專利名稱：基因OsSRK1在控制水稻葉片長度和寬度中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種控制水稻葉片大小的基因 OsSRKl的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻葉面積對水稻干物質(zhì)積累和產(chǎn)量具有重要意義。水稻干物質(zhì)的90%以上是通過綠色葉片進(jìn)行光合作用積累的，葉鞘和莖的光合作用很弱。而在水稻葉片進(jìn)行光合作用時(shí)，葉面積和光合速率是兩個(gè)決定干物質(zhì)增長的主要因素，其中葉面積的貢獻(xiàn)占整個(gè)干物質(zhì)增長的70%。由此可見，維持一定的葉面積，對水稻的干物質(zhì)積累和產(chǎn)量都具有重要意義。植物葉器官大小不僅受環(huán)境(如光照、水分和營養(yǎng)等)影響，而且受到嚴(yán)格的遺傳調(diào)控。就遺傳調(diào)控來說，植物成熟葉片大小受兩個(gè)不同的過程控制細(xì)胞分裂和細(xì)胞擴(kuò)張。通常情況下，細(xì)胞分裂和細(xì)胞擴(kuò)展協(xié)同調(diào)控器官大小。目前，擬南芥葉器官發(fā)育的分子機(jī)制研究的比較清楚。一旦從頂端分生組織中分化，葉原基通過細(xì)胞擴(kuò)展和細(xì)胞分裂而增大。隨后葉原基通過細(xì)胞擴(kuò)展和核內(nèi)復(fù)制開始縱向延伸。核內(nèi)復(fù)制提高了細(xì)胞倍性，導(dǎo)致細(xì)胞變大。上述葉器官發(fā)育中的任一環(huán)節(jié)的改變都能夠影響葉面積。根據(jù)基因通過調(diào)控細(xì)胞擴(kuò)展還是調(diào)控細(xì)胞分裂而影響葉片大小，可以把這些基因分成如下幾類第一類基因?qū)θ~片大小的調(diào)控主要是通過影響葉片細(xì)胞數(shù)目而實(shí)現(xiàn)的，對細(xì)胞大小沒有影響。如GRF5 (Growth-regulating factoid)基因編碼一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)該基因的表達(dá)受到抑制時(shí)，葉片細(xì)胞數(shù)目減少，葉片變??；相反，過量表達(dá)GRF5導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株葉片細(xì)胞數(shù)目增多，葉片變大(Horiguchi et al.，Plant J. 2005，43 :68-78)。PEAPOD1 (PPDl) 和PPD2編碼植物特異的DNA結(jié)合蛋白，抑制這些基因的表達(dá)增加了細(xì)胞數(shù)目，葉片變大 (White, Proc Natl Acad Sci USA，2006，103 13238-13243)。AVPl 基因編碼液泡膜定位的、依賴于焦磷酸的H+泵，該基因缺失突變導(dǎo)致葉片細(xì)胞數(shù)目減少，葉面積變??；然而，過量表達(dá)AVPl的擬南芥植株葉片的細(xì)胞數(shù)目增多，葉面積變大(Li et al. , Science, 2005, 310:121-125)。BRIl基因過量表達(dá)也通過增加細(xì)胞數(shù)目而導(dǎo)致葉片變大(Gonzalez et al.，Plant Physiol.，2010，153 :1261-1279)。第二類基因通過調(diào)控細(xì)胞周期活性而影響葉片細(xì)胞數(shù)目，但同時(shí)也拮抗性地調(diào)控細(xì)胞大小，從而彌補(bǔ)因細(xì)胞數(shù)目改變而對葉片大小的影響。這類基因往往在葉片發(fā)育的早期起作用，如ANGUSTIF0LIA3和AINTEGUMENTA基因(Mizukami and Fischer, ProcNatl Acad Sci USA，2000，97 :942-947)。JAW 基因過量表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片變大，葉片的細(xì)胞數(shù)目增多，但細(xì)胞變小(Gonzalez et al., PlantPhysiol.，2010，153 :1261-1279) 第三類基因通過調(diào)控細(xì)胞大小而影響葉片大小。 如過量表達(dá)EXP10和ARG0S-LIKE基因能夠增大細(xì)胞，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株葉器官變大(Cho and Cosgrove,ProcNatl Acad Sci USA,2000,97 :9783-9788 ；Hu et al. ,Plant J.，2005， 47 1-9)；第四類基因能夠同時(shí)影響細(xì)胞分裂和細(xì)胞擴(kuò)展，這類基因包括ARF2，EBPl, HRCl 禾口GA200X1(Okushima et al. ,Plant J.，2005，43 :29-46 ；Horvath et al.，EMBO J.，2006，25 :4909-4920 ；Century et al. , Plant Phsiol. ,2008,147 :20-29 ；Gonzalez et al., Plant Physiol.，2010，153 :1261-1279)。目前，世界主要糧食作物水稻、小麥和玉米都是單子葉植物，但是人們對這些單子葉作物葉片發(fā)育和葉器官大小調(diào)控的分子機(jī)制缺乏了解，所以調(diào)控這些作物葉器官大小的分子育種還有很大的盲目性。本發(fā)明在水稻品種日本晴中，增強(qiáng)編碼水稻S-型受體激酶(OsSRKl)基因的表達(dá)水平，顯著提高了苗期及成株水稻葉面積。因此，在水稻中過量表達(dá)OsSRKl基因?qū)τ谔岣咚靖晌镔|(zhì)積累和產(chǎn)量都具有重要意義，這為水稻的高產(chǎn)分子設(shè)計(jì)育種提供了新思路。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，從水稻品種日本晴中分離克隆到一個(gè)編碼 S"型受體激酶的OsSRKl基因，該基因在水稻中過量表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因陽性植株苗期葉片寬度和長度，以及旗葉的寬度和長度均明顯高于非轉(zhuǎn)基因植株，表皮細(xì)胞寬度變大。因此， 在植物中過量表達(dá)OsSRKl基因?qū)τ谔岣咦魑锶~面積具有重要意義，這為提高作物光能利用率提供新的思路。本發(fā)明申請人在一個(gè)葉面積增大的突變體中，利用基因表達(dá)圖譜鑒定到一個(gè)序列號為AK068992的、編碼S-類受體激酶的OsSRKl基因的信使RNA序列。水稻OsSRKl基因信使RNA序列為1707個(gè)堿基，編碼444個(gè)氨基酸。本發(fā)明是通過PCR方法，擴(kuò)增出水稻品種日本晴的OsSRKl基因的全長編碼區(qū)，包含1335個(gè)堿基，正向連接在植物表達(dá)載體 pCAMBIA1390-ubi上；再進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化至水稻品種日本晴中，提高OsSRKl基因的表達(dá)，得到 OsSRKl基因表達(dá)增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因水稻植株。在轉(zhuǎn)基因的T3代植株中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因水稻陽性植株的葉片長度和寬度明顯高于非轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明用于構(gòu)建過量表達(dá)OsSRKl基因的植物表達(dá)載體、增強(qiáng)OsSRKl基因表達(dá)的 DNA序列如SEQ ID NO 1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明利用水稻品種日本晴的OsSRKl基因的cDNA片段作為應(yīng)用基因，將該基因正向轉(zhuǎn)入水稻中，提高OsSRKl基因的表達(dá)水平，轉(zhuǎn)基因水稻植株表現(xiàn)出表皮細(xì)胞擴(kuò)大， 水稻苗期葉片長度和寬度增大20-40%，水稻抽穗期旗葉寬度提高了 15-23%，長度提高了 7-18%。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明提供了一種通過影響表皮細(xì)胞擴(kuò)展而增大葉片長度和寬度的水稻基因 OsSRKl的應(yīng)用。申請人在水稻中過量表達(dá)OsSRKl基因表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因陽性水稻苗期葉片長度和寬度增大20-40%，水稻抽穗期旗葉寬度提高了 15-23%，長度提高了 7-18%。(2)本發(fā)明首次分離克隆了水稻OsSRKl基因，并首次在水稻中過量表達(dá)了 OsSRKl 基因。為培育葉面積提高的水稻品種提供了新的思路，也為其它作物利用異源基因技術(shù)提高葉面積提供了理論支持。(3)本發(fā)明中應(yīng)用的基因可以為水稻等禾谷類作物以及其它作物葉面積提高研究提供支持。


圖1為本發(fā)明的OsSRKl基因表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。將克隆在pMDIS-T載體上的OsSRKl基因利用BamHI和SpeI酶切，替換pCAMBIA1390_ubi植物表達(dá)載體上BamHI 和SpeI之間的DNA片段，這樣OsSRKl基因正向插入玉米泛素基因啟動(dòng)子(Pubi)后，即 pCAMBIA1390-ubi-SRKl 植物表達(dá)載體。圖2為檢測T3代轉(zhuǎn)基因水稻陽性植株中OsSRKl基因轉(zhuǎn)錄本水平結(jié)果圖。其中 OsSRKl/WT表示轉(zhuǎn)OsSRKl基因的植株，#1、#2和#8代表不同陽性轉(zhuǎn)基因株系；OsUBQ編碼水稻的泛素，作為水稻的內(nèi)參基因；WT代表野生型水稻植株。圖3為轉(zhuǎn)OsSRKl基因水稻植株和野生植株苗期葉片相對長度和葉片相對寬度比較。其中#1、#2和#8代表不同陽性轉(zhuǎn)基因株系；WT代表野生型水稻植株。分別用非轉(zhuǎn)基因WT植株相同葉位葉片的長度或者寬度作為100%。圖4為轉(zhuǎn)OsSRKl基因水稻植株和野生植株苗期葉片第二葉和第三葉比較圖。其中#1、#2和#8代表不同陽性轉(zhuǎn)基因株系；WT代表野生型水稻植株。圖5為轉(zhuǎn)OsSRKl基因水稻植株和野生植株抽穗期旗葉相對寬度和旗葉相對長度比較。其中#1、#2和#8代表不同陽性轉(zhuǎn)基因株系；WT代表野生型水稻植株。分別用非轉(zhuǎn)基因WT植株的旗葉寬度和長度作為100%。圖6為轉(zhuǎn)OsSRKl基因水稻植株和野生型植株的每個(gè)視野內(nèi)表皮細(xì)胞列數(shù)比較。其中#1、#2和#8代表不同陽性轉(zhuǎn)基因株系；WT代表野生型水稻植株。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例定義了本發(fā)明，并描述了本發(fā)明在分離克隆用于構(gòu)建OsSRKl基因植物表達(dá)載體的DNA片段，以及驗(yàn)證功能的方法。根據(jù)以下的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其使用不同的用途和條件。實(shí)施例1 分離克隆用于構(gòu)建OsSRKl基因植物表達(dá)載體的DNA片段采用TRIZOL試劑(Invitrogen)從水稻品種日本晴(公開報(bào)道的一個(gè)品種)的葉片中提取總RNA。具體步驟如下將20毫克葉片放至液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮快速磨成粉末，將粉末裝入1. 5ml離心管中，迅速加入Iml Trizol (Invitrogen)顛倒混勻，室溫靜置 5分鐘。在4°C，12000rpm離心10分鐘，取上清液移至新的1. 5ml離心管中。加入200 μ 1 氯仿，用手劇烈搖動(dòng)15秒鐘，室溫靜置2-3分鐘。4°C，12000rpm離心15分鐘。取無色水相至一新的1. 5ml離心管中，加入250 μ 1異丙醇，250 μ 1高鹽溶液，顛倒混勻，15°C 30°C室溫靜置10分鐘。4°C，12000rpm離心10分鐘，吸除上清液。加入Iml冰冷的75%乙醇，上下倒置幾次，然后4°C，7500rpm離心5分鐘，棄上清，在室溫干燥至沉淀變透明。加入適量的DEPC水(一般為60 μ 1)溶解沉淀，利用紫外分光光度計(jì)測定RNA的濃度。利用反轉(zhuǎn)錄酶SuperScript II (Invitrogen)將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體步驟如下 依次加入 1 μ 1 500 μ g/ml oligo (dT) 12-18,2μ g 總 RNA、1 μ 1 IOmM dNTP 混合物和 DEPC 水至12 μ 1，在65°C水浴中5分鐘，迅速冰浴5分鐘，稍微離心收集樣品于管底。然后依次加 Λ4μ 1 5 X 第一鏈緩沖液、2 μ 1 0. IM DTTiPlyl RNaseOUT (40U/μ 1)，42°C，2 分鐘。然后加入1 μ ISuperScript II，輕微混合均勻，42°C反應(yīng)50分鐘，然后70°C水浴15分鐘使酶失活，這樣就合成了第一鏈cDNA，以第一鏈cDNA為模板擴(kuò)增目的基因。擴(kuò)增所用的上游引物是ossrkifi (5，-aag gat cca tgt ctg ctaatc ccaac_3，，seq id no :3)，在序列特異引物外加BamHI位點(diǎn)和兩個(gè)保護(hù)堿基；所用的下游引物是0sSRKlRl(5，-GCA CTA GTTTAA CAA TGT AAT GAT CCA A_3’，SEQ ID NO :4)，在序列特異引物外加SpeI位點(diǎn)和兩個(gè)保護(hù)堿基。利用 PrimerSTAR HS DNA polymerase with GC buffer (TaKaRa)進(jìn)行擴(kuò)增目的片段，PCR反應(yīng)條件是94°C預(yù)變性1分鐘；980C 10 #, 680C 15秒，30個(gè)循環(huán)。利用TArgetClone TM-Plus 試劑盒(Τ0Υ0Β0)在PCR產(chǎn)物末端加A。然后連接到PMD18-T載體(TaKaRa)。篩選陽性克隆并測序，獲得所需DNA片段(序列如SEQ ID NO :1所示)，將該克隆命名為pMD18_0sSRKl cDNA。實(shí)施例2 =OsSRKl基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建和水稻遺傳轉(zhuǎn)化為了能更好地分析OsSRKl的功能，申請人通過過量表達(dá)技術(shù)使OsSRKl基因在水稻中表達(dá)水平提高。根據(jù)轉(zhuǎn)基因植株的表型和生理特征研究該基因的功能。OsSRKl基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法如下首先將實(shí)施例1中得到的陽性克隆pMD18-0sSRKl cDNA用BamHI和SpeI雙酶切，回收插入片段；用同樣的方法酶切 pCAMBIA1390-ubi的植物表達(dá)載體，回收載體片段。用回收的插入片段和載體片段做連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-Blue。通過酶切篩選陽性克隆，獲得植物表達(dá)載體，命名為 pCAMBIA1390-ubi-SRKl (見圖1)。pCAMBIA1390_ubi是在國際常用的植物遺傳轉(zhuǎn)化載體(見圖 1)。將 pCAMBIA1390-ubi-SRKl 轉(zhuǎn)化至 EHA105 宿主菌。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系(參見本發(fā)明后面的實(shí)施例)將其導(dǎo)入到水稻品種日本晴中，經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、移苗得到轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系在Hiei等人報(bào)道的方法基礎(chǔ)上改良進(jìn)行(Hiei等，1994，Plant J.，6 =271-282)。轉(zhuǎn)化共獲得24株獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因水稻植株。具體步驟如下(1)愈傷誘導(dǎo)去殼的野生型日本晴水稻種子，用70%乙醇表面消毒1分鐘；5% (活性氯含量)Naao溶液表面消毒20分鐘；無菌水沖洗4-5次；播種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織(成分見后)，于25-26°C暗培養(yǎng)4-7天后，將從成熟胚盾片處誘導(dǎo)出初生愈傷組織，同時(shí)用鑷子去掉胚上長出的胚芽，繼代于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2周，直至長出色澤淡黃，質(zhì)地堅(jiān)硬呈顆粒狀的胚性愈傷組織。(2)愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)將愈傷組織轉(zhuǎn)至新鮮的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，于25-26°C 暗培養(yǎng)4天。(3)農(nóng)桿菌培養(yǎng)挑取農(nóng)桿菌單克隆接種到5mL YEP液體培養(yǎng)基中(含有50mg/L 的卡那霉素)J8°C，220rpm，培養(yǎng)至對數(shù)生長晚期(大約培養(yǎng)18- 小時(shí))。將獲得的菌液按接種量轉(zhuǎn)接到50mL新鮮的、含有50mg/L卡那霉素的AB液體培養(yǎng)基中(成分見后)； 280C，220rpm,培養(yǎng)至0D600值為0. 5左右(培養(yǎng)5-6小時(shí))。(4)農(nóng)桿菌侵染把50mL菌液轉(zhuǎn)入離心管，4°C，4000g離心10分鐘，棄上清，加入等體積的AAM培養(yǎng)基重懸菌體。把0)的日本晴胚性愈傷組織浸入上述AAM菌液，侵染2 分鐘，緩慢搖動(dòng)。用無菌吸水紙將愈傷組織吸干，置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基上鋪一層無菌濾紙)，，黑暗共培養(yǎng)2-3天。(5)愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)共培養(yǎng)后的愈傷組織用無菌水洗4次，然后再用含 500mg/L羧芐青霉素Cb的無菌水洗2次，再用無菌吸水紙吸干后置于工作臺(tái)吹30分鐘。將愈傷組織置于固體篩選培養(yǎng)基(含有25mg/L潮霉素，400mg/L羧芐青霉素)上，26°C暗培養(yǎng) 2周。然后轉(zhuǎn)移到固體篩選培養(yǎng)基(含有30mg/L潮霉素，300mg/L羧芐青霉素)上，^TC暗培養(yǎng)，每2周繼代一次，篩選4周。(6)分化培養(yǎng)把抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)7天，轉(zhuǎn)接一次后，培養(yǎng)至產(chǎn)生再生苗。(7)壯苗、移栽將再生的小植株轉(zhuǎn)至新鮮的1/2MS培養(yǎng)基上，于培養(yǎng)瓶中生根壯苗。待小苗長至IOcm左右，打開封口膜，煉苗2-3天，將再生苗移至土中培養(yǎng)。試劑配方(1)試劑和溶液縮寫本發(fā)明中作用到的植物激素的縮寫表示如下 Cb (Cabenici 11 in，羧節(jié)青霉素)；KT(Kinetin，激動(dòng)素)；NAA (Napthalene acetic acid,萘乙酸)；2，4-DQ，4-Dichlorophenoxyacetic acid,2,4- 二氯苯氧乙酸)； AS(Acetosyringone，乙酰丁香酮)；DMSO (Dimethyl sulfoxide，二甲基亞砜)。(2)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方DYEP液體培養(yǎng)基2gBacto-蛋白胨，2g酵母粉，IgNaCl，加水定容至200mL，用5N NaOH 調(diào) PH 至 7. 0。2)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6大量，N6微量，鐵鹽，N6維生素，0. 5g/L酸水解酪蛋白， 30g/L 蔗糖，2mg/L 2,4-D, Gelrite (Sigma) 4g/L, pH 5.8。3)AB 液體培養(yǎng)基3g/L K2HPO4, lg/L NaH2PO4, lg/L NH4Cl, 300mg/L MgSO4 · 7H20， 150mg/L KCl, lOmg/L CaCl2 · 2H20, 2. 5mg/L FeSO4 · 7H20，5g/L 葡萄糖，pH 7. 0。4) AAM培養(yǎng)基AA大量，AA微量，0. 9g/L L-谷氨酰胺，0. 3g天冬氨酸，MS維生素， 0. 5g/L 酸水解酪蛋白，36g/L 葡萄糖，68. 5g/L 蔗糖，20mg/LAS，pH 5. 2。5)共培養(yǎng)培養(yǎng)基N6大量，N6微量，鐵鹽，N6維生素，30g/L蔗糖，10g/L葡萄糖， 0. 5g/L 酸水解酪蛋白，2mg/L 2,4-D, 20mg/LAS, Gelrite (Sigma) 4g/L, pH 5.8。6)固體篩選培養(yǎng)基N6大量、N6微量和N6維生素，0. 5g/L酸水解酪蛋白，30g/L 蔗糖，2mg/L 2,4-D, Gelrite (Sigma) 4g/L, pH 5. 8，合適濃度的潮霉素和羧芐青霉素。7)分化培養(yǎng)基MS大量，MS微量，鐵鹽和MS維生素，2g/L酸水解酪蛋白，30g/L蔗糖，30g/L 山梨醇，2mg/L KT, 0. 2mg/L NAA，pH 5. 8，30mg/L 潮霉素 B，200mg/L 羧芐青霉素。8) 1/2MS 培養(yǎng)基1/2MS 大量，1/2MS 微量，MS 維生素，30g/L 蔗糖，4g/L Gelrite， 30mg/L潮霉素B，200mg/L羧芐青霉素，pH 5. 8.(3)主要溶液配方1)N6 大量元素(IOX)
KNO328.3 g
KH2PO44.0 g
MgS04-7H201.85 g
CaCl2-2H201.66 g
(NH4)2SO44.63 g
用水定容IL2)N6 微量(1000X)
MnSCMH2O4.400 g
ZnS04-7H201.500 g
H3BO31.600 g
KI0.800 g
NaMo04-2H200.250 g用水定容IL3) N6 維生素(1000X)
甘氨酸200 mg
鹽酸硫胺素BlIOOmg
鹽酸吡哆素B650 mg
煙酸50 mg
肌醇IOg用水定容IOOmL3)MS 大量元素(IOX)
KNO319.0 g
NH4NO316.5 g
KH2PO41.7g
MgS04-7H203.7 g
CaCl2-2H204.4 g用水定容IL4)MS 微量(1000X)MnS04-4H2022.300g
ZnS04-7H208.600 g
H3BO36.200 g
KI0.830 g
NaMo04-2H200.250 g
CuSO4-5H200.025 g
CoC12-6H200.025 g用水定容IL5)MS 維生素(1000X)
甘氨酸200 mg
鹽酸硫胺素BlIOmg
鹽酸吡哆素B650 mg
煙酸50 mg
肌醇10 g用水定容IOOmL6)鐵鹽 QOO X)FeSO4. 7H205. 56gNa2EDTA. 2H20 7. 46g7)AA 大量 QOOΧ)
MgS04.7H205 g
CaCl2-2H203 g
NaH2PO43 g
KCl60 g8) AA 微量(1000X)MnSO4-H2O10.0 g
ZnS04-7H202.0 g
H3BO33 .0 g
KI0.75 g
NaMoO4-H2O0.250 g
CuSO4-5H200.025 g
CoC12-6H200.025 g用水定容IL9) 2,4-D 儲(chǔ)存液 Qmg/ml)稱取2，4-D lOOmg，溶于Iml DMSO，加入蒸餾水定溶至49ml，然后加入0. 5N NaOH, 至完全溶解，于-20°C保存。10) Kinetin 儲(chǔ)存液(0. 2mg/ml)稱取Kinetin 10mg，溶于Iml IN K0H，加蒸餾水定溶至50ml，于4°C保存。11) NAA 儲(chǔ)存液(0. 2mg/ml)稱取NAA 10mg，溶于0.5ml IN K0H，加蒸餾水定溶至50ml，于4°C保存。12)乙酰丁香酮(100mg/ml)稱取乙酰丁香酮lOOmg，溶于Iml DMS0，于_20°C保存。13)卡那霉素(50mg/ml)稱取卡那霉素500mg，溶于8ml蒸餾水中，加蒸餾水定溶至10ml，然后用0. 22 μ m 濾器過濾除菌，于_20°C保存。實(shí)施例3 檢測轉(zhuǎn)基因水稻植株和野生型水稻中OsSRKl基因的轉(zhuǎn)錄本水平以水稻野生型日本晴品種和3個(gè)獨(dú)立的T3代轉(zhuǎn)基因水稻植株為材料，提取四葉期水稻葉片的RNA，利用RT-PCR檢測水稻葉片中OsSRKl基因的轉(zhuǎn)錄本水平。具體方法如下 采用TRIZOL試劑(Invitrogen)從上述材料收集0. 03g水稻葉片提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄酶 superscript II(Invitrogen)將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體步驟如實(shí)施例1的描述。用OsSRKl 基因的特異性上游引物 0sSRKlF2(5，-GTT CCA GCA TTT GGT CGC GTC_3，，SEQ ID NO :5)， 和下游引物 0sSRKlR2(5，-CGT CTT AGA GTT CGT GCT GC_3，，SEQ ID NO :6)。同時(shí)用水稻 OsUBQ 基因的特異上游引物 OsUBQ F (5，-ATC ACG CTG GAG GTG GAG T-3，，SEQ ID NO 7) 和特異下游引物 OsUBQ R(5，-AGG CCT TCT GGT TGT AGA CG-3，，SEQID NO 8)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，作為內(nèi)參基因。PCR反應(yīng)條件是94°C預(yù)變性3分鐘；94°C變性30秒，55°C退火30秒， 72°C延伸lmin，Mf循環(huán)。然后用1.5%瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物。結(jié)果表明，野生型植株中OsSRKl基因轉(zhuǎn)錄本水平明顯低于3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系#1、#2和#8，從而證明OsSRKl基因已整合到水稻基因組中并且在水稻中大量表達(dá)(圖2)。實(shí)施例4 轉(zhuǎn)OsSRKl基因水稻苗期葉片長度和寬度均提高本實(shí)施例分析了轉(zhuǎn)基因水稻植株和野生型水稻植株葉片的長度和寬度。具體步驟如下將轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的種子用70%乙醇表面消毒1分鐘；5% (活性氯含量)NaaO溶液表面消毒20分鐘；無菌水沖洗4-5次；播種于含有0. 4%的瓊脂培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶。在光照培養(yǎng)箱14小時(shí)光照，23°C 10小時(shí)黑暗)生長3天后，挑選生長一致的幼苗轉(zhuǎn)移至土中，在溫室中培養(yǎng)(自然條件)至四葉期，分別測定第二葉和第三葉的長度和寬度，以非轉(zhuǎn)基因野生型植株相同葉位葉片的長度和寬度作為100%，轉(zhuǎn)OsSRKl基因植株的葉片長度和寬度均提高了 20^-40% (圖3和圖4)。這些結(jié)果表明，轉(zhuǎn)OsSRKl基因植株苗期葉片長度和寬度均高于野生型。實(shí)施例5 轉(zhuǎn)OsSRKl基因植株水稻抽穗期旗葉長度和寬度提高本實(shí)施例分析了轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株旗葉葉片的長度和寬度。具體步驟如下轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株用70%乙醇表面消毒1分鐘；5% (活性氯含量)NaClO溶液表面消毒20分鐘；無菌水沖洗4-5次，在暗條件下萌發(fā)3天。隨后轉(zhuǎn)移到土壤中生長至三葉期，移栽至大田中培養(yǎng)至抽穗期。測定轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因野生型植株旗葉寬度和長度，分別以非轉(zhuǎn)基因野生型植株旗葉葉片的寬度和長度作為100%，轉(zhuǎn)OsSRKl基因植株的旗葉的寬度提高了 15-23%，長度提高了 7-18% (圖5)。這個(gè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)OsSRKl基因植株旗葉葉片寬度和長度均高于野生型。實(shí)施例6 轉(zhuǎn)OsSRKl基因植株表皮細(xì)胞變大本實(shí)施例分析了溫室中生長的T3代轉(zhuǎn)基因水稻植株和野生型水稻植株完全展開的第三葉葉片和旗葉的表皮細(xì)胞大小。具體步驟如下將轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的種子用70%乙醇表面消毒1分鐘；5% (活性氯含量)Naao溶液表面消毒20分鐘；無菌水沖洗 4-5次；播種于含有0.4%的瓊脂培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶。在光照培養(yǎng)箱14小時(shí)光照， 230C 10小時(shí)黑暗)生長3天后，挑選生長一致的幼苗轉(zhuǎn)移至土中，在溫室中培養(yǎng)(自然條件)至四葉期，早上10點(diǎn)選取野生型和轉(zhuǎn)基因水稻植株上的完整展開的第三片葉的中段位置，其中選取3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，每個(gè)株系分別選擇5個(gè)植株進(jìn)行重復(fù)。同時(shí)對大田中生長至抽穗期(具體步驟同實(shí)施例幻的野生型和轉(zhuǎn)基因水稻植株旗葉葉片的中段位置進(jìn)行取材， 其中選取3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，每個(gè)株系分別選擇5個(gè)植株進(jìn)行重復(fù)。將要觀察的葉片置于乙醇乙酸溶液(體積比為9 1)中固定Mh以上，用蒸餾沖洗2-3次，再置于水合氯醛溶液(甘油水合氯醛蒸餾水=1:8:1)中浸泡，然后移到載玻片上，覆以蓋玻片。采用Nikon TE 2000-E光學(xué)顯微鏡，在10 X 40倍下觀察，并使用軟件NIS-Elements F 3. O拍照，每張片子觀察10個(gè)視野。統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野內(nèi)所觀察到的表皮細(xì)胞的列數(shù)，結(jié)果表明，各轉(zhuǎn)基因株系第三葉葉片每個(gè)視野中的細(xì)胞列數(shù)約為21 22列，而野生型每個(gè)視野中細(xì)胞列數(shù)則約為25列(圖6)。相似地，各轉(zhuǎn)基因株系旗葉葉片每個(gè)視野中的細(xì)胞列數(shù)較野生型旗葉葉片少2-3列。據(jù)此推測轉(zhuǎn)OsSRKl基因水稻葉片表皮細(xì)胞大于野生型。這些結(jié)果表明 OsSRKl在轉(zhuǎn)基因水稻中過量表達(dá)能夠促進(jìn)表皮細(xì)胞的擴(kuò)大，這可能是導(dǎo)致葉片變寬的原因之一。
權(quán)利要求
1.基因OsSRKl在控制植物葉片長度和寬度中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的基因OsSRKl在控制植物葉片長度和寬度中的應(yīng)用，其特征是， 所述植物為水稻。
3.基因OsSRKl在控制水稻葉片長度和寬度中的應(yīng)用方法，其特征是，通過PCR方法，擴(kuò)增出水稻品種日本晴的OsSRKl基因的全長編碼區(qū)，正向連接在植物表達(dá)載體 pCAMBIA1390-ubi上；再進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化至水稻品種日本晴中，提高OsSRKl基因的表達(dá)，得到 OsSRKl基因表達(dá)增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因水稻植株。
全文摘要
本發(fā)明公開了基因OsSRK1在控制水稻葉片長度和寬度中的應(yīng)用。本發(fā)明通過PCR方法，擴(kuò)增出水稻品種日本晴的OsSRK1基因的全長編碼區(qū)，正向連接在植物表達(dá)載體pCAMBIA1390-ubi上；再進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化至水稻品種日本晴中，提高OsSRK1基因的表達(dá)，得到OsSRK1基因表達(dá)增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因水稻植株。在轉(zhuǎn)基因的T3代植株中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因水稻陽性植株的葉片長度和寬度明顯高于非轉(zhuǎn)基因植株。為培育葉面積提高的水稻品種提供了新的思路，也為其它作物利用異源基因技術(shù)提高葉面積提供了理論支持。
文檔編號C12N15/82GK102492703SQ20111043171
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月21日
發(fā)明者周晉軍, 張斌, 畢玉平, 程惠敏, 范仲學(xué), 謝先芝, 錢鳳芹, 顧建偉 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)研究中心