專利名稱：人miR-183/96/182簇的應(yīng)用及其檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人miR-183/96/182簇的應(yīng)用方法，以及一種腦膠質(zhì)瘤診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
腦膠質(zhì)瘤是起源于腦部神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是最常見(jiàn)的顱內(nèi)腫瘤，約占所有顱內(nèi)腫瘤的45%左右。腦膠質(zhì)瘤系浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，和正常腦組織沒(méi)有明顯界限，難以完全切除，對(duì)放療化療不甚敏感，非常容易復(fù)發(fā)?；瘜W(xué)藥物和一般抗腫瘤的中藥，因血腦屏障等因素的影響， 療效也不理想，迄今為止腦膠質(zhì)瘤仍是全身腫瘤中預(yù)后最差的腫瘤之一，因此腦膠質(zhì)瘤的基礎(chǔ)研究和臨床治療仍然是世界難題。miRNA是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長(zhǎng)約19 25個(gè)核苷酸。其主要通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別靶mRNA，并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。 miRNA與蛋白編碼基因一樣，具有主要的生物學(xué)功能，大多數(shù)miRNA在腫瘤中發(fā)揮主要功能作用，有望成為腫瘤新的判定預(yù)后標(biāo)志物和靶向治療的工具，為人類戰(zhàn)勝腦膠質(zhì)瘤提供新的策略。全基因組水平非編碼DNA序列的研究發(fā)現(xiàn)，有相當(dāng)一部分miRNA基因在染色體上的分布是非隨機(jī)的，它們緊密相鄰，排列成簇。miRNA簇一般有幾個(gè)miRNA組成，miRNA簇的表達(dá)異常參與機(jī)體的生理、病理過(guò)程。miR-106b-25簇中的3個(gè)miRNA成員在頭頸部鱗癌、 結(jié)腸癌、髓母細(xì)胞瘤、食管癌、多發(fā)性骨髓瘤、肝癌等多種腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞株中都高表達(dá)。研究表明，miR-17-92簇的異常高表達(dá)能通過(guò)降低腫瘤抑制蛋白PTEN的水平而促進(jìn)淋巴瘤和白血病生長(zhǎng)和存活，同時(shí)還能夠抑制Rb蛋白促進(jìn)成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)增殖。由此可見(jiàn)，miRNA簇在探尋腫瘤分子標(biāo)志物方面具有巨大潛力，相信在不久的將來(lái)，miRNA簇將會(huì)大大促進(jìn)在腫瘤病人預(yù)后預(yù)測(cè)中的應(yīng)用。研究表明，miRNA簇中的個(gè)體之間可能以協(xié)同方式參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，miR-17-92簇中miR-17、miR_18a、miR_19a、 miR-20a、miR-19b、miR-9^i在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中呈現(xiàn)協(xié)同作用，且與腫瘤的預(yù)后相關(guān)， 同時(shí)miR-17與miR-9h有望成為判定結(jié)腸癌預(yù)后的分子標(biāo)志物。臨床上常采用多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)，應(yīng)用多變量分析的方法來(lái)提高診斷的陽(yáng)性率和特異性。不少證據(jù)表明，同一腫瘤可含有多種腫瘤標(biāo)志物，而不同腫瘤或同種腫瘤的不同組織類型，除有共同的標(biāo)志物外，也可有不同的標(biāo)志物。對(duì)某一特定的腫瘤測(cè)定，可同時(shí)選擇幾種特異性較高的標(biāo)志物， 互相補(bǔ)充，提高診斷的陽(yáng)性率。在大腸癌的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)中，癌胚抗原是最常用于大腸癌的腫瘤標(biāo)志物。尤其常用于對(duì)大腸癌的治療效果及預(yù)后、復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)。但由于癌胚抗原的特異性、靈敏性有限，常需聯(lián)合檢測(cè)CA19-9、CA50等腫瘤標(biāo)志物，以提高診斷準(zhǔn)確性。最近研究表明，miR-182在膠質(zhì)瘤組織表達(dá)顯著升高，其表達(dá)越高，膠質(zhì)瘤患者預(yù)后越差。miR-182 與miR-183、miR-96呈簇排列，聯(lián)合檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織中的miR-183/96/182有望為膠質(zhì)瘤臨床提供更準(zhǔn)確的診斷與預(yù)后判定
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種人miR-183/96/182簇在制備腦膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)測(cè)、檢測(cè)或篩查制劑上的應(yīng)用方法，并提供一種性價(jià)比高、易于推廣應(yīng)用的腦膠質(zhì)瘤診斷試劑盒。人miR-183/96/182簇用于制備腦膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)測(cè)、檢測(cè)或篩查制劑；所述的 miR-183/96/182簇包括miR-183、miR-96和miR-182 ；特別是用于制備腦膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)測(cè)、 檢測(cè)或篩查的試劑盒。人腦膠質(zhì)瘤診斷試劑盒，包括l)Trizol、三氯甲烷、異丙醇；2) DEPC水或無(wú)酶水；3)逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、氯化鎂、三磷酸堿基脫氧核苷酸、RNA酶抑制劑；
4) MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶或AMV酶；5) miR-183、miR-96、miR-182以及內(nèi)參U6SNRNA的特異性逆轉(zhuǎn)錄引物；6)實(shí)時(shí)定量PCR緩沖液、miR-183、miR_96、miR-182以及內(nèi)參U6SNRNA的實(shí)時(shí)定量特異性PCR引物；7) SYBR-Green染料、Taq聚合酶、雙蒸水。miR-183的實(shí)時(shí)定量特異性PCR引物，其正向引物為5 ‘ -CGAACGATATGGCACTGGTAGA 3 ‘，其反向引物為5' -TATGGTTGTTCTCGTCTCCTTCTC-3‘。miR-96的實(shí)時(shí)定量特異性PCR引物，其正向引物為5 ‘ -CGAACTTTGGCACTAGCACATT-3 ‘，其反向引物為5 ‘ -TATGGTTGTTCTCGTCTCCTTCTC-3 ‘。miR-182的實(shí)時(shí)定量特異性PCR引物，其正向引物為5 ‘ -ACTTTTGGCAATGGTAGAACTCAC-3 ‘，其反向引物為5 ‘ -AATCCATGAGAGATCCCTAGCG-3 ‘。TOsnRNA的實(shí)時(shí)定量特異性PCR引物，其正向引物為5 ‘ -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3 ‘其反向引物為5 ‘ -GGAACGCTTCACGAATT TG-3 ‘。miR-183/96/182 簇包括 miR-183 (miRBase 登錄號(hào)MI0000273)、miR-96 (miRBase 登錄號(hào)MI0000098) ,miR-182 (miRBase 登錄號(hào)MI0000272)，位于染色體 7q32. 2，屬于基因間miRNA。申請(qǐng)人首先通過(guò)原位雜交檢測(cè)M例正常大腦組織和66例腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-183/96/182簇中三個(gè)miRNA在腦膠質(zhì)瘤組織中均呈現(xiàn)高表達(dá)(圖1)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，miR-183、miR-96、miR-182在66例腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)陽(yáng)性率分別為84. 85%, 87. 88%,96. 97% ；而miR-183、miR-96、miR-182在24例正常大腦組織中表達(dá)陽(yáng)性率分別為16. 67%、16. 67%,8. 3%0 miR-183/96/182簇中三個(gè)miRNA在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)陽(yáng)性率與正常大腦組織比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是目前檢測(cè)組織miRNA表達(dá)中權(quán)威的檢測(cè)方法之一。為了更好地判定miR-183/96/182簇在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況，申請(qǐng)人運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，miR-183/96/182簇中三個(gè)miRNA 在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)均上調(diào)，與正常大腦組織比，miR-183、miR-96、miR-182分別上調(diào) 3. 34士0. 64,3. 67士0. 71,3. 83士0. 68 倍(圖 2)。隨訪資料顯示，miR-183/96/182簇中miR-183高表達(dá)的33例腦膠質(zhì)瘤病人中
4有20例死亡，而miR-183低表達(dá)的33例腦膠質(zhì)瘤病人中僅有6例死亡；miR-96高表達(dá)的35例腦膠質(zhì)瘤病人中死亡21例，而miR-96低表達(dá)的35例腦膠質(zhì)瘤病人中僅有5例死亡；miR-182高表達(dá)的34例腦膠質(zhì)瘤病人中有22例死亡，而miR-182低表達(dá)32例腦膠質(zhì)瘤病人中僅有4例死亡；經(jīng)Kaplan-Meier統(tǒng)計(jì)學(xué)分析miR-183/96/182簇中單個(gè)miRNA高表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤病人總生存率均低于單個(gè)miRNA低表達(dá)的病人，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 01)(圖3)，同時(shí)在，miR-183/96/182簇中三個(gè)miRNA共同高表達(dá)的23例腦膠質(zhì)瘤病人中有18例死亡，其中兩個(gè)miRNA高表達(dá)9例腦膠質(zhì)瘤病人中有4例死亡，一個(gè)miRNA高表達(dá)的16例腦膠質(zhì)瘤病人中有2例死亡，三個(gè)miRNA全部低表達(dá)的18例miRNA中有2例死亡。經(jīng)Kaplan-Meier統(tǒng)計(jì)學(xué)分析miR-183/96/182簇三個(gè)miRNA共同高表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤病人總生存率顯著低于任意兩個(gè)高表達(dá)或一個(gè)高表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤病人，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 01)。提示miR-183/96/182簇中單個(gè)miRNA在腦膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，是預(yù)測(cè)腦膠質(zhì)瘤預(yù)后的分子標(biāo)志，且聯(lián)合miR-183/96/182簇中三個(gè)miRNA判定預(yù)后更有意義。本發(fā)明為腦膠質(zhì)瘤預(yù)后預(yù)測(cè)提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持和分子生物學(xué)基礎(chǔ)，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和推廣性。


圖1原位雜交檢測(cè)miR-183/96/182簇在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)改變；圖2實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)miR-183/96/182簇在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)改變；圖3miR-183/96/182簇中單個(gè)miRNA與腦膠質(zhì)瘤病人預(yù)后的關(guān)系；圖4聯(lián)合miR-183/96/182簇中三個(gè)miRNA與腦膠質(zhì)瘤病人預(yù)后的關(guān)系。
具體實(shí)施例方式在前期研究工作中，發(fā)明人利用miRNA芯片和SAM軟件分析篩查10例正常腦組織和10例腦膠質(zhì)瘤組織中差異表達(dá)的miRNA時(shí)，發(fā)現(xiàn)miR-182在正常腦組織和腦膠質(zhì)瘤組織中存在明顯差異，并通過(guò)miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www. mirbase. org/)發(fā)現(xiàn)miR-183、 miR-96與miR-182呈簇排列。通過(guò)進(jìn)一步組織研究，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)miR-183/96/182簇中三個(gè)miRNA在腦膠質(zhì)瘤組織中均呈現(xiàn)高表達(dá)(參見(jiàn)圖1, 。miR-183/96/182簇中單個(gè)高表達(dá)的miRNA腦膠質(zhì)瘤病人總生存率均低于單個(gè)miRNA低表達(dá)的病人，同時(shí)miR-183/96/182簇三個(gè)miRNA共同高表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤病人總生存率顯著低于任意兩個(gè)高表達(dá)或一個(gè)高表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤病人(參見(jiàn)圖3，4)。這提示miR-183/96/182簇是預(yù)測(cè)腦膠質(zhì)瘤預(yù)后的分子標(biāo)志。實(shí)施例1腦膠質(zhì)瘤組織診斷試劑盒組成(50次反應(yīng))1.異丙醇 100ml，2.三氯甲烷 100ml，3. Trizol 50ml,4. DEPC水或無(wú)酶水IOml，雙蒸水IOml，5. 5 X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液Iml，6. 25mM 氯化鎂 lml，7. IOmM三磷酸堿基脫氧核苷酸Iml，
8. 5U/ μ 1 RAN 酶抑制劑 500 μ 1,9. 200U/ μ 1 MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 50 μ 1 或 25U/ μ IAMV 酶 50 μ 1，10. 2 X實(shí)時(shí)定量PCR緩沖液^il，11. 5U/μ 1 Taq 聚合酶 50 μ 1，12. 5 μ M miR-183 特異性 PCR 引物 50 μ 1，其正向引物為5 ‘ -CGAACGATATGGCACTGGTAGA 3 ‘，其反向引物為5 ‘ -TATGGTTGTTCTCGTCTCCTTCTC-3 ‘。5 μ M miR-96 特異性 PCR 引物 50 μ 1，其正向引物為 5 ‘ -CGAACTTTGGCACTAGCACATT-3 ‘，其反向引物為5 ‘ -TATGGTTGTTCTCGTCTCCTTCTC-3 ‘。5 μ M miR-182 特異性 PCR 引物 50 μ 1，其正向引物為5 ‘ -ACTTTTGGCAATGGTAGAACTCAC-3 ‘，其反向引物為5 ‘ -AATCCATGAGAGATCCCTAGCG-3 ‘。13. 5 μ M U6snRNA 特異性 PCR 引物 30 μ 1其正向引物為5 ‘ -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3 ‘其反向引物為5 ‘ -GGAACGCTTCACGAATT TG-3 ‘14. 10 μ M miR-182、miR-183、miR-96特異性逆轉(zhuǎn)錄引物各20 μ 1 (購(gòu)于上海吉瑪生物技術(shù)有限公司，QPM010)。15. 10 μ M TOsnRNA特異性逆轉(zhuǎn)錄引物20μ 1(購(gòu)于上海吉瑪生物技術(shù)有限公司， QPMO10)。實(shí)施例2組織樣本中miR-183/96/182簇中三個(gè)miRNA的檢測(cè)1、組織RNA的抽提取組織標(biāo)本與研缽中加入液氮研磨標(biāo)本；于研缽中加入0. 6ml Trizol研缽標(biāo)本，研磨成勻漿后用藥勺加入tube管中；于tube管加入0.細(xì)1 Trizol ；加氯仿200 μ 1/ mlTrizol于Tube中，用手震蕩15_30s，冰上放置5min，4°C 12000g離心15min ；小心取上層水相入新tube中，加入預(yù)冷的異丙醇0. 5ml/mlTrizol混勻，_20°C冰箱靜置20min， 4°C 12000g離心IOmin ；棄上清，加入75% DEPC水稀釋的乙醇l_2ml混勻，4°C 7500g離心 5min,盡量棄上清，室溫干燥5-10min，加入DEPC水10-20 μ 1溶解RNA。分光光度計(jì)測(cè)RNA 的濃度及質(zhì)量，0擬60/280比值在1. 6-1. 8之間并進(jìn)行EB膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，-70°C保存。2、miR-183、miR-96和miR-182特異性逆轉(zhuǎn)錄使用普洛麥格!Iomega公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(A3500)和上海吉瑪生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Hairpin-itTM miR-183, Hairpin-itTM miR-96, Hairpin-itTM miR-182 逆轉(zhuǎn)錄特異性引物 ^jPMOlO)分別對(duì) miR-183、miR-96和miR-182進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。20 μ L逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的體系如下成分劑量/管5χ逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4μ1鎂離子(25mM)3μ1三磷酸堿基脫氧核苷酸(IOmM)0.75μ1MiRNA逆轉(zhuǎn)錄引物(ΙμΜ)1.20μ1RAN酶抑制劑UOU/μΙ)0.25μ1MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(200υ/μ1)0.2μ1RNA 樣本(Ipg總 RNA)Χμ 無(wú)酶水To 20μ1在進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)之前須將除了逆轉(zhuǎn)錄酶外的各種試劑混合成逆轉(zhuǎn)錄混合液，用手指輕彈裝試劑的管子，將逆轉(zhuǎn)錄混合液用移液器吸打幾次，不能用振蕩器。miRNA逆轉(zhuǎn)錄程序16°C 30分鐘，42°C 30分鐘，85°C 10分鐘。3、miR-183、miR-96 和 miR-182 特異性實(shí)時(shí)定量 PCR 先將 miR-183、miR-96 和 miR-182逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別稀釋至2倍，然后混勻。20 μ L反應(yīng)體系如下
成分劑量/管2χ實(shí)時(shí)定量PCR緩沖液10μ1miRNA特異性引物(5μΜ)0.4μ1cDNA產(chǎn)物2μ1Taq 聚合酶(5υ/μ1)0.2μ1雙蒸水To 20μ1miR-183、miR-96和miR-182實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)程序95°C 3分鐘，40個(gè)循環(huán)， 950C 12 #, 620C 35 秒。使用STOR-Green染料進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。miR-183的PCR特異性引物為正向引物5‘ -CGAACGATATGGCACTGGTAGA 3 ‘，反向引物5‘ -TATGGTTGTTCTCGTCTCCTTCTC-3 ‘。miR-96的PCR特異性引物為正向引物5‘ -CGAACTTTGGCACTAGCACATT-3 ‘，反向引物5‘ -TATGGTTGTTCTCGTCTCCTTCTC-3 ‘。miR-182的PCR特異性引物為正向引物5‘ -ACTTTTGGCAATGGTAGAACTCAC-3 ‘反向引物5‘ -AATCCATGAGAGATCCCTAGCG-3 ‘TOSnRNA作為內(nèi)參基因，其PCR引物序列為正向引物5‘ -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3 ‘
反向引物5‘ -GGAACGCTTCACGAATT TG-3 ‘(4) Δ Ct指標(biāo)的測(cè)定Δ Ct指同一樣品中，待檢miRNA與內(nèi)參TOSnRNA平均Ct值的差值。即 miRNA Δ Ct = miRNA MeanCT-control MeanCT，本發(fā)明中，厶(^為111土1 -182與 UBsnRNA的平均Ct值的差值，獲得相對(duì)定量Δ CT值，并進(jìn)行判斷，結(jié)果顯示，在檢測(cè)的66例膠質(zhì)瘤組織中，當(dāng)Δ Ct ^ 8. 52時(shí)，miR-183表達(dá)陽(yáng)性有48例，陽(yáng)性率為72. 73%, miR-96 表達(dá)陽(yáng)性有51例，陽(yáng)性率為77. 27%, miR-182表達(dá)陽(yáng)性有53例，陽(yáng)性率為80. 30%, M miR-183/96/182簇(三個(gè)miRNA有一個(gè)呈陽(yáng)性)表達(dá)陽(yáng)性有64例，陽(yáng)性率為96. 97%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，miR-183/96/182簇與單個(gè)miRNA的陽(yáng)性率比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 01)。實(shí)施例3 miR-183/96/182簇中三個(gè)miRNA與腦膠質(zhì)瘤病人的預(yù)后關(guān)系運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)了 M例正常大腦組織和66例膠質(zhì)瘤組織中的 miR-183/96/182簇中單個(gè)miRNA表達(dá)情況，然后對(duì)每一例檢測(cè)的膠質(zhì)瘤病人進(jìn)行預(yù)后隨訪，結(jié)果顯示miR-183/96/182簇中單個(gè)miRNA高表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤病人總生存率均低于單個(gè)miRNA低表達(dá)的病人，同時(shí)miR-183/96/182簇三個(gè)miRNA共同高表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤病人總生存率顯著低于任意兩個(gè)高表達(dá)或一個(gè)高表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤病人(參見(jiàn)圖3，4)。這提示 miR-183/96/182簇是預(yù)測(cè)腦膠質(zhì)瘤預(yù)后的分子標(biāo)志。以上研究表明，檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤組織中miR-183/96/182簇的表達(dá)，具有很好的穩(wěn)定性，當(dāng)ACt彡8. 52時(shí)，提示是腦膠質(zhì)瘤的可能性為96. 97%，miR-183/96/182簇可以作為腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后預(yù)測(cè)的特異性分子標(biāo)志物，miR-183/96/182簇與膠質(zhì)瘤預(yù)后顯著相關(guān)， 可以用于腦膠質(zhì)瘤病人預(yù)后預(yù)測(cè)。
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權(quán)利要求
1.人miR-183/96/182簇的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的人miR-183/96/182簇用于制備腦膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)測(cè)、檢測(cè)或篩查制劑；所述的miR-183/96/182簇包括miR-183、miR-96 和 miR-182。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的人miR-183/96/182簇用于制備腦膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)測(cè)、檢測(cè)或篩查的試劑盒。
3.一種人腦膠質(zhì)瘤診斷試劑盒，其特征在于，包括1)Trizol、三氯甲烷、異丙醇；2)DEPC水或無(wú)酶水；3)逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、氯化鎂、三磷酸堿基脫氧核苷酸、RNA酶抑制劑；4)MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶或AMV酶；5)miR-183、miR-96、miR-182以及內(nèi)參U6SNRNA的特異性逆轉(zhuǎn)錄引物；6)實(shí)時(shí)定量PCR緩沖液、miR-183、miR-96、miR-182以及內(nèi)參U6SNRNA的實(shí)時(shí)定量特異性PCR引物；7)SYBR-Green染料、Taq聚合酶、雙蒸水。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于， miR-183的實(shí)時(shí)定量特異性PCR引物，其正向引物為 5 ‘ -CGAACGATATGGCACTGGTAGA 3 ‘，其反向引物為 5 ‘ -TATGGTTGTTCTCGTCTCCTTCTC-3 ‘。miR-96的實(shí)時(shí)定量特異性PCR引物，其正向引物為 5 ‘ -CGAACTTTGGCACTAGCACATT-3 ‘，其反向引物為 5 ‘ -TATGGTTGTTCTCGTCTCCTTCTC-3 ‘。miR-182的實(shí)時(shí)定量特異性PCR引物，其正向引物為 5 ‘ -ACTTTTGGCAATGGTAGAACTCAC-3 ‘，其反向引物為 5 ‘ -AATCCATGAGAGATCCCTAGCG-3 ‘。TOsnRNA的實(shí)時(shí)定量特異性PCR引物，其正向引物為 5 ‘ -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3 ‘其反向引物為 5 ‘ -GGAACGCTTCACGAATT TG-3'。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種人miR-183/96/182簇的應(yīng)用方法及其檢測(cè)試劑盒，其用于制備腦膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)測(cè)、檢測(cè)或篩查制劑；特別是提供了一種用于制備腦膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)測(cè)、檢測(cè)或篩查的試劑盒。該試劑盒通過(guò)相對(duì)定量的檢測(cè)疑似腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中miR-183/96/182簇中三個(gè)miRNA的表達(dá)狀況，用于腦膠質(zhì)瘤病人預(yù)后預(yù)測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102424843SQ20111043460
公開(kāi)日2012年4月25日 申請(qǐng)日期2011年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月22日
發(fā)明者劉曉萍, 唐海林, 徐剛, 李桂源, 武明花, 王澤友, 鄧敏 申請(qǐng)人:中南大學(xué)