專利名稱：乳-n-二糖含有液的處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及乳-N-二糖(Lacto-N-biose)含有液的處理方法、通過所述處理方法進(jìn)行了處理的乳-N- 二糖含有液及其干燥物、以及含乳-N- 二糖的制品的制造方法。本申請基于2010年2月5日在日本申請的日本特愿2010-024436號主張優(yōu)先權(quán)，將其內(nèi)容援引于此。
背景技術(shù)：
乳-N- 二糖是半乳糖和N-乙酰葡糖胺以P 1，3-鍵鍵合而成的二糖(Gal P I, 3GlcNAc、以下簡稱為LNB。),作為構(gòu)成母乳中所含的寡糖(乳寡糖milk oligose)、的二糖之一而眾所周知。迄今為止，作為LNB的制造方法，提出了使用微生物或酶的方法(例如專利文獻(xiàn)I 3)。最近，關(guān)于LNB，有報道稱其具有促進(jìn)雙歧桿菌增殖的作用等功能性(例如專利文獻(xiàn)4)。另外，整腸作用和免疫調(diào)節(jié)作用等對增進(jìn)和維持健康有效的各種作用被期待?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :日本特開平6-253878號公報專利文獻(xiàn)2 :日本特開2003-189891號公報專利文獻(xiàn)3 :日本特開2008-154495號公報專利文獻(xiàn)4 :日本特開2008-290972號公報

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題因而，認(rèn)為今后將LNB配合到食品、藥品、化妝品、和詞料等各種制品中。在這些制品中配合LNB時，為了進(jìn)行殺菌等，需要對配合前的LNB、或配合了 LNB的制品以65°C以上的溫度進(jìn)行加熱處理。但是，根據(jù)本發(fā)明人等的研究，若對含有LNB的液體進(jìn)行這樣的加熱處理，則可能會產(chǎn)生所述液體中的LNB分解、變性、以及生理活性的失活等問題。因此，在制造工序中包含加熱處理的制品的情況下，預(yù)想制造時無法實施充分的加熱處理。本發(fā)明是鑒于上述情況而進(jìn)行的，其目的在于提供能夠抑制以65°C以上的溫度對LNB含有液進(jìn)行加熱處理時的LNB的熱分解的處理方法；通過所述處理方法處理的LNB含有液及其干燥物；以及含LNB的制品的制造方法。用于解決問題的方案本發(fā)明人進(jìn)行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，若以65°C以上的溫度對LNB含有液進(jìn)行加熱，則N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的脫水物和半乳糖(Gal)作為分解變性產(chǎn)物而生成?；谏鲜鲆娊?，將這些分解變性產(chǎn)物作為指標(biāo)而對所述熱分解反應(yīng)進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LNB含有液中的LNB在中性至堿性條件下熱穩(wěn)定性低,熱分解反應(yīng)大幅進(jìn)行,另一方面，若在pH5.5以下且2.0以上的范圍內(nèi)，則所述熱分解反應(yīng)的進(jìn)行被抑制，由此完成了本發(fā)明。用于解決上述課題的本發(fā)明具有以下方式。<1> 一種LNB含有液的處理方法，其包括制備25°C下的pH為2. 0以上且5. 5以下的LNB含有液；和以65°C以上的溫度對所述含有液進(jìn)行加熱處理。<2>根據(jù)〈1>所述的處理方法，其中，所述LNB含有液為液體狀的食品、藥品、化妝品或飼料。<3> 一種LNB含有液，其通過〈1>或〈2>所述的處理方法進(jìn)行了處理。<4> 一種LNB含有液的干燥物，其通過〈1>或〈2>所述的處理方法進(jìn)行了處理。<5> 一種含LNB的制品的制造方法，其包括將通過〈1>或〈2>所述的處理方法進(jìn)行了處理的LNB含有液或其干燥物配合到食品、藥品、化妝品或飼料中。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，可以提供能夠抑制以65°C以上的溫度對LNB含有液進(jìn)行加熱處理時的LNB的熱分解的處理方法；通過所述處理方法處理的LNB含有液及其干燥物；以及含LNB的制品的制造方法。


圖I是示出試驗例I的結(jié)果(在不同pH的LNB含有液中，以90°C加熱處理60分鐘后的TLC檢測圖案)的照片。圖2是示出試驗例2的結(jié)果(在pH7. 0的LNB含有液中，利用不同的溫度和時間進(jìn)行加熱處理后的TLC檢測圖案)的照片。
具體實施例方式本發(fā)明的處理方法中，首先，制備25°C下的pH為2.0以上且5. 5以下的LNB含有液。所述pH優(yōu)選為2.0以上且5.0以下，更優(yōu)選為2.0以上且4. 5以下。若LNB含有液的pH在超過5. 5或低于2. 0的范圍內(nèi)，則通過之后工序以65°C以上的溫度進(jìn)行加熱處理時，容易產(chǎn)生LNB的分解，特別是在超過pH7.0的范圍內(nèi)，LNB具有完全分解的傾向。在低于PH2.0的區(qū)域內(nèi)，認(rèn)為除了熱所引起的分解以外，還會產(chǎn)生酸所引起的分解。若LNB含有液的pH在2.0以上且5.0以下的范圍，則通過之后工序以65°C以上的溫度進(jìn)行加熱處理時，難以產(chǎn)生LNB的分解。本發(fā)明中的“25°C下的pH為2.0以上且5. 5以下的LNB含有液”是指，以25°C的溫度為基準(zhǔn)時的LNB含有液的pH在上述范圍內(nèi)的情況。即，在25 V以外的溫度下制備所述LNB含有液時，對應(yīng)于該溫度對所述pH的范圍進(jìn)行修正。制備經(jīng)如此修正的pH的范圍的LNB含有液的情況也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。換言之，假設(shè)某溫度下的pH不在2.0以上且5. 5以下的范圍，但以25°C為基準(zhǔn)時pH可修正為2. 0以上且5. 5以下的范圍，則制備該LNB含有液的情況也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，65°C下的pH為I. 90的LNB含有液以25°C為基準(zhǔn)進(jìn)行修正時為pH2. 01，因、而制備該LNB含有液后，通過之后工序以65°C以上的溫度進(jìn)行加熱處理的情況也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。作為LNB含有液，可列舉出將LNB溶解到水等溶劑中而成的溶液(以下，稱為LNB溶液。)、將LNB或LNB溶液加入到液體制品(液體狀的食品、藥品、化妝品或飼料等)中的物質(zhì)(以下，稱為添加LNB的液體制品。)和作為本來的成分而含有LNB的液體制品(液體狀的食品、藥品、化妝品或飼料等。以下，稱為含有天然LNB的液體制品。)等，可以使用任
意一種。作為pH2. 0以上且5. 5以下的LNB含有液的制備方法，沒有特別限定，可列舉出例如下述方法⑴ ⑵等。(I)將pH超過5. 5的LNB含有液(以下，稱為高pH_LNB含有液。)的pH調(diào)整為2.0以上且5.5以下的方法。 (2)將LNB溶解在pH2. 0以上且5. 5以下的液體中的方法。方法(I)中，高pH-LNB含有液可以是上述LNB溶液、添加LNB的液體制品和含有天然LNB的液體制品的任意一種。高pH-LNB含有液的pH可以通過添加酸而調(diào)節(jié)。作為酸，可以從以往用于pH調(diào)節(jié)的酸中適宜選擇，可以單獨(dú)使用鹽酸、磷酸等無機(jī)酸和檸檬酸、乙酸等有機(jī)酸中的任意一種，也可以將兩種以上組合。作為方法⑵中使用的pH2. 0以上且5. 5以下的液體，可列舉出與上述方法(I)同樣地調(diào)節(jié)PH超過5. 5的液體(例如水、緩沖液等)的pH而得到的液體、和pH為2. 0以上且5. 5以下的液體制品(例如橘子等柑橘類的果汁等)。LNB的制造方法沒有特別限定，可以從公知的方法中適宜選擇。具體而言，例如，可列舉出以下方法將含有乳糖和N-乙酰葡糖胺的底物作為起始原料，使豬睪丸來源的3 -半乳糖苷酶和環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)生產(chǎn)的P _半乳糖苷酶依次反應(yīng)的方法(參照日本特開平6-253878號公報)；利用具有由糖核苷酸和復(fù)合糖前體物質(zhì)生產(chǎn)復(fù)合糖的能力的微生物、動物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞的方法(參照日本特開2003-189891號公報)；和基于酶法的LNB制造方法(參照日本特開2008-154495號公報)等。其中，由于簡便性優(yōu)異而優(yōu)選日本特開2008-154495號公報中記載的下述方法。在N-乙酰葡糖胺、磷酸、LNB磷酸化酶(EC 2. 4. I. 211)和UDP-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶(EC 5. I. 3. 2)的存在下，使下述組合作用的方法。(i)糖質(zhì)原料與將所述糖質(zhì)原料加磷酸分解而生成a -葡萄糖-I-磷酸的酶的組合；以及(ii)將a -葡萄糖-I-磷酸轉(zhuǎn)換為UDP-葡萄糖的酶及將UDP-半乳糖轉(zhuǎn)換為半乳糖-I-磷酸的酶與它們的輔助因子的組合、和/或?qū) -葡萄糖-I-磷酸及UDP-半乳糖分別轉(zhuǎn)換為UDP-葡萄糖及a-半乳糖-I-磷酸的酶(UDP-Gly生成酶)與其輔助因子的組
八
口 o使用了上述這樣的微生物和酶的LNB的合成反應(yīng)通常在pH7. 0 7. 5左右的液體中進(jìn)行，其反應(yīng)溫度為37°C左右。所得到的反應(yīng)液中含有的LNB可以通過柱色譜法等公知的方法回收。pH為2. 0以上且5. 5以下的LNB含有液的加熱處理以65°C以上的溫度進(jìn)行。
由于能夠充分抑制LNB的熱分解，因而所述加熱溫度的上限通常為140°C以下。優(yōu)選的加熱處理溫度可以在上述范圍內(nèi)根據(jù)該加熱處理的目的而適當(dāng)設(shè)定。例如以加熱殺菌為目的的情況下，所述加熱處理溫度優(yōu)選為65 140°C，更優(yōu)選為80 140°C。另外，食品加工等中的不以加熱殺菌為目的的加熱處理(例如以蛋白質(zhì)的變性等為目的的加熱處理)的情況下，所述加熱處理溫度優(yōu)選為70 120°C，更優(yōu)選為80 100。。。加熱時間根據(jù)加熱溫度而異，通常為2秒 60分鐘，優(yōu)選為2秒 10分鐘。經(jīng)加熱處理的LNB含有液在通過常規(guī)方法冷卻后，可以根據(jù)需要填充到容器中，密封后制成容器裝LNB含有液制品。
經(jīng)加熱處理的LNB含有液也可以干燥而制成干燥物。例如將僅含有LNB的LNB溶液通過本發(fā)明的處理方法加熱處理，并對所得到的LNB含有液進(jìn)行干燥，從而得到LNB粉末。作為LNB含有液的干燥方法，由于LNB的穩(wěn)定性優(yōu)異而優(yōu)選冷凍干燥。如上所述經(jīng)加熱處理的LNB含有液或其干燥物或者不含有LNB的分解變性產(chǎn)物，或者即使含有，其含量也是略微的。根據(jù)本發(fā)明的處理方法，能夠以加熱殺菌或其他加工目的對含有被期待具有各種生理活性的LNB的LNB含有液進(jìn)行加熱處理，而不損害其活性。因此，本發(fā)明的處理方法可以應(yīng)用于食品、藥品、化妝品或飼料等制品的制造中包含加熱處理工序的加工和處理。例如作為加熱處理對象的LNB含有液使用液體制品(液體狀的食品、藥品、化妝品或飼料)，從而可在不損害LNB的活性的情況下得到經(jīng)加熱處理的含有LNB的制品(含有LNB的食品、含有LNB的藥品、含有LNB的化妝品或含有LNB的飼料)。另外，通過將如上所述經(jīng)加熱處理的LNB含有液或其干燥物配合到各種制品(食品、藥品、化妝品或飼料等)中，可以制造含LNB的制品。此外，通過本發(fā)明的處理方法得到的LNB含有液或其干燥物中的LNB由于是構(gòu)成母乳中天然所含的寡糖(乳寡糖)的二糖，因此即使添加到食品、藥品和化妝品等中也是安全的。實施例接下來，示出試驗例和實施例來對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明，但本發(fā)明并不限定于以下的實施例。以下各例中，pH均為25°C下的pH，使用Horiba Navi F-25 (H0RIBA公司制)測定。<制造例I :LNB粉末的制備>根據(jù)日本特開2008-154495號公報中記載的基于酶法的LNB的制造方法，按照以下步驟制備LNB粉末。根據(jù)日本特開2008-154495號公報的實施例8的記載進(jìn)行反應(yīng)，得到LNB濃度為50mM的反應(yīng)液。將所得到的反應(yīng)液脫鹽后，供于將Toyo pearl HW40F(東曹公司制)用作填充劑的柱色譜中，分取二糖級分后，進(jìn)行冷凍干燥，得到純度為95%的LNB粉末1kg。<試驗例1>該試驗的目的在于調(diào)查LNB含有液的pH、和其加熱對LNB的穩(wěn)定性所造成的影響。I)試驗方法
將上述制造例I中制備的LNB粉末以2%的濃度(質(zhì)量％。以下相同)溶解于在各PH區(qū)域的范圍內(nèi)使pH以每隔0. 5的方式改變的0. IM的檸檬酸緩沖液(pH3. 0 6. 0)、
0.IM的磷酸緩沖液(pH6. 0 8. 0)或0. IM的甘氨酸緩沖液(pH 8. 5 10. 5)中，制備試樣(LNB含有液)I 16。將所制備的試樣I 16分別以5mL分注于試管中，以90°C加熱60分鐘。將加熱的各試樣冷卻到15°C，在硅膠薄層色譜(TLC)上點樣I U L，并用80%的乙腈溶劑展開，浸潰于5%硫酸水溶液中后用加熱爐加熱顯色，通過目視確認(rèn)分解變性產(chǎn)物(N-乙酰葡糖胺的脫水物和半乳糖)的生成的有無及其生成量，確認(rèn)分解的有無及其分解程度。2)試驗結(jié)果
試驗結(jié)果示于圖I。圖I拍攝了以90°C加熱處理60分鐘后的、pH不同的各試樣的TLC檢測圖案。圖I中，Gal表示半乳糖，GlcNAc表示N-乙酰葡糖胺。由圖I可知，在上述加熱條件下，LNB在pH5. 5以下、特別是pH5. 0以下基本上不分解，是穩(wěn)定的。但是，若PH為6. 0以上、特別是pH7. 0以上，則可知分解變性產(chǎn)物多，LNB不穩(wěn)定。<試驗例2>該試驗的目的在于調(diào)查針對中性區(qū)域的LNB含有液的加熱溫度和時間對LNB的穩(wěn)定性所造成的影響。I)試驗方法將上述制造例I中制備的LNB粉末以2%的濃度溶解于pH7. 0的0. IM的磷酸緩沖液中，制備試樣(LNB含有液)。將所述試樣以5mL分注于試管中，以90°C加熱處理0、10、20、30、40、50或60分鐘，或者以65、67、70、75、80、85或88°C加熱處理60分鐘。將加熱的各試樣冷卻到15°C，根據(jù)試驗例I中記載的方法確認(rèn)分解的有無及其分
解程度。2)試驗結(jié)果試驗結(jié)果示于圖2。圖2拍攝了改變溫度和時間進(jìn)行加熱處理后的pH7. 0的LNB含有液的TLC檢測圖案。由圖2可知，在所有加熱處理條件下均檢測出分解變性產(chǎn)物，加熱時間越長、或加熱溫度越高則其量越多。由該結(jié)果可知，LNB在中性區(qū)域中在所有加熱處理條件下均分解，其分解的程度與加熱時間和溫度成正比?！丛囼灷?>該試驗的目的在于調(diào)查針對pH5. 5以下的區(qū)域內(nèi)的LNB含有液的加熱溫度和時間對LNB的穩(wěn)定性所造成的影響。I)試驗方法將上述制造例I中制備的LNB粉末以2%的濃度溶解于0. IM的檸檬酸緩沖液(pH5. 5、5. 0、4. 0、3. 0)中，制備LNB含有液。另外，使用IM的鹽酸將pH3. 0的LNB溶液的一部分調(diào)整為pH2. 0或1.0。另外，在pH7. 0的0. IM磷酸緩沖液中以2%的濃度溶解LNB，制備LNB含有液。
將調(diào)整為各pH的LNB含有液的套組(set)分別以規(guī)定的溫度(65、70、80、90、100或120。。)加熱規(guī)定時間(5、10、20、30或60分鐘)。將加熱的各LNB含有液冷卻，通過試驗例I中記載的方法確認(rèn)分解的有無及其分解程度。根據(jù)下述基準(zhǔn)由其結(jié)果評價分解程度。(評價基準(zhǔn))-:無分解。土 略微分解。+:部分分解。、
++ :大部分分解。+++ :幾乎完全分解。2)試驗結(jié)果試驗結(jié)果示于表I。由表I可知，LNB在pH2.0以上且5. 5以下的區(qū)域中幾乎不分解，是穩(wěn)定的。所述效果特別是在PH2. 0以上且5. 0以下、尤其是pH2. 0以上且4. 0以下的情況下是優(yōu)異的。另一方面可知，關(guān)于pH為7. 0或I. 0的LNB含有液，即使通過5分鐘的加熱也引起分解，其分解的程度與加熱時間和溫度成正比。[表 I]
權(quán)利要求
1.一種乳-N-二糖含有液的處理方法,其包括 制備25°C下的pH為2. O以上且5. 5以下的乳-N- 二糖含有液；和 以65°C以上的溫度對所述含有液進(jìn)行加熱處理。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的處理方法，其中，所述乳-N-二糖含有液為液體狀的食品、藥品、化妝品或飼料。
3.一種乳-N- 二糖含有液，其通過權(quán)利要求I或2所述的處理方法進(jìn)行了處理。
4.一種乳-N- 二糖含有液的干燥物，其通過權(quán)利要求I或2所述的處理方法進(jìn)行了處理。
5.一種含乳-N- 二糖的制品的制造方法，其包括將通過權(quán)利要求I或2所述的處理方法進(jìn)行了處理的乳-N- 二糖含有液或其干燥物配合到食品、藥品、化妝品或飼料中。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種乳-N-二糖含有液的處理方法，其包括制備25℃下的pH為2.0以上且5.5以下的乳-N-二糖含有液；和以65℃以上的溫度對所述含有液進(jìn)行加熱處理。根據(jù)本發(fā)明，可以提供能夠抑制以65℃以上的溫度對乳-N-二糖含有液進(jìn)行加熱處理時的乳-N-二糖的熱分解的處理方法；通過所述處理方法處理的乳-N-二糖含有液及其干燥物；以及含乳-N-二糖的制品的制造方法。
文檔編號A23L1/30GK102740714SQ20118000830
公開日2012年10月17日 申請日期2011年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月5日
發(fā)明者北岡本光, 清水金忠, 西本完 申請人:森永乳業(yè)株式會社