專利名稱：一種ldr技術(shù)的egfr突變檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及PCR技術(shù)和高溫連接酶(LDR)技術(shù)檢測(cè)試劑盒，特別涉及到特異性引物的多種PCR和多重LDR技術(shù)檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factorreceptor, EGFR)常規(guī)突變檢測(cè)的試劑盒。
背景技術(shù)：
肺癌是當(dāng)今世界上最常見的惡性腫瘤，男性肺癌占惡性腫瘤發(fā)病率的首位，女性肺癌僅次于乳腺癌據(jù)第二位。全球每年大約有1180000人死于肺癌。而在我國，肺癌的發(fā)病率也逐年上升,其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung caner,NSCLC)占肺癌的80%,確診時(shí)多為晚期。雖然手術(shù)、化療、放療技術(shù)在不斷提高，但NSCLC患者的預(yù)后仍然很差，總體5年生存率仍然小于20%。近年來一些針對(duì)腫瘤特定分子靶點(diǎn)的抗腫瘤靶向藥物顯示了一些療效，其中以表皮 生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)為革巴點(diǎn)的 EGFR 酪氨酸激酶抑制劑(EGFR tyrosine kinasesin-hibitor, EGFR-TKI)吉非替尼(Gefitinib)在NSCLC的治療中顯示了一定的療效。吉非替尼是一種低分子量的苯胺喹鈉唑啉化合物，IDEALl和IDEAL2的II期試驗(yàn)結(jié)果顯示其治療晚期NSCLC有效，且副反應(yīng)易于耐受。臨床回顧性研究顯示吉非替尼對(duì)不吸煙者、亞裔、女性、支氣管肺泡癌或腺癌伴支氣管肺泡癌分化患者有效。近年來研究發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變等分子生物學(xué)因素與吉非替尼的療效相關(guān)。綜合文獻(xiàn)中大量數(shù)據(jù)顯示，Gefitinib在攜帶EGFR基因突變的NSCLC中的有效率是76.7%，有的文獻(xiàn)提到的有效率甚至達(dá)到90%以上，而在野生型EGFR患者中只有
12.2%。因此EGFR突變是靶向藥物治療的一個(gè)必要前提條件。肺癌EGFR基因突變主要發(fā)生在外顯子18-21區(qū)，最常見的突變包括19區(qū)缺失突變，20區(qū)片段插入和21區(qū)點(diǎn)突變，這三類突變占EGFR突變90%以上。外顯子19區(qū)的堿基缺失主要是在第746-752位密碼子的缺失突變，導(dǎo)致EGFR蛋白中氨基酸序列丟失，從而改變了細(xì)胞對(duì)TKLs的敏感性；20外顯子堿基替換突變是引起耐藥的主要原因；外顯子21區(qū)的點(diǎn)突變主要是第858位密碼子出現(xiàn)T-G轉(zhuǎn)換，使該位點(diǎn)的亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼?，?jiǎn)稱為L(zhǎng)858R。EGFR基因突變的檢測(cè)方法通常是直接測(cè)序，但該方法步驟繁瑣，試驗(yàn)周期長(zhǎng)，對(duì)操作人員技術(shù)水平要求高，因此難以在臨床大面積推廣。更為重要的是測(cè)序技術(shù)本身靈敏度不高，只能檢測(cè)15%以上的突變。而腫瘤組織是一個(gè)異質(zhì)性的組織，EGFR突變又是一種雜合性突變，即EGFR基因DNA雙鏈中有一條發(fā)生突變，而這種突變?cè)跈z測(cè)樣本中的比例小于15%，測(cè)序方法根本就無法檢出。高溫連接酶(LDR)技術(shù)是利用高溫連接酶實(shí)現(xiàn)對(duì)基因多態(tài)性位點(diǎn)的識(shí)別。高溫連接酶一旦檢測(cè)到DNA與互補(bǔ)的兩條寡聚核苷酸接頭對(duì)應(yīng)處存在著基因點(diǎn)突變類型的堿基錯(cuò)配，則連接反應(yīng)就不能進(jìn)行。我們基于測(cè)序分型技術(shù)的LDR試劑盒是針對(duì)臨床應(yīng)用設(shè)計(jì)，填補(bǔ)了國內(nèi)外基因分型及DNA多態(tài)性檢測(cè)在臨床分子診測(cè)應(yīng)用上的空白。與傳統(tǒng)的直接測(cè)序法相比，LDR測(cè)序分型試劑盒有如下顯著優(yōu)勢(shì):
I)降低成本:測(cè)序反應(yīng)的所有相關(guān)試劑完全由ABI或Beckman這樣的大型國外企業(yè)掌握，試劑成本非常昂貴，而LDR技術(shù)則由于操作簡(jiǎn)單，試劑要求也非常簡(jiǎn)單，可大幅度降低成本。2)簡(jiǎn)化操作:直接測(cè)序法一般要經(jīng)過PCR反應(yīng)條件優(yōu)化、PCR產(chǎn)物純化、測(cè)序引物設(shè)計(jì)、測(cè)序反應(yīng)化學(xué)類型選擇等步驟，單是PCR產(chǎn)物純化就是一個(gè)操作難點(diǎn)，而應(yīng)用LDR測(cè)序分型試劑盒可以免去純化這一繁瑣的步驟，使得檢測(cè)操作變得簡(jiǎn)單方便，同時(shí)也提高了檢測(cè)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性；方便了臨床的開展3)提高數(shù)據(jù)量:DNA序列的測(cè)定只是針對(duì)某一區(qū)段進(jìn)行的，而這一選定區(qū)段內(nèi)醫(yī)生和患者關(guān)心的一般只是其中的一個(gè)位點(diǎn)，而基于LDR技術(shù)的檢測(cè)系統(tǒng)可以同時(shí)進(jìn)行多位點(diǎn)的SNP分型，這一高通量的特點(diǎn)不僅提高了臨床檢測(cè)的效率，也是很大程度上為病人節(jié)省了本需要多次檢測(cè)的相應(yīng)費(fèi)用。4)操作簡(jiǎn)單流程短:從DNA制備開始，僅需要5.5個(gè)小時(shí)，而測(cè)序往往要超過8個(gè)小時(shí)。其中DNA制備0.5小時(shí)，PCR需2 3小時(shí)，LDR需0.5 I小時(shí)，測(cè)序時(shí)間需I小時(shí)，方便臨床的開展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于多重PCR和LDR技術(shù)的EGFR突變檢測(cè)試劑盒，可用于臨床EGFR常見突變檢測(cè)。本發(fā)明的技術(shù)路線為:I，針對(duì)EGFR基因19外顯子，20外顯子和21外顯子突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)能夠與野生型和突變型模板上游或下游互補(bǔ)的寡基核 苷酸引物，以及分別與19外顯子，20外顯子和21外顯子突變位點(diǎn)結(jié)合的寡基核苷酸探針。2，配制適宜于PCR和LDR的反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)體系包括Taq酶，UNG酶和Dntp，PCR緩沖液，引物等；LDR反應(yīng)體系包括連接酶，UNG酶，dNTP，探針和緩沖溶液等。3，從待測(cè)樣本中提取DNA，加到PCR反應(yīng)體系中，進(jìn)行多重PCR反應(yīng).
4，從上述PCR產(chǎn)物中加一定量到LDR反應(yīng)體系中，進(jìn)行多重LDR反應(yīng)。5，將得到的LDR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，根據(jù)測(cè)序圖譜判斷樣本是否存在突變，以及是哪種突變。本發(fā)明提供的EGFR突變檢測(cè)試劑盒包括以下組分:PCR緩沖液，酶1，酶2，LDR反應(yīng)液，陰性質(zhì)控品，野生型質(zhì)控品，19外顯子質(zhì)控品，20外顯子質(zhì)控品，21外顯子L858R質(zhì)控品，21外顯子L861Q質(zhì)控品。其中酶I包括Taq酶，UNG酶和dNTP ;酶2包括連接酶，UNG酶，dNTP等。本發(fā)明EGFR突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于19外顯子，20外顯子和21外顯子的引物序列分別是:19 外顯子上游引物:HEX-CCCCAGCAATATCAGCCTTA19 外顯子下游引物:CCACACAGCAAAGCAGAAAC20 外顯子上游引物:FAM-CATTCATGCGTCTTCACCTG20 外顯子下游引物:TTATCTCCCCTCCCCGTATC21 外顯子上游引物:CCTCACAGCAGGGTCTTCTC21 外顯子下游引物:CCTGGTGTCAGGAAAATGCT。
本發(fā)明EGFR突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于LDR反應(yīng)液中包含21外顯子L858R的探針序列為:L858R_modify P-GCCCAAAATCTGTGATCTTGACATGTTTTTTTTTTT-FAML858R_T TTTTTTTTTTTTCTTCCGCACCCAGCAGTTTGGCCAL858R_G TTTTTTTTTTTTTTTTTCTTCCGCACCCAGCAGTTTGGCCC。本發(fā)明EGFR突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于其特征在于LDR反應(yīng)液中包含21外顯子L861Q的探針序列為:L861Q_modify P-GTTTGGCCAGCCCAAAATCTGTGATTTTTTTTTTTTTTTTT-FAML861Q_T TTTTTTTTTTTTTTTTTATTCTTTCTCTTCCGCACCCAGCAL861Q_A TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATTCTTTCTCTTCCGCACCCAGCT。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，陰性質(zhì)控品是生理鹽水；野生型質(zhì)控品，19外顯子質(zhì)控品，20外顯子質(zhì)控品，21外顯子L858R質(zhì)控品和21外顯子L861Q質(zhì)控品分別為測(cè)序結(jié)果檢測(cè)分別為野生和突變的質(zhì)粒DNA。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，其中試劑盒的待檢樣品為多種途徑獲取的帶有相關(guān)腫瘤DNA的臨床樣品，包括手術(shù)切除組織，石蠟包埋組織切片，穿刺組織，胸水，全血、血漿和血清
坐寸ο 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，19外顯子突變是指EGFR絡(luò)氨酸激酶區(qū)19外顯子出現(xiàn)缺失突變；20外顯子突變是指EGFR絡(luò)氨酸激酶區(qū)20外顯子的基因替換突變；21外顯子突變是指EGFR絡(luò)氨酸激酶區(qū)21外顯子的L858R和L861Q突變。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，試劑盒用于判定檢測(cè)有效性的標(biāo)準(zhǔn)是:每次都檢測(cè)陰性質(zhì)控品，野生型質(zhì)控品和突變型質(zhì)控品，檢測(cè)結(jié)果陰性質(zhì)控品和野生型質(zhì)控品均為陰性且突變型質(zhì)控品為陽性時(shí)，實(shí)驗(yàn)才有效。本發(fā)明所述的EGFR突變檢測(cè)試劑盒，目前針對(duì)臨床EGFR突變檢測(cè)方案主要有兩種:Taqman探針法和Sanger測(cè)序法。Taqman探針法操作簡(jiǎn)單快速,實(shí)驗(yàn)靈敏度高，但無法同時(shí)檢測(cè)多個(gè)突變位點(diǎn)。Sanger測(cè)序法操作繁瑣，檢測(cè)需10小時(shí)以上，檢測(cè)靈敏度低，無法檢測(cè)低滴度樣本(突變比率小于15% )。基于PCR-LDR的EGFR突變位點(diǎn)檢測(cè)方案能夠突破傳統(tǒng)核酸突變檢測(cè)技術(shù)的局限:對(duì)多個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)；檢測(cè)靈敏度達(dá)到1% ;操作方便，基本實(shí)現(xiàn)操作自動(dòng)化，產(chǎn)品的檢測(cè)時(shí)間縮短為4個(gè)小時(shí)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:EGFR突變檢測(cè)試劑盒及其使用。I試劑盒組成:PCR緩沖液，酶1，酶2，LDR反應(yīng)液，陰性質(zhì)控品，野生型質(zhì)控品，19外顯子質(zhì)控品，20外顯子質(zhì)控品，21外顯子L858R質(zhì)控品，21外顯子L861Q質(zhì)控品和分隔并集中包裝這些管的試劑盒子。，2核酸提取:取10到30毫克新鮮組織或200微升抗凝血，使用Qiagen或其它公司的DNA提取試劑盒，參照試劑盒說明書提取樣本DNA。3多重PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增管中，加入18ul PCR緩沖液、Iul酶I和Iul樣本DNA，擴(kuò)增條件為:95°C 15min，35 個(gè)循環(huán)包括 94°C 30 秒；59°C Imin ；72°C 30 秒，最后 72 °C 5min。4多重LDR2反應(yīng)。反應(yīng)管中，加入8ul LDR緩沖液、Iul酶2和Iul上述PCR產(chǎn)物，反應(yīng)條件為:94°C 2min, 15個(gè)循環(huán)包括94°C 30秒；60°C 2min。5測(cè)序儀結(jié)果檢測(cè)，將得到的LDR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果用GeneMappeM.0軟件進(jìn)行分析。6結(jié)果判定:檢測(cè)陰性質(zhì)控品和野生型質(zhì)控品均為陰性且突變型質(zhì)控品為陽性時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。根據(jù)設(shè)計(jì)的探針長(zhǎng)度判斷結(jié)果是屬于那種突變，野生型和突變型探針長(zhǎng)度在軟件分析前設(shè)置，從結(jié)果顯示的峰圖位置判定樣本是屬于野生型、單一突變型或復(fù)合突變型。L858R和L861Q野生型參見附

圖1A，L858R突變L861Q野生型參見附圖1B。實(shí)施例1:臨床樣本檢測(cè) 根據(jù)上述實(shí)施方式，取非小細(xì)胞肺癌患者全血樣本300例檢測(cè)EGFR基因，結(jié)果如下:19外顯子突變21例；20外顯子突變35例；21外顯子L858R突變78例；21外顯子L861Q變異59例。本發(fā)明檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，樣本通量大，靈敏度更高，非常適合臨床大規(guī)模應(yīng)用。在腫瘤個(gè)體化診斷日益被關(guān)注的今天，本發(fā)明可對(duì)EGFR基因特定突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，可以用于分子靶向抗腫瘤藥物療效的預(yù)測(cè)和腫瘤患者臨床個(gè)體化用藥方案的指導(dǎo)。
權(quán)利要求
1.一種采用特異性引物探針的高溫連接酶技術(shù)(LDR技術(shù))檢測(cè)EGFR基因突變的試劑盒，該試劑盒包括=PCR緩沖液，酶1，酶2，LDR反應(yīng)液，陰性質(zhì)控品，野生型質(zhì)控品，19外顯子質(zhì)控品，20外顯子質(zhì)控品，21外顯子L858R質(zhì)控品，21外顯子L861Q質(zhì)控品和分隔并集中包裝這些管的試劑盒子。其中19外顯子，20外顯子和21外顯子的引物序列分別是: 19 外顯子上游引物:HEX-CCCCAGCAATATCAGCCTTA 19外顯子下游引物:CCACACAGCAAAGCAGAAAC 20外顯子上游引物:FAM-CATTCATGCGTCTTCACCTG 20外顯子下游引物:TTATCTCCCCTCCCCGTATC 21外顯子上游引物:CCTCACAGCAGGGTCTTCTC 21 外顯子下游引物:CCTGGTGTCAGGAAAATGCT。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的EGFR突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于LDR反應(yīng)液中包含21外顯子L858R的探針序列為:L858R_modify P-GCCCAAAATCTGTGATCTTGACATGTTTTTTTTTTT-FAML858R_T TTTTTTTTTTTTCTTCCGCACCCAGCAGTTTGGCCAL858R_G TTTTTTTTTTTTTTTTTCTTCCGCACCCAGCAGTTTGGCCC。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的EGFR突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于LDR反應(yīng)液中包含21外顯子L861Q的探針序列為: L861Q_modify P-GTTTGGCCAGCCCAAAATCTGTGATTTTTTTTTTTTTTTTT-FAML86IQ_T TTTTTTTTTTTTTTTTTATTCTTTCTCTTCCGCACCCAGCAL861Q_A TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATTCTTTCTCTTCCGCACCCAGCT。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的EGFR突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于酶I中還包括Taq酶，UNG酶和 dNTP。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的EGFR突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于酶2中還包括連接酶，UNG酶和 dNTP。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的EGFR突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于陰性質(zhì)控品是生理鹽水；野生型質(zhì)控品，19外顯子質(zhì)控品，20外顯子質(zhì)控品，21外顯子L858R質(zhì)控品和21外顯子L861Q質(zhì)控品分別為測(cè)序結(jié)果檢測(cè)分別為野生和突變的質(zhì)粒DNA。
全文摘要
本發(fā)明提供一種特異性PCR技術(shù)和LDR技術(shù)檢測(cè)EGFR基因突變的試劑盒，特別涉及腫瘤患者組織以及患者血液中EGFR基因突變的診斷。本試劑盒針對(duì)分子靶向抗癌藥物療效相關(guān)的特定突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特定的引物序列和探針序列，在進(jìn)行多重PCR后，通過野生型探針和突變型探針與目的片段連接后在測(cè)序儀上進(jìn)行片段分析，根據(jù)結(jié)果的峰圖判讀結(jié)果。本發(fā)明可對(duì)EGFR基因特定突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，可以用于分子靶向抗腫瘤藥物療效的預(yù)測(cè)和腫瘤患者臨床個(gè)體化用藥方案的指導(dǎo)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103184274SQ20111044862
公開日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者江培學(xué), 楊志軍, 王微, 詹偉, 陳偉華, 吳大治, 夏懿 申請(qǐng)人:上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司, 上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司