專利名稱：飼料型四倍體刺槐葉片總rna的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，即一種飼料型四倍體刺槐葉片總RNA的提取方法。
背景技術(shù)：
刺槐屬豆科(Leguminosae)蝶形花亞科(Papilionaceae)植物，其葉片富含粗蛋白、糖、礦物質(zhì)和維生素，是一種開(kāi)發(fā)前景可觀的新型飼料，尤其是四倍體刺槐的葉片其蛋白和糖的含量更為豐富，深入研究飼料型四倍體刺槐的生物學(xué)特性，對(duì)于開(kāi)發(fā)優(yōu)質(zhì)飼料資源，提升飼養(yǎng)業(yè)水平，具有重要的意義?？墒牵捎陲暳闲退谋扼w刺槐葉片中富含大量的蛋白質(zhì)和多糖，使其總RNA的提取十分困難，限制了飼料型四倍體刺槐分子生物學(xué)層面的研究，使得四倍體刺槐的選育和開(kāi)發(fā)利用受到局限。RNA(植物總核糖核酸)的提取技術(shù)是一項(xiàng)植物分子生物學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一， 也是進(jìn)行植物分子生物學(xué)方面研究的必要前提。只有獲得純度高、完整性好的高質(zhì)量總 RNA，才能用于mRNA純化、Northern雜交、構(gòu)建cDNA文庫(kù)、通過(guò)RT-PCR分離基因以及進(jìn)行蛋白質(zhì)體外翻譯等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作。常用的植物組織總RNA提取方法有異硫氰酸胍法、SDS法、苯酚法、CTAB法、熱硼酸法、Trizol試劑盒法等。這些方法所用的核心試劑分別為異硫氰酸胍、SDS、CTAB和硼酸。 異硫氰酸胍能迅速破碎細(xì)胞，作為強(qiáng)變性劑使核酸一蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，并有效解離核蛋白與核酸的復(fù)合體，最終釋放出核酸。SDS(十二烷基硫酸鈉)是一種陰離子表面活性劑或離子去污劑，能從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸以及酸性多聚糖。CTAB(十六烷基三甲基氯化銨)作為陽(yáng)離子表面活性劑，能溶解細(xì)胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使RNA游離出來(lái)。硼酸緩沖體系可將蛋白酶K消化蛋白和LiCl選擇性沉淀RNA等步驟偶聯(lián)在一起。植物組織中的蛋白質(zhì)和多糖的大量存在，對(duì)RNA的純度和得率具有重要的影響， 四倍體刺槐尤其如此。實(shí)驗(yàn)表明，采用常規(guī)設(shè)備和普通化學(xué)試劑，難以有效地去除或抑制刺槐葉片破碎細(xì)胞中的蛋白質(zhì)等物質(zhì)的干擾，無(wú)法提取高質(zhì)量的RNA。采用高端設(shè)備和進(jìn)口材料，雖然可以獲得RNA，但仍存在著過(guò)程復(fù)雜，成本高，產(chǎn)品不穩(wěn)定，容易降解的問(wèn)題。因此， 從富含粗蛋白和多糖的刺槐葉片中抽提高質(zhì)量RNA，一直是業(yè)內(nèi)公認(rèn)的難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能從富含粗蛋白和多糖的飼料型四倍體刺槐葉片中提取和純化總RNA，且過(guò)程簡(jiǎn)單、操作方便、成本低廉、結(jié)果穩(wěn)定的方法。上述目的是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種飼料型四倍體刺槐葉片總RNA的提取方法，其特點(diǎn)是將四倍體刺槐葉片裝入離心管研磨成粉末，加入冰浴緩沖液和巰基乙醇，離心，棄去上清，向離心管中加入CTAB提取液和β-巰基乙醇混勻，離心，取上清液， 加水飽和酚和氯仿，混勻，離心，吸取上清液，加入無(wú)水乙醇和醋酸鉀溶液混勻，冰浴靜置后離心，棄去上清液，用70 %乙醇清洗后進(jìn)行離心，棄掉上清液，氣干，用適量DEPC處理過(guò)的ddH20徹底溶解RNA沉淀。所說(shuō)的飼料型刺槐葉片總RNA的提取方法，包括以下具體步驟(1)稱取0. 3g植物葉片直接放入1. 5mL的離心管中，并迅速放入液氮后，用更小的離心管將葉片研磨成粉末，加入700 μ 1冰浴緩沖液，60 μ 1 β-巰基乙醇，用旋渦混合器振蕩2-;3min混勻，在冰上放置IOmin后于4°C、12000g，離心lOmin。(2)棄去上清，向離心管中加入700 μ 1 CTAB提取液，50 μ 1 β-巰基乙醇，劇烈振蕩2-;3min混勻。(3)將離心管置于溫度為65°C的水浴7-9min，其間搖動(dòng)幾次。(4)將離心管從水中取出后迅速置于冰上，加入體積比為1 1的水飽和酚與氯仿共700 μ 1，劇烈振蕩2-3min混勻后于4°C，12000g，離心IOmin0(5)取上清于另一新的離心管中，加入1/2體積的無(wú)水乙醇和1體積的5mol/L醋酸鉀(pH 5. 8)，緩慢搖動(dòng)混勻，在冰上放置IOmin后于4°C，12000g,離心IOmin0(6)棄去上清，用75%乙醇清洗沉淀，緩慢混勻，4°C，12000g，離心5min。(7)棄去上清，瞬間離心徹底棄干，在通風(fēng)櫥中氣干5min，用DEPC處理過(guò)的ddH20 徹底溶解RNA沉淀。所說(shuō)的冰浴緩沖液是由100mmol/L 的 iTris-HCl (pH，8. 0)、25mmol/L 的 EDTA(pH， 8. 0)、2. Omol/L 的 NaCl 組成。所說(shuō)的CTAB提取液中加入了皂土。所說(shuō)的CTAB 提取液是由 2% 的 CTAB、0. 8% 的皂土、100mmol/L 的 Tris-HCl (pH， 8. 0)、25mmol/L 的 EDTA(pH, 8. 0),1. 4mol/L 的 NaClU % 的聚乙烯聚吡咯烷酮和 0. 1 % 的 DEPC組成。所說(shuō)的75%乙醇是由7. 5份無(wú)水乙醇和2. 5份DEPC處理過(guò)的ddH20配制，DEPC處理過(guò)的ddH20是由0. 1份DEPC加入99. 9份ddH20中漩渦混勻再經(jīng)高溫高壓滅菌的純水。本發(fā)明的有益效果是葉片直接在離心管里研磨，以減少操作時(shí)間和材料用量，利用加入皂土的提取液可更好的去除大量蛋白對(duì)RNA提取的干擾；利用氯仿/異戊醇只抽提一次，節(jié)省操作時(shí)間和費(fèi)用；加入高濃度和大體積的醋酸鉀以去除多糖，從而獲得高純度、 高產(chǎn)量且完整穩(wěn)定的RNA，可滿足反轉(zhuǎn)錄、基因克隆、轉(zhuǎn)錄組分析以及熒光定量PCR等分子生物學(xué)分析，且具有操作簡(jiǎn)便、成功率高、適用范圍廣、無(wú)降解、普通設(shè)備和國(guó)產(chǎn)化學(xué)試劑即可滿足要求等特點(diǎn)，為深入進(jìn)行飼料型刺槐以及同類植物的分子生物學(xué)研究提供了條件。


圖1未加入皂土的CTAB法提取的四倍體刺槐葉片的總RNA ；圖2利用Trizol提取的四倍體刺槐葉片的總RNA ；圖3SDS法提取的四倍體刺槐葉片的總RNA ；圖4SDS-CTAB法提取的四倍體刺槐葉片的總RNA ；圖5不同濃度皂土提取的四倍體刺槐葉片的總RNA。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明總的構(gòu)思是以普通設(shè)備和國(guó)產(chǎn)化學(xué)試劑為主，以消除蛋白和多糖的干擾
4為目標(biāo)，采用了在提取液中加入皂土、沉淀前加入大量醋酸鉀等去除過(guò)多蛋白質(zhì)及多糖的關(guān)鍵技術(shù)，進(jìn)而得到完整穩(wěn)定的RNA產(chǎn)品。具體做法是將刺槐葉片直接在離心管中研磨成粉末，加冰浴緩沖液和β-巰基乙醇，離心；棄去上清液，加提取緩沖液和β-巰基乙醇，振蕩混勻，熱水浴處理；加水飽和酚和氯仿，振蕩混勻，離心；吸取上清液加入無(wú)水乙醇和醋酸鉀溶液混勻、冰浴靜置后再離心，棄去上清液，用70%乙醇清洗后進(jìn)行離心，棄掉上清液， 氣干，用適量DEPC處理過(guò)的ddH20徹底溶解RNA沉淀。圍繞上述技術(shù)路線的實(shí)施方式是很多的，為了說(shuō)明問(wèn)題，下面僅介紹一個(gè)實(shí)施例制備ddH20 由0. 1份DEPC加入99. 9份ddH20中漩渦混勻再經(jīng)高溫高壓滅菌即得。制備75%的乙醇7. 5份無(wú)水乙醇和2. 5份DEPC處理過(guò)的ddH20配成。制備冰浴緩沖液100mmol/L的 Tris-HCl (pH，8. 0)，25mmol/L 的 EDTA(pH，8. 0)， 2.Omol/L 的 NaCl。制備CTAB 提取液2 % 的 CTAB，0. 8 % 的皂土，IOOmmol/L 的 Tris-HCl (ρΗ，8· 0)， 25mmol/L 的 EDTA(pH, 8. 0)，1. 4mol/L 的 NaCl，1 % 的聚乙烯聚吡咯烷酮和 0. 的 DEPC0取1. 5mL的離心管，預(yù)先加入600-800 μ 1冰浴緩沖液，60 μ 1 β -巰基乙醇，在冰
上放置備用；稱取0. 3g植物葉片，直接放入備用的1. 5ml離心管中，用小離心管做研磨棒將葉片研磨成粉末，與研磨后送入離心管的方法相比可節(jié)省時(shí)間約0. 5小時(shí)左右。用旋渦混合器振蕩2-;3min混勻，在冰上放置IOmin后于4°C，12000g，離心lOmin，棄去上清，向離心管中加入700 μ 1 CTA β提取液，50 μ 1 β -巰基乙醇，劇烈振蕩 2-3min 混勻；將離心管置于溫度為65°C的水浴7-9min，其間搖動(dòng)幾次；將離心管從水中取出后迅速置于冰上，加入體積比為1 1的水飽和酚與氯仿共 700μ 1，劇烈振蕩2-;3min混勻后于4°C，12000g，離心lOmin。取上清于另一新的離心管中， 加入1/2體積的無(wú)水乙醇和1倍體積的5mol/L醋酸鉀，緩慢搖動(dòng)混勻，在冰上放置IOmin 后于4°C，12000g，離心lOmin。醋酸鉀的用量一般不大于1/2體積和2mol/L的，此步驟中的醋酸鉀的用量超出常規(guī)用量，實(shí)驗(yàn)證明，常規(guī)用量難以達(dá)到去除多糖的效果。棄去上清，用75%乙醇清洗沉淀，緩慢混勻，4°C，12000g，離心5min。棄去上清，瞬間離心以達(dá)到徹底棄干的目的。在通風(fēng)櫥中氣干5min。用DEPC處理過(guò)的ddH20徹底溶解RNA沉淀。本方法所用的實(shí)驗(yàn)較多，下面僅例舉三個(gè)實(shí)驗(yàn)1.皂土濃度影響實(shí)驗(yàn) 皂土濃度分別以0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，得到圖5所示的效果。從圖5可以看出未加皂土?xí)r，雖然可以提出RNA，但是濃度較低，而加入的皂土濃度為0. 2% 和0. 4%時(shí)，提取的RNA帶型拖尾，而當(dāng)加入皂土濃度為0. 6%和0. 8%時(shí)，提取的RNA帶型較為清晰，當(dāng)皂土的濃度為1.0%時(shí)，帶型又變得模糊不清。因此在本發(fā)明中采用的皂土濃度為0.6%。2.不同提取方法的電泳對(duì)比實(shí)驗(yàn)圖1顯示了未加入皂土的CTAB法提取的四倍體刺槐葉片的總RNA，采用此法提取的RNA帶型模糊，較淺，得率較低，為347. 61% (見(jiàn)附表)；圖2顯示了利用Trizol法提取的四倍體刺槐葉片的總RNA，其帶型不明顯，而且在點(diǎn)樣孔中存在大量蛋白，同時(shí)采用該方法的RNA得率也較低，為325. 68% (見(jiàn)附表)；圖3顯示了利用SDS法提取的四倍體刺槐葉片的總RNA，利用該法提取的RNA帶型不明顯，且得率較低為347. 96% ；圖4顯示的是利用 SDS-CTAB法提取的四倍體刺槐葉片的總RNA，利用該方法提取的RAN帶型模糊，且得率較低為659. M%，且在點(diǎn)樣孔中存在大量蛋白；圖5是利用添加不同濃度皂土后所提取四倍體刺槐葉片的總的RNA。3.不同提取方法的得率對(duì)比實(shí)驗(yàn)附表說(shuō)明不同方法所提取的RNA純度和得率(表格中的數(shù)據(jù)為三次生物學(xué)重復(fù)的平均值)
權(quán)利要求
1.一種飼料型四倍體刺槐葉片總RNA的提取方法，其特征在于將四倍體刺槐葉片裝入離心管研磨成粉末，加入冰浴緩沖液和β-巰基乙醇，離心，棄去上清，向離心管中加入 CTAB提取液和β -巰基乙醇混勻，離心，取上清液，加水飽和酚和氯仿，混勻，離心，吸取上清液，加入無(wú)水乙醇和醋酸鉀溶液混勻，冰浴靜置后離心，棄去上清液，用70%乙醇清洗后進(jìn)行離心，棄掉上清液，氣干，用適量DEPC處理過(guò)的ddH20徹底溶解RNA沉淀。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的飼料型四倍體刺槐葉片總RNA的提取方法，其特征在于所說(shuō)的提取方法包括以下具體步驟(1)稱取0.3g植物葉片直接放入1. 5mL的離心管中，并迅速放入液氮后，研磨成粉末， 加入700 μ 1冰浴緩沖液，60 μ 1 β -巰基乙醇，用旋渦混合器振蕩2-aiiin混勻，在冰上放置 IOmin 后于 4°C，12000g,離心 IOmin0(2)棄去上清，向離心管中加入700μ 1 CTAB提取液，50μ1 β-巰基乙醇，劇烈振蕩 2-3min 混勻。(3)將離心管置于溫度為65°C的水浴7-9min，其間搖動(dòng)幾次。(4)將離心管從水中取出后迅速置于冰上，加入體積比為1 1的水飽和酚與氯仿共 700 μ 1，劇烈振蕩2-3min混勻后于4°C，12000g，離心IOmin0(5)取上清于另一新的離心管中，加入1/2體積的無(wú)水乙醇和1體積的5mol/L醋酸鉀 (pH 5. 8)，緩慢搖動(dòng)混勻，在冰上放置IOmin后于4°C，12000g,離心IOmin0(6)棄去上清，用70%乙醇清洗沉淀，緩慢混勻，4°C，12000g，離心5min。(7)棄去上清，瞬間離心氣干，在通風(fēng)櫥中氣干5min，用DEPC處理過(guò)的ddH20徹底溶解 RNA沉淀。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的從飼料型刺槐葉片中提取總RNA的方法，其特征在于所說(shuō)的冰浴緩沖液是由 100mmol/L 的 Tris-HCl (pH，8. 0)、25mmol/L 的EDTA(pH，8. 0)、2. Omo 1/ L的NaCl組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的從飼料型刺槐葉片中提取總RNA的方法，其特征在于 所說(shuō)的CTAB提取液中加入了皂土。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或4所述的從飼料型刺槐葉片中提取總RNA的法，其特征在于所說(shuō)的 CTAB 提取液是由 2 % 的 CTAB、0. 8 % 的皂土、100mmol/L 的 Tris-HCl (pH，8. 0)、 25mmol/L 的 EDTA (pH，8. 0)、1. 4mol/L 的 NaClU % 的聚乙烯聚吡咯烷酮和 0. 1 % 的 DEPC 組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的從飼料型刺槐葉片中提取總RNA的方法，其特征在于所說(shuō)的75%乙醇是由7. 5份無(wú)水乙醇和2. 5份DEPC處理過(guò)的ddH20配制，DEPC處理過(guò)的ddH20 是由0. 1份DEPC加入99. 9份ddH20中漩渦混勻再經(jīng)高溫高壓滅菌的。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，即一種飼料型四倍體刺槐葉片總RNA的提取方法。特點(diǎn)是將四倍體刺槐葉片裝入離心管磨細(xì)，加入冰浴緩沖液和β-巰基乙醇，離心棄上清，加入CTAB提取液和β-巰基乙醇，離心取上清液，加酚和氯仿，混勻離心取上清液，加入乙醇和醋酸鉀溶液混勻，冰浴靜置棄上清液，乙醇清洗后棄上清液，氣干，用ddH2O溶解RNA沉淀。其有益效果是葉片直接在離心管里研磨以及利用氯仿只抽提一次，減少了操作時(shí)間和材料用量，提取液加入皂土可更好的去除蛋白的干擾，大量的醋酸鉀以去除多糖，從而獲得高純度、高產(chǎn)量且完整穩(wěn)定的RNA，具有操作簡(jiǎn)便、成本低、普通設(shè)備和國(guó)產(chǎn)化學(xué)試劑即可滿足要求等特點(diǎn)，為深入進(jìn)行飼料型刺槐及同類植物的分子生物學(xué)研究提供了條件。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102424821SQ201110434648
公開(kāi)日2012年4月25日 申請(qǐng)日期2011年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月22日
發(fā)明者劉磊, 孟凡娟, 黃鳳蘭 申請(qǐng)人:東北林業(yè)大學(xué)