,玉米漿7g,硫酸銨3g,氯化鈉3g,瓊脂粉20g,100%正丙醇20ml,加水定容至1000ml,調(diào)PH值至7.2,分析純碳酸鈣2.5g。培養(yǎng)7天,顯示紅霉素生產(chǎn)菌未生長。一份(作為誘變份)進行離子束輻照誘變,誘變溫度為25°C,誘變劑量為55Gy。誘變后進行梯度稀釋立即涂培養(yǎng)基平板,平板培養(yǎng)基的配方為 :可溶性淀粉6g,玉米漿7g,硫酸銨3g,氯化鈉3g,瓊脂粉20g,100%正丙醇20ml,加水定容至1000ml,調(diào)pH值至7.2,分析純碳酸鈣2.5g。在平板上生長的菌落即為再次誘變成功的能耐受2%正丙醇的突變紅霉素生產(chǎn)菌。將第二次篩選出的耐正丙醇紅霉素生產(chǎn)菌進行遺傳穩(wěn)定性試驗,共轉(zhuǎn)接10代,證明其是否是遺傳穩(wěn)定的耐正丙醇突變紅霉素生產(chǎn)菌。將第二次篩選出的耐正丙醇紅霉素生產(chǎn)菌和初次突變紅霉素生產(chǎn)菌分別接入種子瓶培養(yǎng)基,種子培養(yǎng)基配方為:玉米淀粉28g,糊精7g,中溫黃豆餅粉12.6g,硫酸銨1.2g,硝酸銨1.2g,氯化鈉3g,玉米楽;7.1g,分析純碳酸韓6g,豆油2ml,加水定容至1000ml,調(diào)pH值至7.0。34°C,220轉(zhuǎn)/分,振蕩培養(yǎng)42_46h。按照搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方配制搖瓶發(fā)酵液50mL,放入500mL帶擋板的三角瓶中。將第二次篩選出的耐正丙醇紅霉素生產(chǎn)菌和初次突變紅霉素生產(chǎn)菌在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)成熟的種子液接入發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基,搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:玉米淀粉18g,糊精24g,中溫黃豆餅粉18g,硫酸銨2g,輕質(zhì)碳酸鈣6g,豆油4ml,100%正丙醇20ml,加水定容至1000ml,調(diào)pH值至1.0。34°C, 260轉(zhuǎn)/分,振蕩培養(yǎng)5天左右,顯示初次突變紅霉素生產(chǎn)菌未能生長,菌絲斷裂嚴重,第二次篩選出的耐正丙醇紅霉素生產(chǎn)菌生長。實施例2:
      將第二次篩選出的耐正丙醇紅霉素生產(chǎn)菌的種子液,接入含100%正丙醇2.2%的發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中,34°C,260轉(zhuǎn)/分,振蕩培養(yǎng)7天左右,紅霉素含量達到7500u/ml。普通的紅霉素生產(chǎn)菌用此方法,紅霉素含量只達到5500u/ml。實施例3:將第二次篩選出的耐正丙醇紅霉素生產(chǎn)菌的種子液,接入含100%正丙醇2.2%的100L發(fā)酵罐中培養(yǎng),34°C,7天左右,放罐效價可達到13000u/ml。普通的紅霉素生產(chǎn)菌用此方法,紅霉素含量只達到8000u/ml。最后,還需注意的是,以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例子。顯然,本發(fā)明不限于以上實施例子,還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導出或聯(lián)想到的所有變形,均 應認為是本發(fā)明的保護范圍。
      權(quán)利要求
      1.一種通過誘變提高紅霉素生產(chǎn)菌對正丙醇的耐受性的方法,其特征依次包括以下步驟: (1)將紅霉素生產(chǎn)菌在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng),34°c,培養(yǎng)7天后獲得新鮮成熟孢子; (2)將紅霉素生產(chǎn)菌新鮮成熟斜面制成孢子懸液,孢子量在IX IO6個/mL,取5mL孢子懸液移至培養(yǎng)皿中,于15W紫外線燈管和固定距離20cm照射3分鐘,誘變后進行梯度稀釋立即涂培養(yǎng)基平板; (3)挑取步驟(2)誘變后活菌落進行離子束輻照誘變:誘變溫度為25°C,誘變劑量為55Gy,誘變后進行梯度稀釋涂培養(yǎng)基平板初篩;挑單菌落至斜面培養(yǎng)基,34°C,培養(yǎng)7天,再經(jīng)搖瓶發(fā)酵方法進行復篩,所得突變菌即為對正丙醇具耐受性的高產(chǎn)紅霉素生產(chǎn)菌。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過誘變提高紅霉素生產(chǎn)菌對正丙醇的耐受性的方法,其特征在于:步驟(I)或步驟(3)斜面養(yǎng)基的配方為:可溶性淀粉6g,玉米漿7g,硫酸銨3g,氯化鈉3g,瓊脂粉20g,加水定容至1000ml,調(diào)pH值至7.2,分析純碳酸鈣2.5g ;步驟(2)的平板培養(yǎng)基的配方為:可溶性淀粉6g,玉米漿7g,硫酸銨3g,氯化鈉3g,瓊脂粉20g,100%正丙醇15ml,加水定容至1000ml,調(diào)pH值至7.2,分析純碳酸鈣2.5g。
      3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過誘變提高紅霉素生產(chǎn)菌對正丙醇的耐受性的方法,其特征在于:步驟(3)是將步驟(2)誘變后的活菌落在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天后制成孢子懸液,進行離子束輻照誘變。
      4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過誘變提高紅霉素生產(chǎn)菌對正丙醇的耐受性的方法,其特征在于:步驟(3)平板培養(yǎng)基配方為:可溶性淀粉6g,玉米漿7g,硫酸銨3g,氯化鈉3g,瓊脂粉20g,100%正丙醇20ml,加水定容至1000ml,調(diào)pH值至7.2,分析純碳酸鈣2.5g ;搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:玉米淀粉18g,糊精24g,中溫黃豆餅粉18g,硫酸銨2g,輕質(zhì)碳酸鈣6g,豆油4ml, 100%正丙醇 20ml,加水定容至1000ml,調(diào)pH值至7.0。
      5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的通過誘變提高紅霉素生產(chǎn)菌對正丙醇的耐受性的方法,其特征在于:其所用培養(yǎng)基配方為:可溶性淀粉6g,玉米漿7g,硫酸銨3g,氯化鈉3g,瓊脂粉20g,加水定容至1000ml,調(diào)pH值至7.2,分析純碳酸鈣2.5g。
      6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過誘變提高紅霉素生產(chǎn)菌對正丙醇的耐受性的方法,其特征在于:步驟(3)的搖瓶發(fā)酵是將紅霉素生產(chǎn)菌在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)成熟的種子液接入發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基。
      7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的通過誘變提高紅霉素生產(chǎn)菌對正丙醇的耐受性的方法,其特征在于:種子培養(yǎng)基配方為:玉米淀粉28g,糊精7g,中溫黃豆餅粉12.6g,硫酸銨1.2g,硝酸銨1.2g,氯化鈉3g,玉米衆(zhòng)7.1g,分析純碳酸|丐6g,豆油2ml,加水定容至1000ml,調(diào)pH值至7.0 ;種子液培養(yǎng)條件為:34°C,220轉(zhuǎn)/分,振蕩培養(yǎng)42-46h。
      8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的通過誘變提高紅霉素生產(chǎn)菌對正丙醇的耐受性的方法,其特征在于:按照搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方配制搖瓶發(fā)酵液50mL,放入500mL帶擋板的三角瓶中。
      9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的通過誘變提高紅霉素生產(chǎn)菌對正丙醇的耐受性的方法,其特征在于:將培養(yǎng)成熟的紅霉素生產(chǎn)菌種子液5mL接入發(fā)酵搖瓶中,340C,260轉(zhuǎn)/分,振蕩培養(yǎng)7天左右,得紅霉素,測定效價。
      全文摘要
      本發(fā)明公開了一種通過誘變提高紅霉素生產(chǎn)菌對正丙醇的耐受性的方法,包括以下步驟(1)以紅霉素生產(chǎn)菌為出發(fā)菌株,將紅霉素生產(chǎn)菌在斜面培養(yǎng)基上預培養(yǎng)7天。(2)預培養(yǎng)后的紅霉素生產(chǎn)菌進行紫外線誘變用15W功率的紫外燈管和固定距離為20cm的條件下照射3分鐘進行誘變,誘變后立即涂培養(yǎng)基平板。(3)誘變后活菌落進行離子束輻照誘變誘變溫度為25℃,誘變劑量為55Gy,誘變后再經(jīng)培養(yǎng)基平板初篩和搖瓶發(fā)酵方法復篩,所得活菌落即為對正丙醇具耐受性的突變紅霉素生產(chǎn)菌。通過本方法,得到對高濃度正丙醇具耐受性的突變紅霉素生產(chǎn)菌,其對正丙醇的耐受濃度達到2%以上。提高了紅霉素生產(chǎn)菌對正丙醇的耐受性,使在培養(yǎng)基中可顯著增加正丙醇濃度,在生產(chǎn)菌種轉(zhuǎn)化率不變的情況下,正丙醇濃度提高使紅霉素的產(chǎn)量得到提高,100L發(fā)酵罐放罐效價可達到13000u/ml以上。
      文檔編號C12R1/465GK103160446SQ20111041102
      公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月12日
      發(fā)明者張麗麗, 于新令, 程傳東, 李瑾, 何海燕, 王鳳灘 申請人:山東方明藥業(yè)集團股份有限公司
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