專利名稱：預(yù)測hcv治療結(jié)果的單核苷酸多態(tài)性的制作方法
預(yù)測HCV治療結(jié)果的單核苷酸多態(tài)性本發(fā)明涉及用于預(yù)測感染丙型肝炎病毒(HCV)的患者對藥理學(xué)治療的應(yīng)答的方法。
背景技術(shù)：
用于慢性丙型肝炎的護理標(biāo)準(zhǔn)是聚乙二醇干擾素(pegintefeixm)加利巴韋林的組合^用護理標(biāo)準(zhǔn)治療之后，盡管很難預(yù)測個體患者是否將實現(xiàn)持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(SVR)，但是整體的SVR比率為約50%2_4。實現(xiàn)SVR的可能性隨著一組患者和病毒因素而不同。例如，較年輕的患者，白種人和亞洲患者以及不具有晚期肝纖維化的個體更有可能在治療之后清除HCV的感染5Λ相似地，感染了 HCV基因型2或者3，而不是基因型I的患者和具有血清中的低基線HCV RNA水平的那些患者具有最好的治愈機會2_46，8。 如今只有在治療起始之后，SVR的更精確預(yù)測才是可能的。不考慮HCV的基因型，在治療4或者12周之后清除HCV RNA的個體比具有持續(xù)的病毒血癥的那些個體具有實現(xiàn)SVR的更好的機會9?？焖俨《緦W(xué)應(yīng)答(RVR，在第4周時檢測不到HCV RNA)是SVR的強預(yù)測值；相反地，不能實現(xiàn)早的病毒學(xué)應(yīng)答(EVR，在第12周時HCV RNA超過兩個對數(shù)值的下降)是獨立于預(yù)處理特征的無應(yīng)答的強預(yù)測值1Q。能在對護理標(biāo)準(zhǔn)的潛在的應(yīng)答者和非應(yīng)答者之間預(yù)期地區(qū)分將對具有慢性丙型肝炎的患者的護理具有很大的影響。治療決策將基于患者對護理標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)答概率而個性化。例如，具有用護理的當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)實現(xiàn)SVR的最低的可能性的患者可以延遲治療，直到直接作用的抗病毒劑是可獲得的。相反地，具有實現(xiàn)SVR的高可能性的患者可能更愿意用治療方案立即起始治療，所述治療方案是已知的實體。除了宿主和病毒因素，宿主的遺傳多樣性也影響對用護理標(biāo)準(zhǔn)治療的應(yīng)答η。最近來自全基因組相關(guān)研究的證據(jù)提示在IL_28b基因的啟動子區(qū)中的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)對用聚乙二醇干擾素加利巴韋林治療的患者中的SVR的可能性產(chǎn)生了強烈的影響12_14。本分析的目的是在包括首次接受治療的個體和對以前的聚乙二醇干擾素a-2b(12KD)加利巴韋林的療程的無應(yīng)答者的患者的多樣組群中探查與早期病毒學(xué)應(yīng)答(EVR)和SVR都相關(guān)的SNPs，所述患者接受了聚乙二醇干擾素a_2a(40KD)的單一療法或者聚乙二醇干擾素a -2a (40KD)或常規(guī)的干擾素加利巴韋林的組合治療。發(fā)明概述本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)在人4號染色體上的幾種SNP基因型和用基于干擾素的方案治療的患者中的SVR之間的關(guān)聯(lián)。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于預(yù)測感染了 HCV的人類受試者對干擾素治療的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答的方法，所述方法包括提供來自所述人類受試者的樣品，檢測4號染色體中的單核苷酸多態(tài)性的存在，并且如果存在所述的單核苷酸多態(tài)性，那么確定所述受試者具有對干擾素治療持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答的高可能性，其中所述的單核苷酸多態(tài)性選自由rsl0009948處的G, rsl0023606處的G和rs7673763處的T組成的組。附圖
簡述
圖I.在整個的基因型I群體中通過染色體對rsl2979860調(diào)整之后(a)SVR(b)EVR)和(c)SVR的全基因組的關(guān)聯(lián)結(jié)果。圖2.用于(a)SVR和(b)EVR)的檢驗統(tǒng)計學(xué)分布的分位數(shù)-分位數(shù)圖?；疑珗A圈表示預(yù)期的P-值并且藍(lán)色圓圈顯示觀察到的P值。圖3.在白種人基因型I群體的IL-28區(qū)中的顯著SNPs的連鎖不平衡(p〈10_5)。發(fā)明詳述定義為幫助理解本發(fā)明，下面定義了很多術(shù)語。本文定義的術(shù)語具有與本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義。術(shù)語如“一個”和“這個”不是意指僅僅單數(shù)實體，而是包括可能用于闡述的具體實例的一般種類。本文的術(shù)語用于描述本發(fā)明具體的實施方案，但除了權(quán)利要求中概述的那些，所述術(shù)語的使用不限定本發(fā)明的界限。 對用干擾素治療的術(shù)語“應(yīng)答”是對試劑施用的所希望的反應(yīng)。病毒學(xué)終點包括“早期病毒學(xué)應(yīng)答”(EVR)，定義為從基線至12周的血清HCVRNA中> 2個對數(shù)值的下降(通過Cobas Amplicor HCV監(jiān)測值測試，v2. 0，定量極限600IU/mL)，完全EVR(cEVR)定義為血清中檢測不到HCVRNA (通過Cobas Amplicor HCV測試，v2. 0，檢測極限50IU/mL)，或者“持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答”(SVR)，定義為在24周未治療的隨訪期結(jié)束時檢測不到HCV RRA 50IU/mL)。術(shù)語“樣品”或者“生物學(xué)樣品”指的是從個體分離的組織或者液體樣品，所述樣品包括但不限于，例如活組織檢查、血漿、血清、全血、脊髓液、淋巴液、皮膚的外部切片、呼吸道、腸道和泌尿生殖道、眼淚、唾液、乳汁、血細(xì)胞、腫瘤、器官。所述樣品也包括體外細(xì)胞培養(yǎng)組分的樣品(包括但不限于從培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長取得的條件培養(yǎng)基、推定被病毒感染的細(xì)胞、重組細(xì)胞和細(xì)胞組分)。本文可互換使用術(shù)語“干擾素”和“干擾素-α ”并且其指的是抑制病毒復(fù)制和細(xì)胞增殖以及調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的高度同源的物種特異的蛋白質(zhì)家族。典型的合適的干擾素包括但不限于，重組干擾素a -2b如從先靈公司，Kenilworth, N. J.獲得的丨ntnm* Λ干擾素，重組干擾素ct -2a如從哈夫曼-拉羅切有限公司，Nutley, N. J獲得的RofeiO丨1'~ 干擾素，重組干擾素 a-2c如從Boehringer Ingelheim Pharmaceutical, Inc,Ridgefield, Conn獲得的BeiOfor α 2干擾素，干擾素α-η ，其是天然α干擾素的純化的混合物，如從Sumitomo,日本獲得的SumifeiOIl 或者從Glaxo_Wellcome Ltd.,倫敦,英國獲得的WellfeiOIl 干擾素α -nl，或者共有的α干擾素如在美國專利號4，897，471和4，695，623中描述的那些(尤其實施例7、8或者9中的那些)和從Amgen, Inc. Newbury Park,加利福尼亞州獲得的特定產(chǎn)物，或者干擾素ct-n3,其是由Interferon Sciences制備的天然α-干擾素混合物，并且所述干擾素α-η3可從Purdue Frederick Co. Norwalk, Conn.以商品名稱Alferon獲得。使用干擾素a-2a或者a_2b是優(yōu)選的。干擾素可以包括下面定義的聚乙二醇化干擾素。本文可互換使用術(shù)語“聚乙二醇化干擾素”，“聚乙二醇干擾素α ”并且其指的是干擾素α的，優(yōu)選干擾素a-2a和a-2b的經(jīng)聚乙二醇修飾的綴合物。典型的合適的聚乙二醇化干擾素α包括但不限于Pegasys''8和Peg-Intnm'術(shù)語“利巴韋林”指的是化合物I- ((2R, 3R, 4S, 5R) _3，4_ 二羥基_5_羥甲基-四氫-呋喃-2-基)-1Η-[1，2，4]三唑一3-羧酸酰胺，其是合成的非干擾素誘導(dǎo)的廣譜抗病毒核苷類似物并且以名稱Vii^zaieHopegu f可獲得。“直接作用抗病毒劑”獨立于免疫功能發(fā)揮特定的抗病毒效應(yīng)。用于HCV的直接作用抗病毒劑的實例包括但不限于蛋白酶抑制劑、聚合酶抑制劑、NS5A抑制劑、IRES抑制劑和解旋酶抑制劑。當(dāng)前推薦的用于具有慢性丙型肝炎的患者的第一線治療在攜帶基因型I或4病毒的患者中是聚乙二醇化干擾素α與利巴韋林組合持續(xù)48周，并且在攜帶基因型2或3病毒的患者中持續(xù)24周。在干擾素α治療的一個或者多個療程之后復(fù)發(fā)的患者以及以前未
治療過的患者中，發(fā)現(xiàn)與利巴韋林組合的治療比干擾素α單一療法更有效。然而，利巴韋林顯示出明顯的副作用，其包括致畸性和致癌性。此外，在約10%至20%的患者中，利巴韋林引起溶血性貧血，需要減少劑量或者中止利巴韋林治療，所述溶血性貧血可能與利巴韋林三磷酸鹽在紅細(xì)胞中的積聚有關(guān)。因此，為降低治療成本和不利事件的發(fā)生率，將治療調(diào)整至更短的持續(xù)時間而不降低功效是所希望的。對于用聚乙二醇化干擾素α和利巴韋林治療的基因型I的患者，縮短的“治療持續(xù)時間”可以是，例如24周。對于用聚乙二醇化干擾素α和利巴韋林組合直接作用抗病毒劑治療的基因型I的患者，縮短的治療持續(xù)時間可以短至8周、12周或者16周。本文使用的術(shù)語“等位基因”和“等位基因變體”指的是基因的備選形式，其包括與基因或者它的部分相關(guān)的內(nèi)含子、外顯子、內(nèi)含子/外顯子接點以及3’和/或5’非翻譯區(qū)。一般，等位基因占據(jù)同源染色體上的相同基因座或者位置。當(dāng)受試者具有一個基因的兩個相同的等位基因時，稱受試者對該基因或等位基因是純合的。當(dāng)受試者具有一個基因的兩個不同的等位基因時，稱受試者對該基因是雜合的。特定基因的等位基因彼此之間可以在單個核苷酸或者幾個核苷酸中不同，并且可以包括核苷酸的取代、缺失和插入。本文使用的術(shù)語“多態(tài)性”指的是超過一種形式的核酸的共存，所述核酸包括外顯子和內(nèi)含子或者它的部分(例如，等位基因變體)。有至少兩種不同的形式，即兩種不同的核苷酸序列的基因的部分被稱作基因的多態(tài)區(qū)。多態(tài)區(qū)可以是單個核苷酸，即“單核苷酸多態(tài)性”或者“SNP”，其身份在不同的等位基因中是不同的。多態(tài)區(qū)也可以是幾個核苷酸的長度。已知檢測多態(tài)性的多種方法并且其可以與本發(fā)明聯(lián)合使用。一般，這些方法包括直接地(例如，原位雜交)或者間接地(鑒定對第二種分子的改變，例如蛋白質(zhì)序列或者蛋白質(zhì)結(jié)合)鑒定潛在的核酸序列中的一個或者多個突變。一種用于檢測多態(tài)性的已知的方法是使用探針進行的等位基因特異性雜交，所述探針重疊突變或者多態(tài)位點并且具有突變或者多態(tài)區(qū)周圍的約5、10、20、25或者30個核苷酸。為在試劑盒中使用，為使用者提供了或者甚至附著到固相支持體，例如珠或者芯片上的例如能特異性地雜交到等位基因變體，如單核苷酸多態(tài)性的幾種探針。單核苷酸多態(tài)性，〃rsl2979860〃指的是通過它在 SNPs (dbSNP, www. ncbi. nlm.nih. rov/SNP/)數(shù)據(jù)庫的檢索號鑒定的SNP，并且其定位于人19號染色體上的IL28b基因的啟動子區(qū)內(nèi)。來自兩個大的多國家研究(在實施例部分描述)的數(shù)據(jù)的這種分析結(jié)果證實和擴展了 Ge等人12首先報導(dǎo)的用聚乙二醇干擾素加利巴韋林治療之后在IL-28區(qū)的SNPs和SVR之間顯著的關(guān)聯(lián)。在本分析中，最顯著的SNP(rsl2979860)與EVR(p=5. 0χ10_26)和SVR(p=1.4xlO_21)都相關(guān)。在治療后實現(xiàn)了 SVR的患者以及非應(yīng)答者的大的亞群的良好的純種性質(zhì)是本研究的獨特優(yōu)勢，所述患者不僅包括用聚乙二醇干擾素a-2a(40KD)加利巴韋林治療的患者，而且也包括用聚乙二醇干擾素a-2a(40KD)單一療法和常規(guī)的干擾素加利巴韋林的組合治療的患者。本研究允許產(chǎn)生一些獨特的建議。首先，我們提示rs 12979860的效應(yīng)最有可能作用在EVR而非SVR上。在以前的對治療的非應(yīng)答者中和用聚乙二醇干擾素a -2a(40KD)單一療法或者常規(guī)的干擾素加利巴韋林治療的患者中可見與EVR而不是與SVR相關(guān)。我們將這解釋為意指通過這種SNP作用的機制與血清中的HCV RNA水平快速第一相下降相關(guān)而 不是與較慢的第二相下降或者肝細(xì)胞更新相關(guān)。HCV RNA中的第一相下降是被很好地描述的現(xiàn)象，其在基于干擾素的治療的起始之后不久發(fā)生并且已經(jīng)提示是特定患者對干擾素的敏感性的指標(biāo)19。然后，本研究中使用的特定的芯片允許我們排列除了 rs 12979860之外的SNPs系列的顯著性，所述SNPs全部在以前的研究中被鑒定12_14’2°’21。盡管在IL28b區(qū)鑒定了幾個高度顯著的標(biāo)記，但是對rsl297980調(diào)整后它們均不與SVR顯著地相關(guān)。在對rs 12979860調(diào)整之后，只有一種SNP(rs8099917)是與EVR統(tǒng)計學(xué)上顯著地相關(guān)；然而，在對多重比較調(diào)整之后，將不認(rèn)為該相關(guān)是顯著的。此外，通過對rs 12979860調(diào)整，我們能開始探查可能影響實現(xiàn)病毒學(xué)應(yīng)答概率的潛在的基因-基因相互作用。如上面提到的，在原始分析中鑒定的IL28b區(qū)中的其他高度顯著的SNPs在該處理后均沒有保留；然而，揭示了定位于4號染色體上的以前未報導(dǎo)過的一系列SNPs。在一些回顧性研究12_14，2°_23包括本研究中取得了一致的結(jié)果，允許我們自信地指出在IL28b的啟動子區(qū)的SNPs與用基于干擾素治療的治療結(jié)果高度相關(guān)。已經(jīng)提示在本區(qū)域中的多個啟動子中的一個的變化改變了干擾素λ的肝表達(dá)。干擾素λ是III型干擾素，其引發(fā)與I型干擾素(包括干擾素- α )的Jak/Stat途徑重疊的信號途徑24_26。我們假設(shè)在具有“允許的” SNP的患者中，HCV感染誘導(dǎo)包括III型干擾素(如IL28)的干擾素的局部產(chǎn)生。這導(dǎo)致了在肝中干擾素誘導(dǎo)的基因表達(dá)。這種假設(shè)與以前的報導(dǎo)一致，所述報導(dǎo)是對基于干擾素治療的無應(yīng)答者在治療起始之前在他們的肝中具有刺激干擾素的基因(ISGs)的增加的肝表達(dá)，并且無應(yīng)答者是處在明顯的“預(yù)活化”狀態(tài)中27。沒有清楚地解釋在內(nèi)源的ISG誘導(dǎo)水平和對基于干擾素治療的隨后的應(yīng)答性之間的這種明顯的矛盾關(guān)系。一些研究者已經(jīng)推測在軸上的類似于蛋白激酶PKR的ISG誘導(dǎo)的下游效應(yīng)中的一些可能通過真核起始因子2a (eIF2a)的磷酸化抑制內(nèi)源的蛋白質(zhì)產(chǎn)生并且導(dǎo)致肝細(xì)胞抗拒外源的干擾素的進一步刺激，不能進一步減少蛋白質(zhì)的產(chǎn)生28。通過內(nèi)部的核糖體進入位點翻譯HCV RNA并且其部分地是不依賴eIF2a的。因此，盡管是處在“預(yù)活化”狀態(tài)，HCV RNA的復(fù)制和進一步病毒體的裝配可以不減弱地持續(xù)28。這種假設(shè)解釋了在我們的分析中為什么與更容易治療的基因型相比，應(yīng)答差的GWAS基因型與較低的病毒載量相關(guān)，盡管以前的分析提示增加基線病毒載量是差的治療結(jié)果的指標(biāo)6。雖然在這些患者中干擾素的內(nèi)源產(chǎn)生部分地削弱了病毒復(fù)制，但是同時削弱了宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成?？赡苡幸粋€閾值，在所述閾值之上宿主細(xì)胞不能進一步降低蛋白質(zhì)的產(chǎn)生或者增加ISGs的刺激。因此，外源的干擾素不能增加宿主應(yīng)答。然而，矛盾地是，外源的聚乙二醇化干擾素的施用可以“拯救”對內(nèi)源干擾素較不敏感的患者?；蚨鄳B(tài)性可能在ISG的表達(dá)中起作用。這引導(dǎo)我們推測最終有可能有選擇地靶向干擾素途徑以產(chǎn)生導(dǎo)致HCV根除的更有利的ISG譜。解釋4號染色體中SNP與SVR相關(guān)，然而不是與EVR相關(guān)的可能的機制是更具有挑戰(zhàn)性的。最簡單的解釋可能需要該區(qū)域的基因，其涉及僅僅與SVR相關(guān)的現(xiàn)象如肝細(xì)胞更新。額外的宿主-宿主基因或者宿主-病毒基因的相互作用可能涉及在該機制中，通過該機制兩個基因座均發(fā)揮它們的效應(yīng)，并且所述相互作用需要更謹(jǐn)慎的評估。發(fā)現(xiàn)在IL28b區(qū)中干擾素治療敏感度基因座涉及用當(dāng)前護理標(biāo)準(zhǔn)(SOC)，即聚乙二醇干擾素加利巴韋林的治療中。在不久的將來，可以設(shè)想將在起始治療之前確定一些患者中IL28b基因型，并且將不僅通過HCV基因型使患者分層-如當(dāng)前推薦的L而且通過人基因型使患者分層。與當(dāng)前治療的規(guī)范比較，起始的治療方案將基于病毒和人的基因型。在這種背景下將需要在預(yù)期的試驗中處理利巴韋林的推定作用。
這種發(fā)現(xiàn)也涉及用于HCV治療的直接作用抗病毒劑的正進行的發(fā)展計劃。直接作用抗病毒劑獨立于免疫功能發(fā)揮特定的抗病毒效應(yīng)，但是認(rèn)為發(fā)展中的至少一些藥物類型可以受益于累加的(如果不是協(xié)同的)先天性免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。實際上，有可能基于干擾素的治療將仍然是治療的骨干，因為需要防止抗性HCV的出現(xiàn)29。HCV RNA編碼特定的蛋白質(zhì)，其可以抑制I型干擾素的誘導(dǎo)。例如HCV的NS3-4A蛋白酶通過干擾干擾素調(diào)節(jié)因子-3(IRF-3)的磷酸化阻斷dsRNA-誘導(dǎo)的干擾素的產(chǎn)生3°。因此，NS3-4A蛋白酶是二元的治療靶標(biāo)，所述NS3-4A蛋白酶的抑制可以阻斷病毒的復(fù)制和恢復(fù)HCV RNA復(fù)制的IRF-3控制。當(dāng)?shù)鞍酌敢种苿┤鏣elaprevir與第二種小分子或者護理標(biāo)準(zhǔn)組合施用時具有強勁的抗病毒效果，所述蛋白酶抑制劑也抑制蛋白酶功能，HCV通過所述蛋白酶功能削弱宿主干擾素的應(yīng)答。當(dāng)在具有干擾素-頑固的和干擾素-敏感的IL28b表型的患者中組合使用直接作用抗病毒劑與聚乙二醇干擾素加利巴韋林時，觀察治療結(jié)果是否相似將是重要的?？赡芨蓴_素-頑固的患者將對三重治療(直接作用抗病毒劑加聚乙二醇干擾素加利巴韋林)應(yīng)答，如同他們對僅用直接作用抗病毒劑的單一療法的應(yīng)答。如果是這種情況，那么具有干擾素-頑固的的IL28b表型的患者可能對用藥物如telaprevir治療過程中的抗性突變的選擇更敏感31。這種可能性提示不同的情形，其中具有干擾素-敏感的SNP (rSi2979860)的患者可能受益于用聚乙二醇干擾素和利巴韋林進行的縮短的治療，而具有干擾素-頑固基因型的那些患者可能是用于延長的治療持續(xù)時間和/或更強化的治療方案的候選者。備選地，直接作用抗病毒劑的不含干擾素的組合方案可能更適合具有干擾素-頑固基因型的患者。我們獨特的數(shù)據(jù)集，包括用于患者的聚乙二醇干擾素a -2a加利巴韋林治療的登記試驗，強調(diào)rsl2979860 SNP與EVR而不是SVR相關(guān)，所述患者是以前對用聚乙二醇化干擾素的護理標(biāo)準(zhǔn)治療的非應(yīng)答者。換句話說，這種SNP限定患者對干擾素的應(yīng)答性而不是對治療的最終反應(yīng)，因此由于患者實現(xiàn)EVR的可能性，幫助鑒定可能或者不可能經(jīng)歷SVR的患者。獨立于EVR預(yù)測SVR是不可能的。這對使用直接作用抗病毒劑和干擾素具有很大的關(guān)聯(lián)。用于干擾素應(yīng)答性的基線遺傳預(yù)測值的應(yīng)用允許調(diào)整直接作用抗病毒劑以及使用干擾素的護理標(biāo)準(zhǔn)。定義為弱的干擾素應(yīng)答的患者，即具有rsl2979860中的兩個T等位基因的患者，可以是小分子治療法的差的候選者，特別地，如果除了 SOC之外，以單一試劑提供小分子治療劑，那么所述小分子治療法依賴于內(nèi)源或者外源干擾素介導(dǎo)途徑的累加或者協(xié)同效應(yīng)。將考慮由于有效的單一療法，這些患者將具有發(fā)展藥物抗性突變的增加的風(fēng)險。相反地，具有干擾素應(yīng)答表型的患者，即具有rsl2979860中的兩個C等位基因的患者，將成為用于僅用SOC治療或者SOC與小分子組合治療的更短的療程的優(yōu)良的候選者。對干擾素應(yīng)答性的遺傳素質(zhì)的額外的考慮是組合直接作用抗病毒劑的“調(diào)諧”。預(yù)測具有可接受的內(nèi)源干擾素應(yīng)答性的患者可以是用于靶向病毒功能的藥物-如蛋白酶抑制劑(也具有內(nèi)源干擾素應(yīng)答的抑制作用)的極好的候選者，并且是用于降低病毒PAMP (病原體相關(guān)的分子模式，例如聚合酶抑制劑)量的藥物的較差的候選者，因為這些降低病毒PAMP量的藥物可以削弱患者通過他們內(nèi)源干擾素的應(yīng)答性幫助他們自愈的能力。相似地，與僅用直接作用抗病毒劑或者三重治療(S0C與一種DAA)相比，經(jīng)預(yù)測具有弱的干擾素應(yīng)答性的患者可以是用于作為第一線治療的“四重”治療(2種直接作用抗病毒劑，加聚乙二醇干擾素和利巴韋林)的候選者。
實施例方法患者樣品的收集和病毒學(xué)終點分析了來自具有慢性丙型肝炎的一小組患者的樣品，所述患者被登記到兩個大的隨機化的多國家的III期試驗中3'15。在一個研究中，首次用干擾素治療的患者被隨機化到僅用聚乙二醇干擾素a-2a(40KD)，或者用聚乙二醇干擾素a_2a(40KD)與利巴韋林的組合或者用常規(guī)的干擾素a _2a加利巴韋林的48周治療中3。只有以前對聚乙二醇干擾素a-2a(12KD)加利巴韋林的12-周療程無應(yīng)答者適合第二次試驗，其將患者隨機化到使用聚乙二醇干擾素a-2a(40KD)的標(biāo)準(zhǔn)方案或者誘導(dǎo)劑量方案(所有患者接受標(biāo)準(zhǔn)劑量的利巴韋林)的48周或者72周治療中15。在別處公開了研究的設(shè)計、選擇標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)和這些試驗的初步結(jié)果3’15。將從同意參加遺傳分析的患者收集的血液樣品貯存在羅氏臨床樣本庫(RocheClinical Sample repository)中。在羅氏臨床樣本庫中提取DNA并且將其歸一化至50ng/μ L0最初使用Y-染色體特異的TaqMan測定法(應(yīng)用生物系統(tǒng)，福斯特市，加利福尼亞州)進行樣品的質(zhì)量檢查以評估DNA質(zhì)量和性別與臨床數(shù)據(jù)的一致性。病毒學(xué)終點包括早期病毒學(xué)應(yīng)答(EVR)，其定義為從基線至12周的血清中檢測不到 HCV RNA (通過 Cobas Amplicor HCV 測試，ν2. 0，檢測極限 50IU/mL)或者血清 HCV RNA中彡2個對數(shù)的下降(通過CobasAmplicor HCV監(jiān)測器測試，v2. O,定量極限600IU/mL)，和持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(SVR)，其定義為在24周未治療的隨訪期結(jié)束時檢測不到HCV RNA 50IU/mL) ο在用于SVR的GWAS分析中，應(yīng)答者組由來自首次進行干擾素的研究群體的具有SVR的全部基因型-I的患者組成。非應(yīng)答者由以下組成1)來自聚乙二醇化干擾素治療再次攻擊的研究群體的全部基因型-I非SVR患者，2)來自用聚乙二醇化干擾素和利巴韋林治療的首次進行干擾素研究群體的基因型-I非SVR患者。
因此從我們的分析中排除了來自聚乙二醇化干擾素再次攻擊的研究群體的全部
應(yīng)答者。在用于EVR的GWAS分析中，EVR組由來自首次進行干擾素研究的群體的具有EVR的全部基因型-I的患者組成。非EVR組由下列組成I)來自聚乙二醇干擾素再次攻擊的患者群體的全部患者和2)來自首次進行治療的研究群體的用聚乙二醇化干擾素+利巴韋林治療的基因型-I非EVR患者。在非-基因型I患者中的自我報告的白種人中的IL28B區(qū)SNP進行了額外的探查分析，并且每次試驗分別進行分析(參見結(jié)果部分中的詳述)?；蛐蛿?shù)據(jù)分析使用HumanOmnil Quad(vl. O)芯片和 iScan 掃描儀在 Illumina Infillium * HD Assay Super上進行對樣品1，016，423種標(biāo)記的基因分型。對于平行測定樣品之間不一致的調(diào)用、過量的雜合性、低的調(diào)用率(〈O. 95)、聚類的分離、GenTrain得分、強度和聚類的寬度，執(zhí)行起始的質(zhì)量控制以清零SNPs?？偣?5個樣品不能通過起始的質(zhì)量檢查或者隨后的基因分型嘗試。在質(zhì)量控制之后，產(chǎn)生了具有基因型調(diào)用的1，002，139個SNPs。對于自我報告的白種人群體，計算了每個染色體的SNPs數(shù)目，等位基因頻率的分布和哈迪-溫伯格(Hardy Weinberg)平衡。統(tǒng)計分析在單變量的邏輯回歸模型中評估了在病毒學(xué)應(yīng)答(EVR或SVR)和基線變量(作為連續(xù)變量輸入的年齡、體重指數(shù)[BMI]、HCV RNA水平和ALT系數(shù)、以及作為分類變量輸入的性別、HCV基因型、組織學(xué)診斷[存在或者缺失肝硬化]和種族)之間的關(guān)聯(lián)。在調(diào)整基線BMI、性別、年齡、病毒載量，ALT系數(shù)和主成分分析(PCA)組分之后，使用邏輯回歸(PROC LOGISTIC, SAS v9. 2)檢驗個體SNPs和應(yīng)答/非應(yīng)答之間的關(guān)聯(lián)?；赑urcell等人16提出的PCA，使用整個群體(〃pgt〃)產(chǎn)生的家系數(shù)據(jù)集分析家系。用來自11個不同人種的受試者集合的HapMap III期創(chuàng)立者補充整個群體并且將其在 SAS JMP Genomics (SAS Institute Inc. , Cary, NC,美國)中分析。將 PCA 組分與或者不與異常值比較。限定異常值為與變異的前十個推斷軸中的一個上的平均值的至少6個標(biāo)準(zhǔn)差的家系的個體。在X和Y染色體上的或者在線粒體DNA中的SNPs與在HapMap三期創(chuàng)立者(發(fā)布號27)中未被基因分型的SNPs或者在已知的高度連鎖不平衡的區(qū)域(Chr5，44-51. 5Mb;Chr6, 24-36Mb; Chr8, 8-12Mb; ChrlI, 42_58Mb; Chr17, 40_43Mb)中的 SNPs 一起被除去。使用1000的窗口大小，r2〈0. 25和100的窗口偏移，用PLINK16使保留的SNPs變少。通過邏輯回歸分析檢驗病毒學(xué)應(yīng)答(EVR和SVR)和個體SNPs之間的關(guān)聯(lián)。對基線特征(BMI、性另I」、年齡、基線HCV RNA水平，ALT系數(shù)和PCA組分)進行調(diào)整。通過似然比檢驗(LRT)評估顯著性。如下限定空值模型病毒學(xué)應(yīng)答=BMI+性別+年齡+HCV RNA水平+ALT系數(shù)+PCA組分。在空值模型中假定SNPs的遺傳效應(yīng)是零。如下限定備選模型病毒學(xué)應(yīng)答=BMI+性別+年齡+HCV RNA水平+ALT系數(shù)+PCA組分+SNP。
使用LRT將每種備選模型(即具有SNPs)的最大似然估計值與相應(yīng)的空值模型(即沒有SNPs)的最大似然估計值比較，所述最大似然估計值具有卡方分布和等于不同參數(shù)的數(shù)目的自由度。將SNPs作為連續(xù)變量(0，I, 2)輸入該模型中。PCA組分代表分析的群體中的前5個組分。在自我報告的白種人群體和非-基因型I群體中運行相似的模型。在白種人的〃pgt〃群體的IL-28區(qū)中的顯著SNPs之間(p〈10_5)計算了連鎖不平衡(LD)。在Haploview v4. I17中用Gabriel等人18的方法推斷的LD區(qū)組產(chǎn)生了 r2的LD圖?？色@得總共406個首次進行治療的患者的樣品和以前對用聚乙二醇干擾素a -2b (12KD)治療的療程不應(yīng)答的426個患者的樣品。EVR的分析基于來自800個患者的數(shù)據(jù)，包括實現(xiàn)了 EVR的363個個體(45%)和沒有實現(xiàn)EVR的437個個體(55%)的數(shù)據(jù)。SVR的分析基于來自663個患者的數(shù)據(jù)，包括實現(xiàn)了 SVR的245個患者(37%)和沒有實現(xiàn)SVR的 418個患者(63%)的數(shù)據(jù)。在表I中顯示了 EVR和SVR的分析中包括的患者的基線特征?；蛞蛩氐膯巫兞窟壿嫽貧w模型顯示HCV基因型(p=l. 50xl0_25)、年齡(5. 80xl0_18)、ALT 系數(shù)(ρ=7· 50xl0_lcl)、種族(ρ=9· 20χ10_7)、BMI (ρ=4· 70χ10_5)和組織學(xué)診斷(ρ=1. 30χ10_5)與 EVR 顯著地相關(guān)，并且 HCV 基因型(ρ=4. 30χ10_27)、年齡(5. 50χ10_18)、ALT 系數(shù)(ρ=2· 10x10,、種族(ρ=2· IOxIO^8)、組織學(xué)診斷(ρ=5· 40χ1(Γ7)、ΒΜΙ (ρ=7· 20χ1(Γ6)和HCV RNA水平(ρ=0. 0022)與SVR顯著地相關(guān)。值得注意的，性別與EVR和SVR都不顯著地相關(guān)并且HCV RRA水平不與SVR顯著地相關(guān)。在整個基因型I群體中的GWAS結(jié)果由于高的親緣系數(shù)(指示高度的相關(guān)關(guān)系)，排除了用于基因型分析的總共4個樣品。分析來自基因型I的患者的數(shù)據(jù)，所述患者包括具有已知的EVR狀態(tài)的627個患者(215個應(yīng)答者[34. 3%]和412個非應(yīng)答者[65. 7%])和具有已知的SVR狀態(tài)的516個患者(128應(yīng)答者[24. 8%]和388個非應(yīng)答者[75. 2%])。通過圖I中的染色體呈現(xiàn)SVR和EVR的全基因組關(guān)聯(lián)結(jié)果。在19號染色體上的IL-28區(qū)中鑒定了一系列的高度顯著的P值。分位點一分位點圖顯示除了與19號染色體相關(guān)的P值的少數(shù)大的偏差，預(yù)期的P值和觀察的P值非常一致(圖2)。對SVR和EVR的邏輯回歸分析分別揭示了 12個和19個SNPs, ρ〈10_5 (表2)。與SVR和EVR分別相關(guān)的前6個SNPs，是相同的并且落入19號染色體的IL-28區(qū)內(nèi) O 對于 SVR 和 EVR,前兩種 SNPs 是 rsl2979860 (分別地，p=l. 4xl(T21 和 p=5. 0x10，和rsl2980275 (分別地，p=5. 8xl(T18 和 p=4. 9xl(T23)。剩余的 6 種 SNPs 與 SVR 相關(guān)(表 2)，不與EVR相關(guān)，均不位于19號染色體上，并且由于在罕見的純合子類型(ΒΒ〈10個個體)中觀察到了很小的數(shù)目，四種(rs943897，rs 17671102，rs4961441和rs 1892723)可能是假相關(guān)。剩余的13種SNPs與EVR相關(guān)(表2)，均不與EVR相關(guān)，只有一種(rs4803223)位于19號染色體上，并且兩種(rsl 189800和rs4975629)可能是假相關(guān)。在表3中顯不了用于全部群體和自我報告的白種人的亞群的對于SVR和EVR的任一模型具有P〈10_5的全部SNPs的邏輯回歸分析。在對rsl2979860的效應(yīng)調(diào)整之后，當(dāng)重復(fù)該分析時，沒有標(biāo)記與SVR顯著地相關(guān)，并且只有一種標(biāo)記與EVR顯著地相關(guān)(rs8099917, p=0. 0130)。
隨后在表3中呈現(xiàn)的IL-28區(qū)內(nèi)的SNPs之間的連鎖不平衡的研究顯示了具有高度的連鎖不平衡的一個聚類(在rs 12979860和rs 12980275之間，r2=0. 98)和由rsl2980275, rsl2979860, rs8109886 和 rs8099917 組成的下游的 SNPs 的第二個聚類(圖3)。在圖Ic中顯示了對rsl2979860調(diào)整后SVR的全基因結(jié)果。對rsl2979860調(diào)整后SVR的邏輯回歸分析結(jié)果和額外的非應(yīng)答者的包括揭示了具有p〈10_5的額外的10種SNPs (表4)。有趣地，5種最顯著的額外SNPs的中的三種(rsl0009948, rsl0023606和rs7673763)位于4號染色體上。奇怪的是，這些SNPs只與SVR相關(guān)，而不與EVR相關(guān)。在白種人的自我報告群體中rsl2979860的探杳分析為了更好地表征和理解IL28B之間的相關(guān)性，我們首先探查了自我報告的白種人群體中的非基因型I中的rsl2979860之間的關(guān)聯(lián)。使用與GWAS中相同的邏輯回歸模型，以5%標(biāo)稱的第一類誤差，可見SVR和rsl2979860C等位基因的數(shù)目之間臨界顯著的關(guān)聯(lián)(OR=L 88, 95%CI=
,p=0. 06)。相似地，可見 EVR和 rsl2979860C 等位基因的數(shù) 目之間的顯著的關(guān)聯(lián)(0R=2. 27, 95% CI[1. 12;4. 70]，ρ=0·02)。此外，我們分別描述了兩次試驗中的rsl2979860之間的相關(guān)。在首次進行治療的群體中，可見EVR和rsl2979860C等位基因之間的相關(guān)，OR接近5 (0R=4. 98 95%Cl [2. 35; 10. 53]，ρ=2· 6Χ10-5)。在全部三種治療層中總是可見相關(guān)性。在用聚乙二醇化干擾素治療失敗的患者群體中，發(fā)現(xiàn)與持續(xù)病毒應(yīng)答不相關(guān)。然而，當(dāng)比較 EVR(N=185)和非-EVR(N=154) (0R=1. 91 [I. 22; 2. 96]，p=0. 003)時，持續(xù)存在與rsl2979860的關(guān)聯(lián)(OR=L 91 [I. 22; 2. 96]，ρ=0· 003)。該關(guān)聯(lián)獨立于基線處的病毒載量、性另U、年齡、治療和ALT系數(shù)。根據(jù)本公開不用過多的實驗就可以制備和實施本文公開和要求保護的全部組合物和/或方法。盡管按照優(yōu)選的實施方案描述了本發(fā)明的組合物和方法，但是對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以將變型應(yīng)用于組合物和/或方法，以及本文描述的方法的步驟中或者步驟的順序中而不背離本發(fā)明的概念、精神和范圍。認(rèn)為對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的全部這些相似的替代和修改是在所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明的精神、范圍和概念內(nèi)。參考文獻(xiàn)I. Ghany MG, Strader DB, Thomas DL, Sccff LB. Diagnosis, management, andtreatment of hepatitis C An update. Hepatology 2009 ;49 :1335-1374.2. Manns MP, McHutchison JG, Gordon SC, Rustgi VK, Shiffman M, ReindollarR, Goodman ZD, Koury K, Ling M, Albrecht JK. Peginterferon alfa-2b plus ribavirincompared with interferon alfa-2b plus ribavirin for initial treatment ofchronic hepatitis C a randomised trial. Lancet 2001 ；358 :958-965.3. Fried MW，Shiffman ML, Reddy KR, Smith C, Marinos G, Goncales FL,Jr, Haussinger D, Diago M, Carosi G, Dhumeaux D, Craxi A, Lin A, Hoffman J, YuJ. Peginterferon alfa-2a plus ribavirin for chronic hepatitis C virus infection.N Engl J Med 2002；347 :975-982.4. Hadziyannis SJ, Sette H, Jr, Morgan TR, Balan V, Diago M, Marcellin P,Ramadori G，Bodenheimer H，Jr.，Bernstein D，Rizzetto M，Zeuzem S，Pockros PJ, LinAiAckrill AM. Peginterferon-alpha2a and ribavirin combination therapy in chronichepatitis C a randomized study of treatment duration and ribavirin dose. AnnIntern Mcd 2004 ； 140 :346-355.5. Conjeevaram HS，F(xiàn)ried MW，Jeffers LJ, Terrault NA，Wiley-Lucas TE，Afdhal N，Brown RSiBelle SHiHoofnagle JH，Kleiner DEiHowell CD. Peginterferon andribavirin treatment in African American and Caucasian American patients withhepatitis C genotype I.Gastroenterology 2006 ；131 :470-477.6.Dienstag JL，McHutchison JG. American Gastroenterological Associationtechnical review on the management of hepatitis C. Gastroenterology 2006 ；130 231-264.7. Missiha S，Hcathcotc J, Arenovich T，Khan K. Impact of asian race onresponse to combination therapy with peginterferon alfa_2a and ribavirin in chronic hepatitis C. Am J Gastroenterol 2007 ；102 :2181-2188.8. Reddy KR，Messinger D，Popescu M，Hadziyannis SJ. Peginterferonalpha_2a (40kDa)and ribavirin comparable rates of sustained virologicalresponse in sub-sets of older and younger HCV genotype I patients. J Viral Hepat2009;16 :724-731.9.Ferenci P，F(xiàn)ried MW，Shiffman ML, Smith Cl, Marinos G，Goncales FL, Jr.,Haussinger DiDiago M,Carosi GiDhumeaux D,Craxi A,Chaneac M,Reddy KR. Predictingsustained virological responses in chronic hepatitis C patients treated withpeginterferon alfa~2a(40KD)/ribavirin. J Hepatol 2005 ；43 :425-433.10. Martinot-Peignoux M，Maylin S, Moucari R，Ripault MP, Boyer N, CardosoAC， Giuily N， Castclnau C， Poutcau M， Stern C， Aupcrin A， Bcdossa P， Assclah T，Marccllin P. Virological response at 4 weeks to predict outcome of hepatitisC treatment with pegylated interferon and ribavirin. Antivir Ther 2009 ；14 501-511.11. Asselah T，Bieche I，Sabbagh A，Bedossa P，Moreau R，Valla D，VidaudM，Marcellin P. Gcne expression and hepatitis C virus infection. Gut 2009 ；58 846-858.12. Ge D，F(xiàn)ellay J，Thompson A J，Simon JS, Shianna KV, Urban TJ, HeinzenEL,Qiu P，Bertelsen AH,Muir AJj Sulkowski M，McHutchison JG，Goldstein DB. Geneticvariation in IL28B predicts hepatitis C trcatmcnt—induccd viral clcarancc.Nature 2009 ；461 :399-401.13. Suppiah V，Moldovan M，Ahlenstiel G，Berg T，Weltman M，Abate ML,Bassendine M， Spcnglcr U， Dore GJ, Powell E， Riordan S， Sheridan D， Smcdilc A，F(xiàn)ragomcli V,Muller T,Bahlo M，Stewart GJ,Booth DR,George J. IL28B is associatedwith response to chronic hepatitis C interferon—alpha and ribavirin therapy. NatGenet 2009 ；41 :1100-1104.
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權(quán)利要求
1.預(yù)測感染了HCV的人類受試者對干擾素治療的持續(xù)的病毒學(xué)應(yīng)答的方法，其包括 提供來自所述人類受試者的樣品，檢測4號染色體中的單核苷酸多態(tài)性的存在，并且如果存在所述的單核苷酸多態(tài)性，那么確定所述受試者具有對干擾素治療的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答的高可能性，其中所述的單核苷酸多態(tài)性選自由rsl0009948處的G、rsl0023606處的G和rs7673763處的T組成的組。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述受試者感染了基因型-1HCV。
3.權(quán)利要求1-2的方法，其中所述干擾素治療包括選自由聚こニ醇干擾素a_2a単一療法、聚こニ醇干擾素a-2a與利巴韋林,或者干擾素a-2b與利巴韋林組成的組的治療。
全文摘要
本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)在4號染色體上的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)和具有丙型肝炎病毒(HCV)的患者的多樣群體的病毒學(xué)結(jié)果之間存在關(guān)聯(lián)，所述患者接受了基于干擾素的治療。
文檔編號C12Q1/68GK102844448SQ201180018656
公開日2012年12月26日 申請日期2011年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月13日
發(fā)明者T·舒, L·埃塞奧克斯, S·杰默, U·洛帕汀, N·舒爾曼, J·托梅斯 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司