專利名稱：生產蘋果酸的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵領域，具體涉及生產蘋果酸的方法。
背景技術：
蘋果酸，又名羥基丁二酸，是食品工業(yè)重要的有機酸產品之一，其具有天然果實的酸味特征，味覺自然豐厚，可作為酸味劑在食品及醫(yī)藥中廣泛應用。蘋果酸的酸感強度約相當于檸檬酸的1. 2倍，產熱量更低，可以替代檸檬酸作為食品添加劑加以應用。目前蘋果酸的主要生產工藝為富馬酸酶催化工藝和一步發(fā)酵工藝。富馬酸酶催化工藝是采用富馬酸酶催化富馬酸一步轉化生產蘋果酸，因富馬酸酶和富馬酸原料價格較高，生產受到一定的限制。一步發(fā)酵工藝是采用黃曲霉(A^argiBm /Yams)、米曲霉 {Aspergillus orj^e)、改造的釀酒酵母、改造的大腸桿菌等菌種，以葡萄糖為原料生產蘋果酸，與富馬酸酶催化工藝相比，雖然原料價格較低，但發(fā)酵液中蘋果酸純度較低，而從發(fā)酵液中提取蘋果酸的工藝路線復雜，包括多步酸解、過濾、精制、結晶等多個步驟，產品收率低、純度低；此外，因提取工藝中使用大量的碳酸鈣，還產生大量酸性廢水和鈣渣排放，造成環(huán)境污染。因此，急需一種生產蘋果酸的方法。

發(fā)明內容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種生產蘋果酸的方法，該方法制得的蘋果酸產率高，提取蘋果酸工藝簡單。為了實現(xiàn)上述為目的，本發(fā)明的技術方案為 生產蘋果酸的方法，具體步驟為
a.種子活化
將出芽短梗霉(Jareoh1SiiZiwB pullans) NRRL Y-2311-1接種于種子培養(yǎng)基，溫度為 23-30°C震蕩培養(yǎng)，得活化種子液；所述種子培養(yǎng)基為葡萄糖40-100 g/L、NH4NO3I-5 g/L、 KH2PO4 0. 005-0. 3g/L、ZnSO4 0. 005-0. 3g/L、MgSO4 0. 005-0. 3g/L、玉米菜 0. 05-3 g/L 和 CaCO3 10-50 g/L ；
b.發(fā)酵
將步驟a所得活化種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，溫度為23-30°C震蕩培養(yǎng)144小時以上，固液分離，收集液體，得發(fā)酵液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為糖80-120g/L、NH4NO3 l_5g/L、KH2PO4 0. 005-0. 3g/L、ZnSO4 0. 005-0. 3g/L、MgSO4 0. 005-0. 3g/L、玉米菜 0. 05_3g/L 和 CaCO3 10-50 g/L;所述糖為葡萄糖、木糖、玉米秸稈水解液或木質纖維素水解液中的至少一種；
所述玉米秸稈水解液的制備方法是取玉米秸稈，粉碎，加水，用酸調節(jié)PH至2. 5，加熱至100°C充分水解，然后用堿中和，加入纖維素酶和半纖維素酶，50°C恒溫水解，過濾，收集濾液，即得玉米秸稈水解液；
所述木質纖維素水解液的制備方法是取木質纖維，粉碎，用質量分數(shù)為7%的硫酸浸泡，再加熱至160-200°C充分水解，然后用堿中和，剩余殘渣再用質量分數(shù)為1的硫酸在溫度為180-240°C充分水解，過濾，收集濾液，即得木質纖維素水解液；
c.醇沉
將步驟b所得發(fā)酵液用乙醇沉淀，固液分離，收集沉淀，得聚蘋果酸；
d.水解
將步驟c所得聚蘋果酸進行酸水解，得水解液；
e.濃縮結晶
將步驟d所得水解液濃縮，結晶，得蘋果酸。進一步，步驟a中所述出芽短梗霉的接種按照出芽短梗霉與種子培養(yǎng)基的體積比為1 100-1000進行；所述震蕩培養(yǎng)為在轉速180-300 rpm下培養(yǎng)36-96小時；所述種子培養(yǎng)基為葡萄糖 60-80g/L、NH4NO3 2_4g/L、KH2PO4 0. 05-0. 2g/L、ZnSO4 0. 05-0. 2g/L、MgSO4 0. 05-0. 2g/L、玉米漿 0. 5-2g/L 和 CaCO3 20-50 g/L。進一步，步驟b中所述活化種子液的接種按照活化種子液與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1:10-20進行；所述震蕩培養(yǎng)為在轉速180-700 rpm下培養(yǎng)144-168小時；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為糖 90-100g/L、NH4NO3 2_4g/L、KH2PO4 0. 05-0. 2g/L、ZnSO4 0. 05-0. 2g/L、MgSO4 0. 05-0. 2g/L、玉米漿 0. 5-2g/L 和 CaCO3 20-50 g/L ；
所述玉米秸稈水解液的制備方法是取玉米秸稈，粉碎，按照固液體積比為1:5-10加水，用硫酸調節(jié)PH至2. 5，加熱至100°C水解1-5小時，然后用氫氧化鈣中和，加入纖維素酶和半纖維素酶，50°C恒溫水解1-10小時，過濾，收集濾液，得玉米秸稈水解液；
所述木質纖維素水解液的制備方法是取木質纖維，粉碎，用質量分數(shù)為7%的硫酸浸泡 2小時，加熱至160-200°C水解2-10分鐘，然后用生石灰中和，剩余殘渣再用質量分數(shù)為21 的硫酸在溫度為180-240°C水解2-10分鐘，過濾，收集濾液，得木質纖維素水解液。進一步，步驟c中所述用乙醇沉淀為加入相當于發(fā)酵液體積1-4倍的質量分數(shù)95% 的乙醇溶液，4°C冷凍12-36小時；所述固液分離為在轉速不低于3000rpm的條件下離心不少于5分鐘。進一步，步驟c所述用乙醇沉淀為加入相當于發(fā)酵液體積2倍的質量分數(shù)95%的乙醇溶液，4°C冷凍M小時；固液分離為在轉速3500rpm的條件下離心45分鐘。進一步，步驟d中所述酸水解為將聚蘋果酸溶解于濃度為2mol/L的硫酸、鹽酸或磷酸中的至少一種，溫度為70-95°C水解7-15小時。進一步，步驟d中所述酸水解為將聚蘋果酸溶解于濃度為2mol/L的硫酸中，溫度為85°C水解10小時。進一步，步驟e中所述濃縮是在溫度低于80°C、真空度不低于IMpa的條件下進行， 濃縮液的濃縮比大于10 ；所述結晶在4°C下冷凍結晶。進一步，步驟e中所述濃縮是在溫度為80°C、真空度為IMpa的條件下進行，濃縮液的濃縮比為10。本發(fā)明有益效果在于本發(fā)明用出芽短梗霉(徹reo如Μ Τ/ puHans)為發(fā)酵菌株，既可以利用葡萄糖或木糖為糖原，也可以利用價格低廉的農副生物質資源玉米秸稈水解液或木質纖維素水解液為糖原，發(fā)酵直接產物為高分子聚蘋果酸，解決了傳統(tǒng)路線發(fā)酵直接產生蘋果酸會抑制菌種產酸能力的問題，因而能夠獲得高濃度的聚蘋果酸發(fā)酵液，發(fā)酵液中聚蘋果酸最高達48. 4g/L，獲得的聚蘋果酸通過乙醇沉淀、酸水解即制得蘋果酸，工藝步驟簡單，蘋果酸收率高(最高達54. 9g/L)，適合于大規(guī)模生產。
具體實施例方式以下將結合實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件。本發(fā)明使用的發(fā)酵菌株為出芽短梗霉(Aureobasidium pullans)NRRL Y-2311-1, 將出芽短梗霉NRRL Y-2311-1制備成OD6tltl= 0. 4左右的菌液，保存于本實驗室_80°C超低溫冰箱中。實施例1
原料準備
玉米秸稈水解液，具體為取玉米秸稈，粉碎，按照固液體積比1:7加入水，用硫酸調節(jié) PH至2. 5，加熱至100°C水解3小時，然后用氫氧化鈣中和，加入纖維素酶和半纖維素酶， 50°C恒溫水解8小時后，過濾，收集濾液，得玉米秸稈水解液，備用。生產蘋果酸的方法，具體步驟為 a.種子活化
將出芽短梗霉NRRL Y-2311-1接種于種子培養(yǎng)基中，接種量按照出芽短梗霉與種子培養(yǎng)基的體積比為1:100，種子培養(yǎng)基配方為葡萄糖80g/L、NH4N032g/L、KH2P04 0. lg/L,ZnSO4 0. 2g/L、MgS04 0.2g/L、玉米漿 IgA^PCaCO3 20g/L，在溫度為 、轉速為 250 rpm條件下震蕩培養(yǎng)72小時，得活化種子液； b.發(fā)酵
將步驟a所得活化種子液接種于含50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，接種量按照活化種子液與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1:10，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為玉米秸稈水解液和葡萄糖總糖含量為 100 g/L、NH4NO3 2g/L、KH2PO4 0.1 g/L, ZnSO4 0.2 g/L,MgSO4 0. 2g/L、玉米漿 lg/L 和 CaCO3 20 g/L，在溫度為25°C、轉速為220 rpm條件下震蕩培養(yǎng)160小時，培養(yǎng)液用板框過濾機過濾，收集濾液，得發(fā)酵液；
c.醇沉
將步驟b所得發(fā)酵液加入相當于發(fā)酵液體積2倍的質量分數(shù)為95%的乙醇溶液，4°C冷凍M小時，轉速為4000rpm離心30分鐘，收集沉淀，得聚蘋果酸；
d.水解
將步驟c所得聚蘋果酸溶于濃度為2mol/L的硫酸中，80°C水解12小時，得水解液；
e.濃縮結晶
將步驟d所得水解液采用刮板式真空蒸發(fā)器濃縮，濃縮溫度為80°C，真空度為IMpa，濃縮比為10，將濃縮液轉入結晶罐，4°C冷凍結晶，得蘋果酸。本實施例的聚蘋果酸產量為44g/L，蘋果酸產量為49g/L。實施例2
生產蘋果酸的方法，具體步驟為 a.種子活化
將出芽短梗霉NRRL Y-2311-1接種于種子培養(yǎng)基中，接種量按照出芽短梗霉與種子培養(yǎng)基的體積比為1:500，種子培養(yǎng)基配方為葡萄糖60 g/L、NH4NO3 3 g/L、KH2PO4 0. 2g/L、ZnSO4 0. lg/L, MgSO4 0. lg/L、玉米漿 2g/L 和 CaCO3 30g/L，在溫度為 25°C、轉速為 220 rpm 條件下震蕩培養(yǎng)48小時，得活化種子液；
b.發(fā)酵
將步驟a所得活化種子液接種于含50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，接種量按照種子液與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1:12.5，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖90g/L、NH4N03 3 g/L、KH2P04 0.2 g/ LJnSO4 0.1 g/L,MgSO4 0. lg/L、玉米漿 2g/L 和 CaCO3 30 g/L，在溫度為 25°C、轉速為 220 rpm條件下震蕩培養(yǎng)168小時，培養(yǎng)液用板框過濾機過濾，收集濾液，得發(fā)酵液；
c.醇沉
將步驟b所得發(fā)酵液加入相當于發(fā)酵液體積3倍的質量分數(shù)為95%的乙醇溶液，4°C冷凍M小時，轉速為3500rpm離心45分鐘，收集沉淀，得聚蘋果酸；
d.水解
將步驟c所得聚蘋果酸溶于濃度為2mol/L的鹽酸中，85°C水解10小時，得水解液；
e.濃縮結晶
將步驟d所得水解液采用刮板式真空蒸發(fā)器濃縮，濃縮溫度為60°C，真空度為1. 5Mpa, 濃縮液的濃縮比為12，將濃縮液轉入結晶罐，4°C冷凍結晶，得蘋果酸。本實施例的聚蘋果酸產量為48 g/L，蘋果酸產量為55 g/L。實施例3 原料準備
玉米秸稈水解液，具體為取玉米秸稈，粉碎，按照固液體積比為1 10加入水，用硫酸調節(jié)PH至2. 5，加熱至100°C水解5小時，然后用氫氧化鈉中和，加入纖維素酶和半纖維素酶， 50°C恒溫水解10小時后，過濾，收集濾液，得玉米秸稈水解液，備用。生產蘋果酸的方法，具體步驟為
a.種子活化
將出芽短梗霉NRRL Y-2311-1接種于種子培養(yǎng)基中，接種量按照出芽短梗霉與種子培養(yǎng)基的體積比為1:1000，種子培養(yǎng)基配方為葡萄糖70g/L、NH4N034g/L、KH2P040. 05g/L,ZnSO4 0. 05g/L、MgS04 0 . 05g/L、玉米漿 0. 5g/L 和 CaCO3 40g/L，在溫度為 25°C、轉速為 200 rpm 條件下震蕩培養(yǎng)60小時，得活化種子液；
b.發(fā)酵
將步驟a所得活化種子液接種于裝4L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，接種量按照種子液與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1 12. 5，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為玉米秸稈水解液和葡萄糖總糖含量 120 g/L、NH4NO3 4g/L、KH2PO4 0. 05 g/L、ZnSO4 0. 05 g/L、MgSO4 0. 05g/L、玉米菜 0. 5g/L 和CaCO3 40 g/L，在溫度為25°C、轉速為500 rpm、通氣比1:1. 2條件下震蕩培養(yǎng)144小時， 培養(yǎng)液用真空抽濾裝置過濾，收集濾液，得發(fā)酵液；
c.醇沉
將步驟b所得發(fā)酵液加入相當于發(fā)酵液體積4倍的質量分數(shù)為95%的乙醇溶液，4°C冷凍12小時，轉速為5000rpm離心5分鐘，收集沉淀，得聚蘋果酸；
d.水解
將步驟c所得聚蘋果酸溶于濃度為2mol/L的磷酸中，90°C水解9小時，得水解液；
e.濃縮結晶將步驟d所得水解液采用刮板式真空蒸發(fā)器濃縮，濃縮溫度為30°C，真空度為3Mpa，濃縮液的濃縮比為15，將濃縮液轉入結晶罐，4°C冷凍結晶，得蘋果酸。本實施例的聚蘋果酸產量為42g/L，蘋果酸產量為47g/L。實施例4
生產蘋果酸的方法，具體步驟為
a.種子活化
將出芽短梗霉NRRL Y-2311-1接種于種子培養(yǎng)基中，接種量按照出芽短梗霉與種子培養(yǎng)基的體積比為1:250，種子培養(yǎng)基配方為葡萄糖40g/L、NH4NO3 5g/L、KH2PO4 0. 05g/L、 ZnSO4 0. 05g/L、MgS04 0 . 05g/L、玉米漿 3g/L和 CaCO3 10g/L，在溫度為 23°C、轉速為 180rpm 條件下震蕩培養(yǎng)96小時，得活化種子液；
b.發(fā)酵
將步驟a所得活化種子液接種于含50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，接種量按照種子液與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1: 20，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為木糖100g/L、NH4NO3 5 g/L、KH2PO4 0. 05 g/ UnSO4 0. 05 g/L、MgSO4 0. 05g/L、玉米漿 3g/L 和 CaCO3 10 g/L，在溫度為 、轉速為 300 rpm條件下震蕩培養(yǎng)144小時，培養(yǎng)液用真空抽濾裝置過濾，收集濾液，得發(fā)酵液；
c.醇沉
將步驟b所得發(fā)酵液加入相當于發(fā)酵液體積4倍的質量分數(shù)為95%的乙醇溶液，4°C冷凍18小時，轉速為4500rpm離心30分鐘，收集沉淀，得聚蘋果酸；
d.水解
將步驟c所得聚蘋果酸溶于濃度為2mol/L的硫酸中，70°C水解15小時，得水解液；
e.濃縮結晶
將步驟d所得水解液采用刮板式真空蒸發(fā)器濃縮，濃縮溫度為80°C，真空度為IMpa，濃縮液的濃縮比為13，將濃縮液轉入結晶罐，4°C冷凍結晶，得蘋果酸。本實施例的聚蘋果酸產量為37 g/L，蘋果酸產量為43 g/L。實施例5 原料準備
木質纖維素水解液，具體為取木質纖維，粉碎，用質量分數(shù)為7%的硫酸浸泡2小時， 溫度升至200°c，水解10分鐘后，用生石灰中和，剩余殘渣用質量分數(shù)為m的硫酸在溫度 240°C水解10分鐘，過濾，收集濾液，得到木質纖維素水解液，備用。生產蘋果酸的方法，具體步驟為
a.種子活化
將出芽短梗霉NRRL Y-2311-1接種于種子培養(yǎng)基中，接種量按照出芽短梗霉與種子培養(yǎng)基的體積比為1:750，種子培養(yǎng)基配方為葡萄糖100g/L、NH4NO3 lg/L、KH2PO4 0. 3g/ UnSO4 0.3g/L、MgSO4 0. 3g/L、玉米漿 0. 05g/L 和 CaCO3 50g/L，在溫度為 30°C、轉速為 300rpm條件下震蕩培養(yǎng)36小時，得活化種子液；
b.發(fā)酵
將步驟a所得活化種子液接種于含50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，接種量按照種子液與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1:15，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為木質纖維素水解液和木糖總糖含量100g/L、 NH4NO3 1 g/L、KH2PO4 0. 3 g/L、ZnSO4 0. 3 g/L、MgSO4 0. 3g/L、玉米漿 0. 05g/L 和 CaCO3 50g/L，在溫度為30°C、轉速為300 rpm條件下震蕩培養(yǎng)144小時，培養(yǎng)液用真空轉鼓過濾機過濾，收集濾液，得發(fā)酵液；
c.醇沉
將步驟b所得發(fā)酵液加入相當于發(fā)酵液體積1倍的質量分數(shù)為95%的乙醇溶液，4°C冷凍36小時，轉速為3500rpm離心60分鐘，收集沉淀，得聚蘋果酸；
d.水解
將步驟c所得聚蘋果酸溶于濃度為2mol/L的鹽酸中，85°C水解10小時，得水解液；
e.濃縮結晶
將步驟d所得水解酸溶液采用刮板式真空蒸發(fā)器濃縮，濃縮溫度為70°C，真空度為 3Mpa，濃縮液的濃縮比為20，將濃縮液轉入結晶罐，4°C冷凍結晶，得蘋果酸。本實施例的聚蘋果酸產量為34 g/L，蘋果酸產量為39 g/L。實施例6 原料準備
玉米秸稈水解液，具體為取玉米秸稈，粉碎，按照固液體積比為1:7加入水，用硫酸調節(jié)PH至2. 5，加熱至100°C水解3小時，然后用氫氧化鈣中和，加入纖維素酶和半纖維素酶， 50°C恒溫水解8小時后，過濾，收集濾液，得玉米秸稈水解液，備用。木質纖維素水解液，具體為取木質纖維，粉碎，用質量分數(shù)為7%的硫酸浸泡2小時，溫度升至180°c，水解6分鐘后，用氫氧化鈉中和，剩余殘渣用質量分數(shù)為m的硫酸在溫度200°C水解8分鐘，過濾，收集濾液，得到木質纖維素水解液，備用。生產蘋果酸的方法，具體步驟為
a.種子活化
將出芽短梗霉NRRL Y-2311-1接種于種子培養(yǎng)基中，接種量按照出芽短梗霉與種子培養(yǎng)基的體積比為1:500，種子培養(yǎng)基配方為葡萄糖40g/L、NH4NO3 5g/L、KH2PO4 0. 05g/L、 ZnSO4 0. 05g/L、MgS04 0 . 05g/L、玉米漿 3g/L和 CaCO3 10g/L，在溫度為 23°C、轉速為 180rpm 條件下震蕩培養(yǎng)96小時，得活化種子液；
b.發(fā)酵
將步驟a所得活化種子液接種于含4L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，接種量按照種子液與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1:17. 5，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為玉米秸稈水解液和木質纖維素水解液總糖含量 80g/L、NH4NO3 5 g/L、KH2PO4 0. 05 g/L、ZnSO4 0. 05 g/L、MgSO4 0. 05g/L、玉米漿 3g/L和CaCO3 10 g/L，在溫度為23°C、轉速為300 rpm、通氣比為1:0. 8條件下震蕩培養(yǎng)144 小時，培養(yǎng)液用真空轉鼓過濾機過濾，收集濾液，得發(fā)酵液；
c.醇沉
將步驟b所得發(fā)酵液加入相當于發(fā)酵液體積4倍的質量分數(shù)為95%的乙醇溶液，4°C冷凍18小時，轉速為4500rpm離心20分鐘，收集沉淀，得聚蘋果酸；
d.水解
將步驟c所得聚蘋果酸溶于濃度為2mol/L的硫酸中，70°C水解15小時，得水解液；
e.濃縮結晶
將步驟d所得水解液采用刮板式真空蒸發(fā)器濃縮，濃縮溫度為20°C，真空度為5Mpa，濃縮液的濃縮比為12，將濃縮液轉入結晶罐，4°C冷凍結晶，得蘋果酸。
本實施例的聚蘋果酸產量為36g/L，蘋果酸產量為40 g/L。實施例7 原料準備
玉米秸稈水解液，具體為取玉米秸稈，粉碎，按照固液體積比為1:5加入水，用硫酸調節(jié)PH至2. 5，加熱至100°C水解1小時，然后用氫氧化鈣中和，加入纖維素酶和半纖維素酶， 50°C恒溫水解1小時后，過濾，收集濾液，得玉米秸稈水解液，備用。木質纖維素水解液，具體為取木質纖維，粉碎，用質量分數(shù)為7%的硫酸浸泡2小時，溫度升至160°c，水解2分鐘后，用生石灰水中和，剩余殘渣用質量分數(shù)為m的硫酸在溫度180°C水解2分鐘，過濾，收集濾液，得到木質纖維素水解液，備用。生產蘋果酸的方法，具體步驟為
a.種子活化
將出芽短梗霉NRRL Y-2311-1接種于種子培養(yǎng)基中，接種量按照出芽短梗霉與種子培養(yǎng)基的體積比為1:750，種子培養(yǎng)基配方為葡萄糖100g/L、NH4NO3 lg/L、KH2PO4 0. 3g/ UnSO4 0.3g/L、MgSO4 0. 3g/L、玉米漿 0. 05g/L 和 CaCO3 50g/L，在溫度為 30°C、轉速為 300rpm條件下震蕩培養(yǎng)36小時，得活化種子液；
b.發(fā)酵
將步驟a所得活化種子液接種于含4L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，接種量按照種子液與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1: 20，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為木糖、玉米秸稈水解液和木質纖維素水解液總糖含量 80g/L、NH4NO3 1 g/L、KH2PO4 0.3 g/L、ZnSO4 0.3 g/L、MgSO4 0. 3g/L、玉米漿 0. 05g/L和CaCO3 50 g/L，在溫度為30°C、轉速為700 rpm、通氣比為1:1. 6條件下震蕩培養(yǎng)144小時，培養(yǎng)液用板框過濾機過濾，收集濾液，得發(fā)酵液；
c.醇沉
將步驟b所得發(fā)酵液加入相當于發(fā)酵液體積1倍的質量分數(shù)為95%的乙醇溶液，4°C冷凍36小時，轉速為4000rpm離心25分鐘，收集沉淀，得聚蘋果酸；
d.水解
將步驟c所得聚蘋果酸溶于濃度為2mol/L的鹽酸中，85°C水解10小時，得水解液；
e.濃縮結晶
將步驟d所得水解液采用刮板式真空蒸發(fā)器濃縮，濃縮溫度為50°C，真空度為lOMpa， 濃縮液的濃縮比為10，將濃縮液轉入結晶罐，4°C冷凍結晶，得蘋果酸。本實施例的聚蘋果酸產量為32 g/L，蘋果酸產量為36 g/L。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權利要求
1.生產蘋果酸的方法，其特征在于，具體步驟為a.種子活化將出芽短梗霉(Jareoh1SiiZiwB pullans) NRRL Y-2311-1接種于種子培養(yǎng)基，溫度為 23-30°C震蕩培養(yǎng)，得活化種子液；所述種子培養(yǎng)基為葡萄糖40-100 g/L、NH4NO3I-5 g/L、 KH2PO4 0. 005-0. 3g/L、ZnSO4 0. 005-0. 3g/L、MgSO4 0. 005-0. 3g/L、玉米菜 0. 05-3 g/L 和 CaCO3 10-50 g/L ；b.發(fā)酵將步驟a所得活化種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，溫度為23-30°C震蕩培養(yǎng)144小時以上，固液分離，收集液體，得發(fā)酵液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為糖80-120g/L、NH4NO3 l_5g/L、KH2PO4 0. 005-0. 3g/L、ZnSO4 0. 005-0. 3g/L、MgSO4 0. 005-0. 3g/L、玉米菜 0. 05_3g/L 和 CaCO3 10-50 g/L;所述糖為葡萄糖、木糖、玉米秸稈水解液或木質纖維素水解液中的至少一種；所述玉米秸稈水解液的制備方法是取玉米秸稈，粉碎，加水，用酸調節(jié)PH至2. 5，加熱至100°C充分水解，然后用堿中和，加入纖維素酶和半纖維素酶，50°C恒溫水解，過濾，收集濾液，即得玉米秸稈水解液；所述木質纖維素水解液的制備方法是取木質纖維，粉碎，用質量分數(shù)為7%的硫酸浸泡，再加熱至160-200°C充分水解，然后用堿中和，剩余殘渣再用質量分數(shù)為21的硫酸在溫度為180-240°C充分水解，過濾，收集濾液，即得木質纖維素水解液；c.醇沉將步驟b所得發(fā)酵液用乙醇沉淀，固液分離，收集沉淀，得聚蘋果酸；d.水解將步驟c所得聚蘋果酸進行酸水解，得水解液；e.濃縮結晶將步驟d所得水解液濃縮，結晶，得蘋果酸。
2.根據(jù)權利要求1所述生產蘋果酸的方法，其特征在于步驟a中所述出芽短梗霉的接種按照出芽短梗霉與種子培養(yǎng)基的體積比為1:100-1000進行；所述震蕩培養(yǎng)為在轉速 180-300 rpm下培養(yǎng)36-96小時；所述種子培養(yǎng)基為葡萄糖60_80g/L、NH4N03 2-4g/L,KH2PO4 0. 05-0. 2g/L,ZnSO4 0. 05-0. 2g/L,MgSO4 0. 05-0. 2g/L、玉米漿0. 5_2g/L和 CaCO3 20-50 g/ L0
3.根據(jù)權利要求1所述生產蘋果酸的方法，其特征在于步驟b中所述活化種子液的接種按照活化種子液與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1:10-20進行；所述震蕩培養(yǎng)為在轉速 180-700 rpm 下培養(yǎng) 144-168 小時；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為糖 90_100g/L、NH4N03 2-4g/L,KH2PO4 0. 05-0. 2g/L、ZnSO4 0. 05-0. 2g/L、MgSO4 0. 05-0. 2g/L、玉米菜 0. 5_2g/L 和 CaCO3 20-50 g/L；所述玉米秸稈水解液的制備方法是取玉米秸稈，粉碎，按照固液體積比為1:5-10加水，用硫酸調節(jié)PH至2. 5，加熱至100°C水解1-5小時，然后用氫氧化鈣中和，加入纖維素酶和半纖維素酶，50°C恒溫水解1-10小時，過濾，收集濾液，得玉米秸稈水解液；所述木質纖維素水解液的制備方法是取木質纖維，粉碎，用質量分數(shù)為7%的硫酸浸泡 2小時，加熱至160-200°C水解2-10分鐘，然后用生石灰中和，剩余殘渣再用質量分數(shù)為21 的硫酸在溫度為180-240°C水解2-10分鐘，過濾，收集濾液，得木質纖維素水解液。
4.根據(jù)權利要求1所述生產蘋果酸的方法，其特征在于步驟c中所述用乙醇沉淀為加入相當于發(fā)酵液體積1-4倍的質量分數(shù)95%的乙醇溶液，4°C冷凍12-36小時；所述固液分離為在轉速不低于3000rpm的條件下離心不少于5分鐘。
5.根據(jù)權利要求4所述生產蘋果酸的方法，其特征在于步驟c所述用乙醇沉淀為加入相當于發(fā)酵液體積2倍的質量分數(shù)95%的乙醇溶液，4°C冷凍M小時；固液分離為在轉速 3500rpm的條件下離心45分鐘。
6.根據(jù)權利要求1所述生產蘋果酸的方法，其特征在于步驟d中所述酸水解為將聚蘋果酸溶解于濃度為2mol/L的硫酸、鹽酸或磷酸中的至少一種，溫度為70-95°C水解7_15 小時。
7.根據(jù)權利要求6所述生產蘋果酸的方法，其特征在于步驟d中所述酸水解為將聚蘋果酸溶解于濃度為2mol/L的硫酸中，溫度為85°C水解10小時。
8.根據(jù)權利要求1所述生產蘋果酸的方法，其特征在于步驟e中所述濃縮是在溫度低于80°C、真空度不低于IMpa的條件下進行，濃縮液的濃縮比大于10 ；所述結晶在4°C下冷凍結晶。
9.根據(jù)權利要求8所述生產蘋果酸的方法，其特征在于步驟e中所述濃縮是在溫度為80°C、真空度為IMpa的條件下進行，濃縮液的濃縮比為10。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生產蘋果酸的方法，具體步驟為將出芽短梗霉接種于種子培養(yǎng)基，溫度為23-30℃震蕩培養(yǎng)，得活化種子液；將所得活化種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，溫度為23-30℃震蕩培養(yǎng)144小時以上，固液分離，收集液體，得發(fā)酵液；將所得發(fā)酵液用乙醇沉淀，固液分離，收集沉淀，得聚蘋果酸；將所得聚蘋果酸進行酸水解，得水解液；最后將所得水解液濃縮，結晶，制得蘋果酸；本發(fā)明的生產蘋果酸的方法工藝步驟簡單，蘋果酸產率高，適合于大規(guī)模生產。
文檔編號C12P7/46GK102492734SQ20111042966
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月20日 優(yōu)先權日2011年12月20日
發(fā)明者鄒祥 申請人:西南大學