水稻小分子RNA osa-miRNA530在調(diào)控水稻葉夾角及葉片長(zhǎng)度中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及植物基因工程領(lǐng)域，具體設(shè)及一種水稻小分子RNAosa-miRNA530在調(diào) 控水稻葉夾角及葉片長(zhǎng)度中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是一種重要的糧食作物，也是單子葉植物研究的模式植物。葉片形態(tài)是水稻 "理想株型"的重要組成部分，是當(dāng)前水稻高產(chǎn)育種關(guān)注的重點(diǎn)。水稻葉片形態(tài)主要包括葉 片卷曲度、葉夾角、披散程度W及葉片大小等方面（徐靜等，作物學(xué)報(bào)，2013, 39:767-774)。 研究表明，直立葉片群體的光合效率高于平展或彎垂葉，能夠有效促進(jìn)光合作用和種子灌 漿，從而提高水稻的產(chǎn)量。
[0003] 前人研究表明，影響植株空間伸展姿態(tài)的葉夾角主要通過(guò)葉角基因調(diào)控油菜素 內(nèi)醋的信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)影響葉枕細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，此外其他多種植物激素，包括乙締、生長(zhǎng)素、 赤霉素，參與調(diào)控了植物葉夾角的大小。葉作為一種不對(duì)稱性的側(cè)生器官，在發(fā)育過(guò)程 中經(jīng)歷了 3個(gè)軸向的極性建成："基一頂"軸向（從葉基指向葉尖）、"近一遠(yuǎn)"軸向（上 表面一下表面）和"中一側(cè)"軸向（由中脈指向左右兩邊葉緣）化assonetal.，CR Biologies, 2010, 333:350-360)。水稻葉片形態(tài)建成極性建立是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，參與調(diào)控因 子間形成相互調(diào)節(jié)和括抗網(wǎng)絡(luò)。從目前的研究來(lái)看，I類KNOX基因家族，化及H-ZIPIII、 ΚΑΝΑDI和ARFs等基因家族的成員在水稻葉基頂軸、近遠(yuǎn)軸極性建立過(guò)程中具有重要作 用；同時(shí)，參與水稻側(cè)生器官極性建立及發(fā)育過(guò)程的基因中還受microRNA和ta-siRNA的 調(diào)控。目前為止，所有已克隆的葉形調(diào)控基因間相互調(diào)控關(guān)系的研究還不夠深入，還不能 明確水稻葉形建成和發(fā)育的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本發(fā)明從水稻日本晴中分離克隆到一個(gè)小分子 RNAosa-miR530,研究了其在調(diào)控水稻葉夾角和葉片長(zhǎng)度方面的作用。Liu等已經(jīng)在水稻中 預(yù)測(cè)了該microRNA的序列化iuBetal.，2005,PlantPhysiol, 139:296-305),但目前還 沒有任何相關(guān)功能研究的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明從水稻日本晴中分離克隆到microRNAosa-miR530,該microRNA的前體基 因pre-miR530在水稻中過(guò)量表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系和野生型對(duì)照相比，過(guò)表達(dá)株系葉夾 角和葉片長(zhǎng)度均變小。因此，在水稻中過(guò)量表達(dá)〇sa-miR530對(duì)于減小葉夾角，提高種植密 度，促進(jìn)水稻產(chǎn)量提高具有重要意義，運(yùn)也為水稻高產(chǎn)分子育種提供新的資源和研究方法。
[0005] 本發(fā)明申請(qǐng)人W水稻的一個(gè)microRNAosa-miR530為研究對(duì)象，研究了 osa-miR530在改變水稻葉夾角及葉片大小方面的作用及應(yīng)用。osa-miR530的成熟體序 列為20bp核酸序列（5'-TGCATTTGCACCTGCACCTA-3'；沈QIDN0:1)。其前體序列大小為 15化p(SEQIDN0:2)。本發(fā)明利用水稻日本晴葉片的cDNA作為模板，利用PCR的方法擴(kuò)增 出水稻osa-miR530的前體基因，將其正向連接在植物表達(dá)載體pCAMBIA1390-ubi上，并通 過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化水稻，從而獲得超量表達(dá)〇sa-miR530的轉(zhuǎn)基因水稻植 株。在T3代轉(zhuǎn)基因植株中，陽(yáng)性植株的葉夾角和葉片長(zhǎng)度均顯著低于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓辍?葉夾角降低了約50%，長(zhǎng)度降低約20-30%。
[0006] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0007] (1)本發(fā)明首次分離克隆了 〇sa-miR530及其前體基因，并在水稻中過(guò)量表達(dá)了 osa-miR530。提供了一種通過(guò)調(diào)控miRNA的表達(dá)來(lái)調(diào)控葉夾角大小和葉片長(zhǎng)度的方法。
[0008] (2)本發(fā)明的miRNA osa-miR530能成功調(diào)控水稻葉夾角和葉片長(zhǎng)度，運(yùn)有助于明 確osa-miR530在調(diào)控植物株型形態(tài)建成過(guò)程中的作用機(jī)制。
[0009] (3)由于植物microRNA序列和功能的高度保守性，本發(fā)明的結(jié)果對(duì)于研究水稻等 禾谷類作物W及其它植物miR530在植物株型調(diào)控中的作用具有重要價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1為本發(fā)明的〇sa-miR530表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。將克隆在PMD18-T載體 上的osa-miR530利用BamHI和Spel酶切，替換pCAMBIA1390-ubi植物表達(dá)載體上BamHI 和Spel之間的DNA片段，運(yùn)樣osa-miR530正向插入玉米泛素基因啟動(dòng)子（Pubi)后，即 pCAMBIA1390-ubi-0sa-miR530 植物表達(dá)載體。
[0011] 圖2為檢測(cè)T3代轉(zhuǎn)基因水稻陽(yáng)性植株中osa-miR530轉(zhuǎn)錄本相對(duì)表達(dá)水平結(jié)果 圖。其中osa-miR530-〇x表示轉(zhuǎn)osa-miR530的植株，#日-1、#日-4、抓-1、抓-2和#c-l代表 獨(dú)立的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系；WT代表野生型水稻植株。邸-la作為巧光定量PCR分析的內(nèi)參基 因。
[0012] 圖3為轉(zhuǎn)osa-miR530水稻植株和野生型植株在成熟期葉夾角比較圖。A圖是成熟 期植株劍葉夾角比較圖；B圖是成熟期植株葉夾角對(duì)比統(tǒng)計(jì)圖。其中osa-miR530-〇x表示 轉(zhuǎn)osa-miR530的植株，#曰-1、抓-1和#c-l代表獨(dú)立的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系；WT代表野生型水 稻植株。**表示根據(jù)TTEST統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異極顯著任<0.01)。
[0013] 圖4為轉(zhuǎn)osa-miR530水稻植株和野生型植株在成熟期葉片長(zhǎng)度對(duì)比統(tǒng)計(jì)圖。A圖 是成熟期植株主莖劍葉和倒二葉葉片長(zhǎng)度比較圖；B圖是成熟期植株劍葉和倒二葉葉片長(zhǎng) 度對(duì)比統(tǒng)計(jì)圖。其中〇sa-miR530-〇x表不轉(zhuǎn)osa-miR530的植株，#日-1、抓-1和#c-l代表 獨(dú)立的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系；WT代表野生型水稻植株。**表示根據(jù)TTEST統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異極顯 著（P<0. 01)。
【具體實(shí)施方式】
[0014] W下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，并描述了本發(fā)明在分離克隆〇sa-miR530、 構(gòu)建表達(dá)載體W及驗(yàn)證功能的方法。根據(jù)W下的描述和實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W確定 本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可W對(duì)本發(fā)明做出各種改 變和修改，W使其使用不同的用途和條件。
[0015] 實(shí)施例1 :osa-miR530前體基因DNA片段的克隆
[0016] 采用TRIZ化試劑（Invitrogen)從水稻品種日本晴幼苗葉片中提取總RNA。具體步 驟如下：將20毫克葉片放至液氮預(yù)冷的研鉢中，加入液氮快速磨成粉末，將粉末裝入1. 5ml 離屯、管中，迅速加入1mlTrizol(Invitrogen)顛倒混勻，室溫靜置5分鐘。在4°C，12000巧m 離屯、10分鐘，取上清液移至新的1. 5ml離屯、管中。加入200μ1氯仿，用手劇烈搖動(dòng)15秒 鐘，室溫靜置2-3分鐘。4°C，12000巧m離屯、15分鐘。取無(wú)色水相至一新的1. 5ml離屯、管 中，加入250μ1異丙醇，250μ1高鹽溶液，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。4°C，12000rpm離 屯、10分鐘，吸除上清液。加入1ml冰冷的75%乙醇，上下倒置幾次，然后4°C，750化pm離屯、 5分鐘，棄上清，在室溫下干燥至沉淀變透明。加入適量的DEPC水（一般為60μ1)溶解沉 淀，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度。
[0017] 利用反轉(zhuǎn)錄酶SuperscriptII(Invitrogen)將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體步驟如下： 依次加入 1μ1 500μg/mloligo(dT) 12-18、2μg總RNA、1μ1lOmMdNTP混合物和DEPC 水至12μ1，在65°C水浴中5分鐘，迅速冰浴5分鐘，稍微離屯、收集樣品于管底。然后依 次加入4μ1 5X第一鏈緩沖液、2μ1 0. 1MDTT和 1μ1RNase0UT(40U/yl)，42°C，2 分 鐘。然后加入1μ1SuperscriptII，輕微混合均勻，42°C反應(yīng)50分鐘，然后70°C水浴15 分鐘使酶失活，運(yùn)樣就合成了第一鏈cDNA，W第一鏈cDNA為模板擴(kuò)增目的基因。通過(guò)網(wǎng)站 ht化://www.mirbase.org找到osa-miR530的成熟體和前體序列，具體序列信息如SEQID NO. 1和SEQIDNO. 2所示。根據(jù)osa-miR530前體序列，設(shè)計(jì)帶有BamHl酶切位點(diǎn)的上游 引物：530-0S(CGGGATCCGTGATAGAGCTGCATTTGCA，沈QIDNO:3)和帶有Spel酶切位點(diǎn)的下 游引物 530-0AS(GGACTAGTATGACATAGTTGCATCTGCCT，沈QIDN0:4)。W反轉(zhuǎn)錄得到的水稻 日本晴幼葉cDNA為模板，利用530-0S和530-0AS為引物，在TakaraExTaq燈aKaRa)的作 用下擴(kuò)增目的片段，PCR反應(yīng)條件是：94°C預(yù)變性3分鐘；94°C1分鐘，54°C30秒，72°C20 秒，30個(gè)循環(huán)，72°C后延伸10分鐘。將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后，連接到PMD18-TSimple載體 燈aKaRa)。篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序，獲得所需DNA片段（序列如SEQIDNO:2所示），將該克 隆命名為pMD18-〇sa-miR530cDNA。
[0018] 實(shí)施例2 :osa-miR530前體基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化
[0019] 為了能更好地分析osa-miR530的功能，申請(qǐng)人通過(guò)過(guò)量表達(dá)技術(shù)使osa-miR530 在水稻中表達(dá)水平提高。根據(jù)轉(zhuǎn)基因植株的農(nóng)藝性狀特征研究該基因的功能。
[0020] osa-miR530前體基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法如下：首先將實(shí)施例1中得到的 陽(yáng)性克隆pMD18-〇sa-miR530cDNA用BamHl和Spel雙酶切，回收插入片段；并用同樣的 方法酶切pCAMBIA1390-ubi的植物表達(dá)載體，回收載體片段。用回收的插入片段和載體片 段做連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊(cè)0。通過(guò)酶切篩選陽(yáng)性克隆，獲得植物表達(dá)載體，命名為 pCAMBIA1390-ubi-0sa-miR530(見圖1)。pCAMBIA1390-ubi是在國(guó)際常用的植物遺傳轉(zhuǎn)化 載體（見圖1)。將pCAMBIA1390-ubi-0sa-miR530轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌菌株EHA105。
[0021] 通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系（參見本發(fā)明后面的實(shí)施例）將其導(dǎo)入到水 稻品種日本晴中，經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、移苗 得到轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系在化ei等人報(bào)道的方法基礎(chǔ)上進(jìn)行改 良化iei等，1994,PlantJ. ,6:271-282)。轉(zhuǎn)化共獲得16株獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因水稻植株。 [00過(guò)具體步驟如下：
[002引 （1)愈傷誘導(dǎo)：去殼的野生型日本晴水稻種子，用70%乙醇表面消毒1分鐘；5% (活性氯含量）化CIO溶液表面消毒20分鐘；無(wú)菌水沖洗4-5次；播種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上 誘導(dǎo)愈傷組織（成分見后），于25-26Γ暗培養(yǎng)4-7天后，將從成熟胚盾片處誘導(dǎo)出初生愈 傷組織，同時(shí)用綴子去掉胚上長(zhǎng)出的胚芽，繼代于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2周，直至長(zhǎng)出 色澤淡黃，質(zhì)地堅(jiān)硬呈顆粒狀的胚性愈傷組織。
[0024] (2)愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)：將愈傷組織轉(zhuǎn)至新鮮的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，于25-26Γ 暗培養(yǎng)4天。
[00巧](3)農(nóng)桿菌培養(yǎng)：挑取農(nóng)桿菌單克隆接種到5mLYEP液體培養(yǎng)基中（含有50mg/L的卡那霉素），28°C，220rpm，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期（大約培養(yǎng)18-24小時(shí)）。將獲得的菌液 按1 %接種量轉(zhuǎn)接到50mL新鮮的、含有50mg/L卡那霉素的AB液體培養(yǎng)基中（成分見后）； 28°C，220巧m，培養(yǎng)至0D600值為0. 5左右（培養(yǎng)5-6小時(shí)）。
[0026](4)農(nóng)桿菌侵染：把50mL菌液轉(zhuǎn)入離屯、管，4°C，4000g離屯、10分鐘，棄上清，加入 等體積的AAM培養(yǎng)基重懸菌體。把（2)的日本晴胚性愈傷組織浸入上述AAM菌液，侵染2 分鐘，緩慢搖動(dòng)。用無(wú)菌吸水紙將愈傷組織吸干，置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上（培養(yǎng)基上鋪一層無(wú) 菌濾紙），26 °C，黑暗共培養(yǎng)2-3天。
[0027] (5)愈傷洗涂和選擇培養(yǎng)：共培養(yǎng)后的愈傷組織用無(wú)菌水洗4次，然后再用含 500mg/L簇節(jié)青霉素Cb的無(wú)菌水洗2次，再用無(wú)菌吸水紙吸干后置于工作臺(tái)吹30分鐘。將 愈傷組織置于固體篩選培養(yǎng)基（含有25mg/L潮霉素，400mg/L簇節(jié)青霉素）上，26°C暗培養(yǎng) 2周。然后轉(zhuǎn)移到固體篩選培養(yǎng)基（含有30mg/L潮霉素，300mg/L簇節(jié)青霉素）上，26°