肝豆?fàn)詈俗冃詀tp7b多位點(diǎn)突變檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種肝豆?fàn)詈俗冃訟TP7B多位點(diǎn)突變檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括分別針對(duì)ATP7B的三個(gè)突變位點(diǎn)p.R778L,p.P992L和p.V1106I進(jìn)行非標(biāo)記探針HRM檢測(cè)用的引物對(duì)及探針，以及標(biāo)準(zhǔn)品。本發(fā)明所述試劑盒操作簡(jiǎn)單，可快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)待測(cè)血液樣品中ATP7B基因中p.R778L,p.P992L和p.V1106I三個(gè)位點(diǎn)的突變情況。
【專利說(shuō)明】
肝豆?fàn)詈俗冃訟TP7B多位點(diǎn)突變檢測(cè)試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)肝豆?fàn)詈俗冃?Wilson病)ATP7B熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的新方法，即 應(yīng)用非標(biāo)記探針高分辨溶解曲線(HRM)技術(shù)檢測(cè)ATP7B多位點(diǎn)突變，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)檢測(cè)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] Wilson病(WD)是一種單基因常染色體隱性遺傳性銅代謝障礙疾病，世界范圍發(fā)病 率約為1/10,000-30,000，其中中國(guó)是高發(fā)區(qū)。該病是由于41?78基因突變導(dǎo)致銅轉(zhuǎn)運(yùn)？型 ATP酶缺失，從而引起血漿銅藍(lán)蛋白降低及銅在體內(nèi)器官的沉積等一系列臨床表現(xiàn)。WD是目 前少數(shù)可治療的遺傳性疾病，患者如果能在發(fā)病早期或癥狀前期即被確診并得到及時(shí)治 療，大多預(yù)后良好，反之病情逐漸加重甚至危及生命。因此，早期診斷及時(shí)治療是改善本病 預(yù)后的關(guān)鍵。由于本病的遺傳特性，早期進(jìn)行基因診斷對(duì)于該病的及早治療起著決定性的 作用。
[0003] 目前，國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的檢測(cè)WD突變的方法有:直接測(cè)序法，聚合酶鏈反應(yīng)限制性片 段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(PCR-SSCP)，聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(PCR-RFLP)，高 效液相色譜(DHPLC)技術(shù)等，這些技術(shù)有的操作步驟繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，靈敏度低，有的易于 造成交叉污染，出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。HRM技術(shù)是今年來(lái)興起的一種檢測(cè)基因突變、進(jìn)行基因分 型和SNP檢測(cè)的新工具，可迅速檢測(cè)出核酸片段中的單堿基的突變。目前已有將HRM方法應(yīng) 用于肝豆?fàn)詈俗冃訟TP7B部分突變位點(diǎn)檢測(cè)的報(bào)道，但分辨率和重復(fù)性還有待進(jìn)一步探討， 因此，還難以應(yīng)用于臨床檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種肝豆?fàn)詈俗冃訟TP7B多位點(diǎn)突變檢測(cè)試劑盒。該試劑盒 操作簡(jiǎn)便，分辨率且重復(fù)性好，可以快速檢測(cè)肝豆?fàn)詈俗冃訟TP7B多位點(diǎn)突變。
[0005] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該檢測(cè)試劑盒的使用方法。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了一種肝豆?fàn)詈俗冃訟TP7B多位點(diǎn)突變檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括分 別針對(duì)ATP7B的三個(gè)突變位點(diǎn)p. R778L，p. P992L和p. VI1061進(jìn)行非標(biāo)記探針HRM檢測(cè)用的引 物對(duì)及探針，以及標(biāo)準(zhǔn)品。其中P. R778L位于ATP7B基因外顯子8上，是中國(guó)人群突變頻率最 多的位點(diǎn)，在Wilson患者中高達(dá)25%左右，其次外顯子13上的P.P992L突變頻率占15%，也 是熱點(diǎn)突變位點(diǎn)之一。根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)室對(duì)中國(guó)人群Wi 1 son患者ATP7B基因基因突變譜的最 新研究顯示，除了上述兩個(gè)已知的熱點(diǎn)突變位點(diǎn)，外顯子15上的P.V1106I的突變頻率高達(dá) 7.5 % (以前有報(bào)道，非熱點(diǎn)突變），可能是一個(gè)新的熱點(diǎn)突變位點(diǎn)（數(shù)據(jù)未發(fā)表），因此 p. R778L，p. P992L和p. VI1061三個(gè)位點(diǎn)的聯(lián)合檢測(cè)可覆蓋近50 %的患者。所述引物對(duì)及探 針序列具體如表1所示：
[0008] 表1引物及探針序列
[0010] 上表中所示的探針序列的3'端為氨基修飾(AmMo)。
[0011] 所述標(biāo)準(zhǔn)品為分別包含上述三個(gè)突變位點(diǎn)的野生型基因序列的質(zhì)粒載體和分別 包含上述三個(gè)突變位點(diǎn)的突變型基因序列的質(zhì)粒載體。其中，三個(gè)突變位點(diǎn)的野生型基因 序列分別為序列表中所示的SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:11和SEQ ID N0:12;所述三個(gè)突變 位點(diǎn)的突變型基因序列分別為序列表中所示的36〇10勵(lì)：13、3￡〇10勵(lì) ：14和3￡〇10勵(lì)： 15。上述三個(gè)突變位點(diǎn)的野生型基因序列和突變型基因序列可以采用全基因合成方法獲 得，然后分別連接到質(zhì)粒載體上，本發(fā)明對(duì)質(zhì)粒載體不做限定，例如本領(lǐng)域常用的T載體。 [00 12]進(jìn)一步地，本發(fā)明所述檢測(cè)試劑盒還包括完成HRM檢測(cè)所需的試劑和酶，例如使用 商業(yè)化購(gòu)買的試劑2XHRM master mix、25mM MgCl2和ddH2〇,均購(gòu)自Roche公司。
[0013]本發(fā)明還提供了一種肝豆?fàn)詈俗冃訟TP7B多位點(diǎn)突變檢測(cè)試劑盒的使用方法，該 方法包括如下步驟：
[0014] (1)提取血液總DNA，可以使用DNA提取試劑盒(購(gòu)自Qiagen公司），也可以使用現(xiàn)有 技術(shù)中已知的提取DNA的方法進(jìn)行提?。?br>[0015] (2)進(jìn)行HRM反應(yīng)，其反應(yīng)體系如表2所示；
[0016]表2反應(yīng)體系
[0018] 反應(yīng)條件：95°C15min 然后 95°Cfor 1586(3,6〇1€2〇86(3,721€3〇86(3，共65個(gè)循環(huán)，并 且以4.8°C/s的升溫速度升高到95°C，以2.5°C/s的降溫速度降低到46°C，以4.8°C/s的升溫 速度升高到72 °C ;然后72 °C lmin;然后以4.8 °C /s的升溫速度升溫到95 °C，然后以2.5 °C/s的 降溫速度降低到55°C。溶解曲線通過(guò)在以4.8°C/s的升溫速度從55°C升高到95°C的過(guò)程中， 每攝氏度獲取25次熒光信號(hào)獲得。
[0019] (3)結(jié)果判定，對(duì)于不同位點(diǎn)的野生型和突變型以及雜合型，有不同的探針溶解曲 線Tm值，見(jiàn)表3。
[0020] 表3不同基因型的探針Tm值
[0023] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明針對(duì)多個(gè)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物及非標(biāo)記探針， p.R778L，p.P992L和P.V1106I三個(gè)位點(diǎn)的聯(lián)合檢測(cè)可覆蓋近50%的患者。此外，非標(biāo)記探針 由于減少了結(jié)合的堿基數(shù)目，因此，放大了野生型和突變型的Tm值差異（ATm值為4°C以 上），從而彌補(bǔ)了單純HRM方法分辨率和重復(fù)性不佳的缺點(diǎn)，而同時(shí)兼?zhèn)淞藗鹘y(tǒng)HRM方法速度 快、操作簡(jiǎn)便，且對(duì)樣品無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，使得本方法在應(yīng)用于臨床檢測(cè)方面更具優(yōu)勢(shì)。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1為用于檢測(cè)ATP7B 778位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)品的非標(biāo)記探針HRM結(jié)果圖。
[0025] 圖2為用于檢測(cè)ATP7B 992位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)品的非標(biāo)記探針HRM結(jié)果圖。
[0026] 圖3為用于檢測(cè)ATP7B 1106位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)品的非標(biāo)記探針HRM結(jié)果圖。
[0027]圖4為檢測(cè)臨床樣本ATP7B 778位點(diǎn)的非標(biāo)記探針HRM結(jié)果圖。
[0028]圖5為檢測(cè)臨床樣本ATP7B 992位點(diǎn)的非標(biāo)記探針HRM結(jié)果圖。
[0029]圖6為檢測(cè)臨床樣本ATP7B 1106位點(diǎn)的非標(biāo)記探針HRM結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。
[0031] 實(shí)施例1檢測(cè)ATP7B基因p. R778L，p. P992L和p. VI1061三個(gè)突變位點(diǎn)的引物和非標(biāo) 記探針的設(shè)計(jì)
[0032] 從GenBank獲得ATP7B基因的序列，利用NCBI引物在線設(shè)計(jì)軟件Primer-BLAST設(shè)計(jì) 特異性擴(kuò)增引物。所述引物擴(kuò)增的產(chǎn)物必須包含各個(gè)擬檢測(cè)的突變位點(diǎn)，并且突變位點(diǎn)應(yīng) 稍靠近擴(kuò)增產(chǎn)物的5'端。探針為涵蓋擬檢測(cè)突變位點(diǎn)堿基的30個(gè)左右核苷酸的核酸序列， 所述核酸序列的GC含量應(yīng)盡量低于45%，并將序列的3'端進(jìn)行氨基修飾，以避免延伸。按此 原則，通過(guò)篩選、檢驗(yàn)最終確定了可以有效檢測(cè)ATP7B的p. R778L，p. P992L和p. VI1061三個(gè) 突變位點(diǎn)的三組引物對(duì)和非標(biāo)記探針，其序列如表1所示。所有引物和探針由梓熙生物技術(shù) 公司合成。
[0033] 實(shí)施例2檢測(cè)ATP7B基因p. R778L，p. P992L和p. VI1061三個(gè)突變位點(diǎn)的的非標(biāo)記探 針HRM檢測(cè)試劑盒的組成
[0034] 檢測(cè)試劑盒包括實(shí)施例1設(shè)計(jì)的分別針對(duì)ATP7B的三個(gè)突變位點(diǎn)p.R778L，p.P992L 和P.V1106I進(jìn)行非標(biāo)記探針HRM檢測(cè)用的引物對(duì)及探針，以及標(biāo)準(zhǔn)品。具體地，引物和探針 如表1所示。所述標(biāo)準(zhǔn)品為分別包含上述三個(gè)突變位點(diǎn)的野生型基因序列的質(zhì)粒載體和分 別包含上述三個(gè)突變位點(diǎn)的突變型基因序列的質(zhì)粒載體。其中，三個(gè)突變位點(diǎn)的野生型基 因序列分別為序列表中所示的3￡〇10勵(lì) ：10、3￡〇10勵(lì)：11、3￡〇10勵(lì)：12;所述三個(gè)突變 位點(diǎn)的突變型基因序列分別為序列表中所示的SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0: 15。上述引物和探針?lè)盅b，標(biāo)準(zhǔn)品也分裝。
[0035] 所述檢測(cè)試劑盒還包括還包括完成HRM反應(yīng)所需的試劑和酶，例如使用商業(yè)化購(gòu) 買的試劑2XHRM master mix、25mM MgCl2和ddH2〇,均購(gòu)自Roche公司。
[0036] 實(shí)施例3非標(biāo)記探針HRM檢測(cè)ATP7B基因p. R778L，p. P992L和p. VI1061三個(gè)突變位 點(diǎn)的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)
[0037]具體過(guò)程包括以下步驟：
[0038] 一、實(shí)驗(yàn)樣品
[0039] 構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)品 [0040] 二、重復(fù)性檢測(cè)試驗(yàn)
[0041 ] 1.組內(nèi)重復(fù)性
[0042]按照前述實(shí)驗(yàn)體系和實(shí)驗(yàn)步驟，在一次實(shí)驗(yàn)中重復(fù)進(jìn)行三次檢測(cè)，不同基因型的 Tm值和ATm值見(jiàn)下表。
[0043] 2.組間重復(fù)性
[0044]按照前述實(shí)驗(yàn)體系和實(shí)驗(yàn)步驟，連續(xù)進(jìn)行五次檢測(cè)，不同基因型的Tm值和ATm值 見(jiàn)表4。
[0045] 表4非標(biāo)記探針HRM檢測(cè)的重復(fù)性
[0048]實(shí)施例4臨床樣本檢測(cè)
[0049] 按照前述實(shí)驗(yàn)體系和實(shí)驗(yàn)步驟，進(jìn)行了臨床樣本的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，并與金標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序 結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)下表5:
[0050] 表 5
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種肝豆?fàn)詈俗冃訟TP7B多位點(diǎn)突變檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括分別 針對(duì)ATP7B的三個(gè)突變位點(diǎn)p. R778L，p. P992L和p. VI1061進(jìn)行非標(biāo)記探針HRM檢測(cè)用的引物 對(duì)及探針，以及標(biāo)準(zhǔn)品；其中，序列表中序列SEQ ID ΝΟ:1至SEQ ID NO:2所示的引物對(duì)和序 列SEQ ID NO:3所示的探針用于檢測(cè)突變位點(diǎn)P.R778L;序列SEQ ID N0:4至SEQ ID NO:5所 示的引物對(duì)和序列SEQ ID NO:6所示的探針用于檢測(cè)突變位點(diǎn)P.P992L;序列SEQ ID NO:7 至SEQ ID NO:8所示的引物對(duì)和序列SEQ ID NO:9所示的探針用于檢測(cè)突變位點(diǎn)p.VI1061。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝豆?fàn)詈俗冃訟TP7B多位點(diǎn)突變檢測(cè)試劑盒，其特征在 于，所述探針的3 '端為氨基修飾。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝豆?fàn)詈俗冃訟TP7B多位點(diǎn)突變檢測(cè)試劑盒，其特征在 于，所述標(biāo)準(zhǔn)品為分別包含三個(gè)突變位點(diǎn)P. R778L，p. P992L和p. VI1061的野生型基因序列 的質(zhì)粒載體和分別包含所述三個(gè)突變位點(diǎn)的突變型基因序列的質(zhì)粒載體。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種肝豆?fàn)詈俗冃訟TP7B多位點(diǎn)突變檢測(cè)試劑盒，其特征在 于，所述三個(gè)突變位點(diǎn)P.R778L，p.P992L和P.V1106I的野生型基因序列分別為序列表中所 示的SEQIDN0 :10、SEQIDN0:11和SEQIDN0:12;所述三個(gè)突變位點(diǎn)的突變型基因序列 分別為序列表中所示的SEQIDN0 :13、SEQIDN0:14和SEQIDN0:15。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的一種肝豆?fàn)詈俗冃訟TP7B多位點(diǎn)突變檢測(cè)試劑盒，其特 征在于，所述試劑盒進(jìn)一步包括完成HRM檢測(cè)所需的試劑和酶。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105821134SQ201610279944
【公開(kāi)日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年4月29日
【發(fā)明人】黃堅(jiān), 徐安健, 呂婷霞
【申請(qǐng)人】首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院