專利名稱：新的細胞外分泌型核酸酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的細胞外分泌型核酸酶、其制造方法及該制造方法中使用的新的鏈霉菌屬細菌。另外，本發(fā)明涉及使用該細胞外分泌型核酸酶的分解核酸的方法。
背景技術(shù)：
核酸酶(Nuclease)是特異性地分解核酸的核酸分解酶的總稱。使核酸酶作用于脫氧核糖核酸或核糖核酸等核酸時，核酸中的糖與磷酸之間的磷酸二酯鍵水解而生成核苷酸。核酸酶被分類為EC編號(Enzyme Commission numbers,酶學委員會編號)為EC.3.1的酯水解酶的一種。另外，核酸酶除了分類為分解RNA的核糖核酸酶和分解DNA的脫氧核糖核酸酶以外，還可以根據(jù)分解的方式進行分類。用于催化從序列中間的內(nèi)部(endo-)將核酸切斷的反應的酶稱為核酸內(nèi)切酶。作為代表性的核酸內(nèi)切酶，可以列舉各種限制性內(nèi)切酶。與此相對，用于催化以從核酸序列的外側(cè)(exo-)朝向內(nèi)部、從核酸的5’端或3’端進行切削的方式將核酸切斷的反應的酶稱為核酸外切酶。作為代表性的核酸外切酶，已知核酸外切酶III等。目前，核酸酶在從研究室規(guī)模至工業(yè)規(guī)模的多種多樣的場合中使用。例如，使用核酸酶時，可以利用其核酸分解活性使細胞提取液的粘性降低。因此，分離和純化細胞提取液中的蛋白質(zhì)及其他目標物質(zhì)時，如果使用核酸酶，則可以期待縮短工藝時間、提高目標物質(zhì)的收量、改善利用離心分離法的分級(顆粒與上清的分離性)、使溶液的過濾(特別是超濾)順暢、提高層析工藝的效率等。另外，如果在分離和純化核酸所非特異性吸附的病毒或包涵體等時使用核酸酶，則可以期待使它們的收率提高。此外，如果在用于分析生物試樣的ELISA、層析、2D-PAGE或足跡分析等樣品制備中使用核酸酶，則能夠避免不期望的由核酸引起的測定誤差。作為這樣的能夠在各種規(guī)模和場合下使用的核酸酶，已知來源于沙雷氏菌(Serratia spp.)的核酸內(nèi)切酶(分別參考作為專利文獻I和2的日本專利第2604365號說明書和美國專利第5173418號說明書，專利文獻I和2的記載作為公開的內(nèi)容特別援引于此)。沙雷氏菌屬微生物中，有作為機會感染菌而具有病原性的微生物。因此，專利文獻I中記載的核酸內(nèi)切酶利用基因重組技術(shù)使用大腸桿菌以分泌到細胞外的細胞外分泌型酶的形式制造。另外，專利文獻I中記載的來源于沙雷氏菌的核酸內(nèi)切酶以 >'/少一S (注冊商標)的商品名市售(參考作為非專利文獻I的“ O '/ f —七二二一々々工> K ^夕> 7 一七(> '/ f 一七獨特的核酸內(nèi)切酶)”、[online] ,2008年I月I日、々株式會社、[2010 年 7 月 30 日檢索]、 互聯(lián)網(wǎng) <URL:http://www2.merck.c0.jp/japan/chemical/pdf/info_pdf/071225_Ben zonase_16p.pdf>,非專利文獻I的記載作為公開的內(nèi)容特別援引于此)。作為非病原性微生物來源的核酸酶，已知放線菌的一種鏈霉菌屬細菌(Streptomyces spp.)產(chǎn)生的核酸酶(分別參考作為非專利文獻2 7的Biochem.J.1995306, 93-100 ；Biochem.J.1992 281, 231-237 ；Appl Microbiol Biotechnol.1995Nov;43(6):1056-1060 ；Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-General Subjects, Volumel721, Issuesl-3, 18January2005, 116-123 ；FEMS Microbiology Letters, Volume237, Issue2, 15August2004,273-278 和 Process Biochemistry Volume40,Issues3_4, March2005, 1271-1278，非專利文獻2 7的記載作為公開的內(nèi)容特別援引于此)。非專利文獻2和3中記載的核酸酶以細胞內(nèi)蓄積型酶的形式生產(chǎn)。與此相對，非專利文獻4 7中記載的核酸酶為分泌到細胞外的細胞外分泌型酶。現(xiàn)有技術(shù) 文獻專利文獻專利文獻1:日本專利第2604365號說明書專利文獻2:美國專利第5173418號說明書非專利文獻非專利文獻1:“<>'/ f 一七二二一夕々工 > K ^ ” > 7* —七 ”、[online] ,2008年I月I日、J卟夕株式會社、[2010年7月30日檢索]、互聯(lián)網(wǎng)<URL:http://www2.merck.c0.jp/japan/chemical/pdf/info_pdf/071225_Benzonase_16p.pdf>非專利文獻2:Santiago CAL, Jesus F.APARIC10, Clara G.DE LOSREYES-GAVILAN, Rebeca G.NICIEZA and Jesus SANCHEZ, Biochem.J.1995 306，93-100非專利文獻3:Jesus F.APARIC10, Carlos HARD ISSON and JesusSANCHEZ, Biochem.J.1992 281，231-237非專利文獻4:Vukelic B, Ritonja A, Vitale L., ApplMicrobiolBiotechnol.1995 年 11 月;43(6):1056-1060.
非專利文獻 5:Zuzana Brnakova, Andrej Godany and JozefTimko, Biochimicaet Biophysica Acta (BBA)-General Subjects, Volumel721, Issuesl-3, 2005 年 I 月 18日，116-123非專利文獻6:Sumedha S.Deshmukh and Vepatu Shankar, FEMS MicrobiologyLetters, Volume237, Issue2, 2004 年 8 月 15 日，273-278 頁非專利文獻7:Nitin S.Patil, Sumedha S.Deshmukh andVepatu Shankar, ProcessBiochemistry Volume40, Issues3_4, 2005 年 3 月，1271-1278 頁

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問題專利文獻I和2中記載的核酸酶以及非專利文獻I中記載的 > '/ t — 是使用非病原性微生物制造的核酸酶。但是，由于這些核酸酶利用基因重組大腸桿菌進行生產(chǎn)，因此，生產(chǎn)率低于來源微生物的生產(chǎn)率。因此，為了得到工業(yè)性規(guī)模的核酸酶，需要重復或延長生產(chǎn)步驟等，操作方面、經(jīng)濟方面和時間上的負擔的增大成為問題。因此，作為核酸酶的生產(chǎn)方法，期望不使用基因重組技術(shù)而使用天然的非病原性微生物進行生產(chǎn)。非專利文獻2和3中記載的核酸酶是蓄積在非病原性微生物體內(nèi)的細胞內(nèi)蓄積型酶。因此，為了得到這些核酸酶，必須將蓄積有核酸酶的微生物體破碎、接著從得到的微生物破碎物中分離純化核酸酶。因此，得到非專利文獻2和3中記載的核酸酶的工藝復雜，并且存在混入雜質(zhì)的可能性高的問題。與此相對，非專利文獻4 7中記載的核酸酶是分泌到非病原性微生物的體外的細胞外分泌型酶，不會引起制造上述的專利文獻I和2以及非專利文獻I 3中記載的核酸酶時產(chǎn)生的問題。但是，非專利文獻4 7中記載的核酸酶存在活性非常低這一共同的問題。如果將非專利文獻4 7中記載的核酸酶的比活性換算成非專利文獻I中記載的單位，則分別為 3.5X105U/mg 蛋白、9.7X 103U/mg 蛋白、1.3X 104U/mg 蛋白和 3.2X 104U/mg 蛋白，活性比非專利文獻I中記載的核酸酶低約3倍 約100倍。另外,非專利文獻4 和5中記載的核酸酶容易因NaCl而使酶活性受到抑制。非專利文獻4中記載的核酸酶在IOmM NaCl存在下的比活性與在非專利文獻4中記載的標準活性條件下的比活性相比為32%。非專利文獻5中記載的核酸酶在IOOmM NaCl存在下的比活性與在非專利文獻5中記載的標準活性條件下的比活性相比為40 50%。因此，將非專利文獻4和5中記載的核酸酶進行稀釋等時，不能使用一般廣泛使用的PBS等含有NaCl的緩沖液。另外，在借助微生物的培養(yǎng)而進行的產(chǎn)業(yè)性的制造工藝中，為了提高菌體濁度，一般使用含有IOOmM以上的一價金屬鹽的高營養(yǎng)的培養(yǎng)基來培養(yǎng)微生物。通過這樣的培養(yǎng)得到的培養(yǎng)液中的核酸可能在鹽濃度高的條件下實施分解。非專利文獻6和7中記載的核酸酶在以純化酶的形式利用EDTA進行透析時，完全喪失活性。為了恢復其活性，需要使用Mn2+，不能使用Mg2+等其他二價金屬離子來代替。錳鹽非常昂貴，且存在殘留毒性的危險。因此，由于比活性低、容易因NaCl而使酶活性受到抑制、酶活性所需的二價金屬離子限定于Mn2+等問題，非專利文獻4 7中記載的核酸酶未在工業(yè)性規(guī)模的核酸分解時使用。因此，本發(fā)明所要解決的第一問題在于提供由天然的非病原性微生物分泌到細胞外且比活性比現(xiàn)有核酸酶的比活性高、在工業(yè)性規(guī)模的核酸分解中有用的核酸酶。另外，本發(fā)明所要解決的第二問題在于提供由天然的非病原性微生物分泌到細胞外、NaCl對酶活性的影響小、并且在酶活性方面需要比錳廉價且毒性小的二價金屬離子、在工業(yè)性規(guī)模的核酸分解中有用的核酸酶。此外，本發(fā)明所要解決的另一問題在于提供制造上述核酸酶的方法及能夠供于該方法的非病原性微生物。 用于解決問題的手段本發(fā)明人反復 進行了深入研究，結(jié)果成功地從深海中分離出在培養(yǎng)液中分泌比活性高的核酸酶的微生物。接著對該微生物進行了鑒定，結(jié)果獲知其是作為放線菌之一的非病原性的鏈霉菌屬細菌，本發(fā)明人將該微生物命名為鏈霉菌(Sti^ptomyces sp.)MBE174。從鏈霉菌MBE174的培養(yǎng)液中分離和純化顯示核酸酶活性的蛋白質(zhì)級分，結(jié)果得到了以雙鏈DNA、單鏈DNA和RNA為底物且比活性比非專利文獻I中記載的 > '/ f 一七的比活性高的核酸酶(NucS)以及以雙鏈DNA和單鏈DNA為底物、能夠在高濃度的Na+存在下維持比活性、并且能夠需要比錳廉價且毒性小的鎂的核酸酶(NucL)這兩種核酸酶。上述NucS和NucL是隨著鏈霉菌MBE174的增殖在維持核酸酶活性的情況下分泌到培養(yǎng)液中的核酸酶。因此，鏈霉菌MBE174的培養(yǎng)液、該培養(yǎng)液的干燥物及簡單純化物能夠作為含有NucS和NucL這兩種核酸酶的粗酶而供于工業(yè)性規(guī)模的核酸分解，有用性高。本發(fā)明是基于上述發(fā)現(xiàn)而完成的發(fā)明。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供一種鏈霉菌屬細菌來源的細胞外分泌型核酸酶作為本發(fā)明的第一方式的核酸酶，其以雙鏈DNA、單鏈DNA和RNA為底物，并且純化后在含有ImMMgClJP ImM CaCl2、pH為8.5的20mM Tris/HCl中在37°C下供于雙鏈DNA30分鐘時的比活性與 > '/于一七(注冊商標)的比活性為同等程度或高于 > '/ f 一七' 的比活性。優(yōu)選利用SDS-PAGE法測定的分子量為17000 21000。優(yōu)選需要Mg2+或Mn2+作為二價金屬離子。優(yōu)選鏈霉菌屬細菌為鏈霉菌MBE174 (保藏編號:FERM P-21987)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種核酸酶作為本發(fā)明的第二方式的核酸酶，其中，包含:(1)序列表的序列號I中記載的氨基酸序列、(2)序列表的序列號I中記載的氨基酸序列中缺失、取代或添加一個至數(shù)個氨基酸后得到的氨基酸序列、或(3)與序列表的序列號I中記載的氨基酸序列具有90%以上的同源性的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種鏈霉菌屬細菌來源的細胞外分泌型核酸酶作為本發(fā)明的第三方式的核酸酶，其以雙鏈DNA和單鏈DNA為底物，并且在IOOmM Na+存在下的比活性為未添加Na+時的比活性的60%以上。優(yōu)選利用SDS-PAGE法測定的分子量為約66500。優(yōu)選需要Mg2+作為二價金屬離子。優(yōu)選鏈霉菌屬細菌為鏈霉菌MBE174 (保藏編號:FERM P-21987)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種核酸酶作為本發(fā)明的第四方式的核酸酶，其中，包含:(a)序列表的序列號2中記載的氨基酸序列、(b)序列表的序列號2中記載的氨基酸序列中缺失、取代或添加一個至數(shù)個氨基酸后得到的氨基酸序列、或(c)與序列表的序列號2中記載的氨基酸序列具有85%以上的同源性的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種粗酶，其中，含有本發(fā)明的第一或第二方式的核酸酶和/或本發(fā)明的第三或第四方式的核酸酶作為核酸酶活性成分。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種細胞外分泌型核酸酶的制造方法，其中，包括對鏈霉菌MBE174(保藏編號:FERM P-21987)進行培養(yǎng)而得到至少一種細胞外分泌型核酸酶的步驟。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種細胞外分泌型核酸酶或其粗酶，其通過本發(fā)明的制造方法得到。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供鏈霉菌MBE174(保藏編號:FERM P-21987)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種分解核酸的方法，其中，包括將本發(fā)明的第一或第二方式的核酸酶和/或本發(fā)明的第三或第四方式的核酸酶供于含有核酸的試樣而使所述核酸分解的步驟。優(yōu)選所述核酸為DNA。發(fā)明效果本發(fā)明的核酸酶是由一種作為天然的非病原性微生物的鏈霉菌屬細菌分泌到細胞外的核酸酶，因此，生產(chǎn)本發(fā)明的核酸酶的鏈霉菌屬細菌的培養(yǎng)液、該培養(yǎng)液的干燥物或粗純化物能夠作為粗酶使用。另外，本發(fā)明的核酸酶具有比活性比現(xiàn)有核酸酶的比活性高或即使在高鹽濃度存在下也會維持活性、并且所需的二價金屬離子為鎂的特征，因此，能夠供于工業(yè)性規(guī)模的核酸分解。本發(fā)明的兩種 核酸酶可以根據(jù)例如鹽濃度而分開使用。具體而言，在低鹽濃度的環(huán)境下，可以利用比活性大的一種酶(例如NucS)使DNA和RNA迅速分解，在高鹽濃度的環(huán)境下，可以期待利用另一種酶(例如NucL)進行DNA分解和RNA的蓄積。因此，如果準備含有本發(fā)明的兩種核酸酶的混合物，則能夠通過改變鹽濃度而實現(xiàn)期望的核酸的分解和蓄積。另外，本發(fā)明的在高鹽濃度的環(huán)境下維持活性的酶(例如NucL)能夠分解DNA而不分解RNA。發(fā)揮這種不分解RNA的特性，能夠?qū)⒗绫景l(fā)明的酶用于特異性制備RNA的方法。在使用本發(fā)明的核酸酶分離和純化細胞提取液中的蛋白質(zhì)及其他目標物質(zhì)的情況下，能夠期待縮短工藝時間、提高目標物質(zhì)的收量、改善利用離心分離法的分級(顆粒與上清的分離性)、使溶液的過濾(特別是超濾)順暢、提高層析工藝的效率、提高病毒或包涵體等的收率、避免ELISA、層析、2D-PAGE、足跡分析等的測定誤差等。


圖1是表示部分純化NucS的SDS-PAGE和活性染色的圖。圖2是表示純化NucL的SDS-PAGE和活性染色的圖。圖3是表示NucS的pH與活性的相關(guān)性的圖。圖4是表示NucL的pH與活性的相關(guān)性的圖。圖5是表示NucS和NucL的溫度與活性的相關(guān)性的圖。圖6是表示NucS和NucL的熱穩(wěn)定性試驗的結(jié)果的圖。圖7是表示一價鹽(NaCl)對NucL的酶活性的影響的圖。圖8是表示一價鹽(KCl)對NucL的酶活性的影響的圖。圖9是表示二價金屬鹽(MgCl2)對NucS和NucL的酶活性的影響的圖。圖10是表示二價金屬鹽(MnCl2)對NucS和NucL的酶活性的影響的圖。圖11是表示磷酸 鹽對NucL的酶活性的影響的圖。圖12是表示NucS、NucL和> '/ f 一七、使環(huán)狀質(zhì)粒DNA分解的模式的分析結(jié)果的圖。圖13是表示利用NucL得到的環(huán)狀質(zhì)粒DNA的分解結(jié)果的圖。
圖14是表示利用NucS對環(huán)狀質(zhì)粒DNA進行的分解反應初期的反應結(jié)果的圖。圖15是表示利用NucL對環(huán)狀質(zhì)粒DNA進行的分解反應初期的反應結(jié)果的圖。圖16是表示利用NucS得到的直鏈雙鏈DNA的分解結(jié)果的圖。圖17是表示利用NucL得到的直鏈雙鏈DNA的分解結(jié)果的圖。
具體實施例方式以下，對本發(fā) 明的詳細內(nèi)容進行說明。本發(fā)明的核酸酶涉及鏈霉菌屬細菌來源的細胞外分泌型核酸酶。本發(fā)明的核酸酶根據(jù)其性質(zhì)、功能和結(jié)構(gòu)分類為兩個酶組。以下，使用“核酸酶A”和“核酸酶B”的名稱對本發(fā)明的核酸酶進行說明。[I]本發(fā)明的核酸酶A本發(fā)明的核酸酶A涉及以雙鏈DNA例如超螺旋型和松弛型等的雙鏈DNA、單鏈DNA和RNA為底物的核酸酶。本發(fā)明的核酸酶A具有如下特征:純化后在含有ImM MgClJP ImMCaCl2, pH為8.5的20mM Tris/HCl中在37°C下供于雙鏈DNA30分鐘時的比活性與> '/于一七(注冊商標)的比活性為同等程度或高于 >'/于一七的比活性。本說明書中的> '/ f 一七' (注冊商標)”是指非專利文獻I中以“生物技術(shù)用^ ^ I級(99%) 250U/μ L”的產(chǎn)品名記載的、市售的核酸酶。后述的實施例所示的在含有 ImM MgCl2 和 ImM CaCl2, pH 為 8.5 的 20mM Tris/HCl 中在 37°C下供于雙鏈 DNA30分鐘時的 >'/于一七' (注冊商標)的比活性為9.4X105U/mg蛋白。關(guān)于本說明書中的“與 >'/f 一七' (注冊商標)的比活性為同等程度”，只要是與 > '/于一七的比活性近似的值則沒有特別限制，例如為> '/于一七的比活性的±10%以內(nèi)，優(yōu)選為±5%以內(nèi)，更優(yōu)選為±2%以內(nèi)。關(guān)于本說明書中的“高于>'/f 一
(注冊商標)的比活性”，只要高于 >'/于一七的比活性則沒有特別限制，例如為 >'/于一七' 的比活性的1.1倍以上，優(yōu)選為1.5倍以上，更優(yōu)選為2.0倍以上，進一步優(yōu)選為
2.5倍以上，更優(yōu)選為3.0倍以上。與《> '/ f 一七' 的比活性進行比較時，本發(fā)明的核酸酶A使用純化后的核酸酶A。本發(fā)明的核酸酶A的純化使用陰離子交換(SuperQ)、羥磷灰石、陽離子交換(CM瓊脂糖)、肝素親和層析和凝膠過濾層析進行純化。對于在作為本發(fā)明的優(yōu)選方式的后述的實施例中記載的NucS而言，純化后的比活性為3.6X106U/mg蛋白。與此相對，O'/于一七(注冊商標)的比活性為9.4X 105U/mg蛋白。因此，純化后的本發(fā)明的核酸酶A的比活性優(yōu)選為^ ^ f 一七的比活性的約3.8倍。本發(fā)明的核酸酶A的底物特異性通過如下方法測定:以雙鏈DNA、單鏈DNA、RNA等各種核酸為底物，在含有ImM MgCl2和ImM CaCl2、pH為8.5的20mM Tris/HCl中在37°C下供給30分鐘來考察這些底物的分解活性。本發(fā)明的核酸酶A只要是底物和比活性如上所述的核酸酶則沒有特別限制，優(yōu)選利用SDS-PAGE法測定的分子量為17000 21000，并且/或者需要Mg2+或Mn2+作為二價金屬離子。本發(fā)明的核酸酶A除了可以以上述的底物催化活性和比活性作為指標以外，還可以以分子量和二價金屬需要性等作為指標通過考察對鏈霉菌屬細菌、例如生存在深海(水面下200m以下的海)中的鏈霉菌屬細菌進行培養(yǎng)而得到的培養(yǎng)上清中的核酸酶活性的篩選法來分離。作為生存在深海中的鏈霉菌屬細菌，優(yōu)選為鏈霉菌MBE174。另外，該鏈霉菌MBE174在2010年7月27日以FERM P-21987的保藏編號保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所的專利生物保藏中心(郵政編碼305-8566，茨城縣筑波市東1-1-1筑波中心中央第6)。本發(fā)明 的核酸酶A的具體方式為包含下述氨基酸序列的核酸酶:(1)序列表的序列號I中記載的氨基酸序列、(2)序列表的序列號I中記載的氨基酸序列中缺失、取代或添加一個至數(shù)個氨基酸后得到的氨基酸序列或⑶與序列表的序列號I中記載的氨基酸序列具有90%以上的同源性的氨基酸序列。包含上述⑴序列表的序列號I中記載的氨基酸序列的核酸酶是利用SDS-PAGE法測定的分子量為17000 21000的酶組，具有ALPTPVSAATAR(序列表的序列號27)作為共有序列。序列表的序列號I是指以共有氨基酸序列ALPTPVSAATAR為N末端的起點、計算為17kDa的共有氨基酸序列(157個氨基酸)。本發(fā)明的核酸酶A的更具體的方式為后述的實施例中記載的NucS，其為由214個氨基酸(序列表的序列號3)構(gòu)成的核酸酶。關(guān)于上述(2)的氨基酸序列的“缺失、取代或添加一個至數(shù)個氨基酸”中的“一個至數(shù)個”的范圍，只要包含上述(2)的氨基酸序列的核酸酶的純化后的比活性在含有ImMMgClJP ImM CaCl2、pH為8.5的20mM Tris/HCl中在37°C下供于雙鏈DNA30分鐘的條件下與 >'/于一七(注冊商標)的比活性為同等程度或高于 >'/于一七的比活性的范圍則沒有特別限定，例如表示約I個至約20個，優(yōu)選為約I個至約10個，更優(yōu)選為約I個至約7個，進一步優(yōu)選為約I個至約5個，特別優(yōu)選為約I個至約3個。另外，“氨基酸的缺失”表示序列中的氨基酸殘基欠缺或消失，“氨基酸的取代”表示序列中的氨基酸殘基被取代成其他氨基酸殘基，“氨基酸的添加”表示序列中添加有新的氨基酸殘基。作為“缺失、取代或添加一個至數(shù)個氨基酸”的具體方式，有將一個至數(shù)個氨基酸利用在化學方面類似的其他氨基酸來取代的方式。例如，可以列舉:將某疏水性氨基酸取代成其他疏水性氨基酸的情況、將某極性氨基酸取代成具有相同電荷的其他極性氨基酸情況等。這種化學性質(zhì)類似的氨基酸對于每種氨基酸而言在該技術(shù)領(lǐng)域中是已知的。如果列舉具體例，則作為非極性(疏水性)氨基酸，可以列舉丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸等。作為極性(中性)氨基酸，可以列舉甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。作為帶有正電荷的(堿性)氨基酸，可以列舉精氨酸、組氨酸、賴氨酸等。另外，作為帶有負電荷的(酸性)氨基酸，可以列舉天冬氨酸、谷氨酸等。上述(3)的氨基 酸序列中的“同源性”是指包含上述(3)的氨基酸序列的核酸酶的純化后的比活性在含有ImM MgCl2和ImM CaCl2, pH為8.5的20mM Tris/HCl中在37°C下供于雙鏈DNA30分鐘的條件下與 >'/f 一七' (注冊商標)的比活性為同等程度或者為高于> '/ f 一七的比活性的范圍即90%以上，優(yōu)選為93%以上，更優(yōu)選為95%以上，進一步優(yōu)選為97%以上，更進一步優(yōu)選為99%以上。獲取本發(fā)明的核酸酶A的方法沒有限制，除了上述的篩選法以外，可以參考例如序列表的序列號I和3的記載通過物理化學方法來合成，也可以通過基因工程方法由編碼序列表的序列號I和3中記載的氨基酸序列的核酸來制作。
[2]本發(fā)明的核酸酶B本發(fā)明的核酸酶B涉及以雙鏈DNA例如超螺旋型和松弛型等的雙鏈DNA和單鏈DNA為底物且實質(zhì)上不以RNA為底物的核酸酶。本發(fā)明的核酸酶B具有如下特征:在IOOmM Na+存在下的比活性為未添加Na+時的比活性的60%以上，優(yōu)選為70%以上，更優(yōu)選為80%以上，進一步優(yōu)選為90%以上。Na+對本 發(fā)明的核酸酶B的比活性的影響可以通過如下方法來考察:在含有ImMMgCl2和O IOOmM NaCl、pH為8.5的IOmM Tris/HCl中，以0.4mg/mL來自于鮭魚精的脫氧核糖核酸鈉鹽(西格瑪奧德里奇公司制造，目錄號D1626-1G)為底物，在25°C下測定各NaCl濃度的核酸分解活性。本發(fā)明的核酸酶B的底物特異性可以與本發(fā)明的核酸酶A的底物特異性同樣地進
行考察。本發(fā)明的核酸酶B只要是底物和對Na+的穩(wěn)定性如上所述的核酸酶則沒有特別限制，優(yōu)選利用SDS-PAGE法測定的分子量為約66500并且/或者需要Mg2+作為二價金屬離子。本發(fā)明的核酸酶B除了可以以上述的底物催化活性和對Na+的穩(wěn)定性作為指標以外，還可以以分子量和二價金屬需要性等作為指標通過考察對鏈霉菌屬細菌、例如生存在深海(水面下200m以下的海)中的鏈霉菌屬細菌進行培養(yǎng)而得到的培養(yǎng)上清中的核酸酶活性的篩選法來分離。作為生存在深海中的鏈霉菌屬細菌，優(yōu)選為鏈霉菌MBE174(保藏編號:FERM P-21987)。本發(fā)明的核酸酶B的具體方式為包含下述序列的核酸酶:(a)序列表的序列號2中記載的氨基酸序列、(b)序列表的序列號2中記載的氨基酸序列中缺失、取代或添加一個至數(shù)個氨基酸后得到的氨基酸序列或(c)與序列表的序列號2中記載的氨基酸序列具有85%以上的同源性的氨基酸序列。包含上述(a)序列表的序列號2中記載的氨基酸序列的核酸酶是利用SDS-PAGE法測定的分子量為66500且N末端部不含信號肽的成熟蛋白質(zhì)(575個氨基酸)。本發(fā)明的核酸酶B的更具體的方式為后述的實施例中記載的NucL，其由607個氨基酸(序列表的序列號4)構(gòu)成,且N末端不含信號肽。關(guān)于上述(b)的氨基酸序列的“缺失、取代或添加一個至數(shù)個氨基酸”中的“一個至數(shù)個”的范圍，只要包含上述(b)的氨基酸序列的核酸酶在IOOmM Na+存在下的比活性為未添加Na+時的比活性的60%以上的范圍則沒有特別限定，例如表示約I個至約20個，優(yōu)選為約I個至約10個，更優(yōu)選為約I個至約7個，進一步優(yōu)選為約I個至約5個，特別優(yōu)選為約I個至約3個。另外，上述(b)的氨基酸序列中的“氨基酸的缺失”、“氨基酸的取代”和“氨基酸的添加”的含義以及“缺失、取代或添加一個至數(shù)個氨基酸”的具體方式與在作為本發(fā)明的核酸酶A的具體方式的(2)的氨基酸序列中說明過的同樣。上述(c)的氨基酸序列中的“同源性”是指包含上述(C)的氨基酸序列的核酸酶在IOOmM Na+存在下的比活性為未添加Na+時的比活性的60%以上的范圍即85%以上，優(yōu)選為88%以上，更優(yōu)選為90%以上，進一步優(yōu)選為95%以上，更進一步優(yōu)選為99%以上。獲取本發(fā)明的核酸酶B的方法沒有限制，除了上述的篩選法以外，例如可以參考序列表的序列號2和4的記載通過物理化學方法來合成，也可以通過基因工程方法由編碼序列表的序列號2和4中記載的氨基酸序列的核酸來制作。[3]本發(fā)明的粗酶本發(fā)明的粗酶含有本發(fā)明的核酸酶A、本發(fā)明的核酸酶B或這兩種核酸酶作為核酸酶活性成分。本發(fā)明的粗酶中，本發(fā)明的核酸酶A和核酸酶B的存在比沒有特別限制，可以根據(jù)作為底物的核酸的種類或濃度、給這些核酸酶的活性帶來影響的物質(zhì)的種類或濃度等適當選擇。本發(fā)明的粗酶 顯示出所含有的本發(fā)明的核酸酶A和/或核酸酶B的性質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的粗酶，例如，在低鹽濃度的環(huán)境下，可以期待利用比活性大的本發(fā)明的核酸酶A使DNA和RNA迅速分解，在高鹽濃度的環(huán)境下，可以期待利用本發(fā)明的核酸酶B進行DNA分解和RNA的蓄積。因此，根據(jù)本發(fā)明的粗酶，可以通過改變鹽濃度而實現(xiàn)期望的核酸的分解和蓄積。本發(fā)明的粗酶可以以對生產(chǎn)本發(fā)明的核酸酶A和核酸酶B的鏈霉菌屬細菌、優(yōu)選鏈霉菌MBE174 (保藏編號:FERM P-21987)進行培養(yǎng)而得到的培養(yǎng)物的形式來制造。[4]本發(fā)明的制造方法本發(fā)明的制造方法為包括對鏈霉菌MBE174(保藏編號:FERM P-21987)進行培養(yǎng)而得到至少一種細胞外分泌型核酸酶的步驟的細胞外分泌型核酸酶的制造方法。具體而言，本發(fā)明的制造方法為根據(jù)常規(guī)方法將鏈霉菌MBE174(保藏編號:FERM P-21987)接種到適當?shù)呐囵B(yǎng)基中后在適當?shù)臈l件下培養(yǎng)、并從所得到的培養(yǎng)物中采集細胞外分泌型核酸酶的細胞外分泌型核酸酶的制造方法。作為細胞外分泌型核酸酶，優(yōu)選本發(fā)明的核酸酶A和/或本發(fā)明的核酸酶B。本發(fā)明的制造方法大致包括:(a)對鏈霉菌MBE174 (保藏編號:FERM P-21987)進行培養(yǎng)而得到含有細胞外分泌型核酸酶的培養(yǎng)物的步驟和(b)從該培養(yǎng)物中得到細胞外分泌型核酸酶的步驟這兩個步驟。作為鏈霉菌MBE174(保藏編號:FERM P-21987)的培養(yǎng)中使用的營養(yǎng)培養(yǎng)基，可以廣泛使用作為鏈霉菌屬細菌用的培養(yǎng)基而已知的培養(yǎng)基，例如，除了可以使用YMA(酵母提取物-麥芽提取物瓊脂)培養(yǎng)基(酵母提取物4.0g/Ι、麥芽提取物10.0g/Ι、葡萄糖4.0g/1、瓊脂18.0g/l ；pH7.3)或白蛋白培養(yǎng)基(卵白蛋白0.25g/l、葡萄糖1.0g/l、K2HP04 0.5g/1、MgSO4.7Η200.2g/l、Fe2 (SO4) 31% 溶液 1ml、瓊脂 18.0g/1 ；pH6.8-7.0)等合成培養(yǎng)基以夕卜，還可以使用天然培養(yǎng)基，可以優(yōu)選使用酵母提取物4.0g/Ι、麥芽提取物10.0g/Ι、葡萄糖30.0g/Ι、多聚蛋白胨S50.0g/Ι、碳酸鈣6.0g/Ι ;未調(diào)節(jié)pH。但是，在直接將培養(yǎng)物作為粗酶使用的情況下，在培養(yǎng)基制備中要注意pH、一價鹽、二價金屬鹽、磷酸鹽以及其他影響酶活性的化合物的濃度。優(yōu)選根據(jù)期望的核酸酶活性來增減它們的濃度。作為培養(yǎng)法，優(yōu)選液體 培養(yǎng)法(振蕩培養(yǎng)法或通氣攪拌培養(yǎng)法)，工業(yè)上優(yōu)選通氣攪拌培養(yǎng)法。鏈霉菌MBE174(保藏編號:FERM P-21987)的培養(yǎng)通常在選自溫度20 45°C、優(yōu)選25 40°C、pH5 9、優(yōu)選6 8的條件下以需氧方式實施。培養(yǎng)時間只要是使鏈霉菌MBE174(保藏編號:FERM P-21987)開始增殖的時間以上的時間即可，優(yōu)選為8 120小時，進一步優(yōu)選為直到使期望的核酸酶活性達到最大值為止的時間。確認菌體增殖的方法沒有特別限制，例如，可以采集培養(yǎng)物并利用顯微鏡來觀察，也可以利用吸光度來觀察。另夕卜，培養(yǎng)液的溶解氧濃度沒有特別限制，通常優(yōu)選為0.5 20ppm。因此，可以調(diào)節(jié)通氣量、進行攪拌或在通氣中追加氧氣。培養(yǎng)方式可以是分批培養(yǎng)、流加培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)或灌流培養(yǎng)中的任何一種方式。從以上述方式培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物中采集細胞外分泌型核酸酶。細胞外分泌型核酸酶的采集法可以根據(jù)一般的酶采集方法來進行。例如，可以在通過固液分離等通常已知的方法除去細胞后，將培養(yǎng)上清作為粗酶使用。固液分離可以沒有限制地使用通常已知的方法，例如，采用直接將培養(yǎng)物本身進行離心分離的方法、通過向培養(yǎng)物中添加過濾助劑或利用預涂有過濾助劑的預涂過濾器等進行過濾分離的方法、使用平膜、中空絲膜等進行膜過濾分離的方法等。粗酶可以 直接使用，也可以純化后使用。例如，不限于在此列舉的方法，可以通過將熱處理等利用耐熱性的差的方法；透析、超濾、樹脂柱、凝膠過濾、凝膠過濾層析和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳等利用分子量的差的方法；鹽沉淀、硫酸銨沉淀、醇沉淀及其他溶劑沉淀等利用溶解性的差的方法；使用DEAE-T0Y0PEARL樹脂等的離子交換層析等利用電荷的差的方法；親和層析等利用特異性親和性的方法；使用丁基-T0Y0PEARL樹脂等的疏水層析和反相層析等利用疏水性的差的方法；吸附層析等利用物理化學上的吸附性的差的方法；等電點電泳和等電點層析等利用等電點的差的方法等通常已知的方法單獨或組合供于所得到的粗酶來制備工業(yè)用途的純化酶。也可以將粗酶及純化酶固定化。例如，可以采用與離子交換體結(jié)合的結(jié)合法、與樹脂和膜等的共價結(jié)合-吸附法、使用高分子物質(zhì)的包埋法等。利用本發(fā)明的制造方法得到的細胞外分泌型核酸酶或其粗酶作為本發(fā)明的另一方式提供。另外，本發(fā)明的制造方法中使用的鏈霉菌屬細菌即鏈霉菌MBE174(保藏編號:FERM P-21987)也作為本發(fā)明的另一方式提供。作為本發(fā)明的制造方法的另一方式，提供一種制造細胞外分泌型核酸酶的方法，其中，包括如下步驟:參考編碼本發(fā)明的核酸酶A的DNA的堿基序列例如序列表的序列號5中記載的堿基序列或編碼本發(fā)明的核酸酶B的DNA的堿基序列例如序列表的序列號6中記載的堿基序列，利用物理化學方法或基因工程方法合成編碼本發(fā)明的核酸酶A和核酸酶B的DNA片段，接著將合成的DNA片段重組到載體中，接著將重組有DNA片段的重組載體插入宿主細胞中而制作轉(zhuǎn)化體，并對該轉(zhuǎn)化體進行培養(yǎng)，由此得到細胞外分泌型核酸酶。[5]本發(fā)明的方法本發(fā)明的方法涉及一種分解核酸的方法，其中，包括向含有核酸的試樣中供給本發(fā)明的核酸酶A、本發(fā)明的核酸酶B或這兩種核酸酶而使所述核酸分解的步驟。本發(fā)明的核酸酶A和核酸酶B可以以固態(tài)或液態(tài)的粗酶和純化酶的形式使用。本發(fā)明的核酸酶A和核酸酶B也可以以利用通常已知的方法固定化的固定化酶的形式使用。作為含有核酸的試樣中的水性介質(zhì)，只要不妨礙核酸分解反應則沒有特別限制，可以列舉例如水、緩沖液等。作為緩沖液，采用例如醋酸緩沖液、磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、琥珀酸緩沖液、Tris鹽酸緩沖液等，由于本發(fā)明的核酸酶A存在因磷酸離子或鈉離子而產(chǎn)生活性抑制的可能性，因此優(yōu)選不含這些物質(zhì)的Tris鹽酸緩沖液等。本發(fā)明的核酸酶A和核酸酶B的使用量沒有特別限制，從核酸分解的效率和經(jīng)濟性的觀點出發(fā)，例如，本發(fā)明的核酸酶A的使用量相對于10 μ g核酸為I X 10_6 50U (單位)，優(yōu)選為I X IO-5 10U，更優(yōu)選為I X 10_4 1U，進一步優(yōu)選為I X 10_3 I X IO-1U ;本發(fā)明的核酸酶B的使用量相對于10 μ g核酸為I X 10_4 50U，優(yōu)選為I X 10_3 20U，更優(yōu)選為1X10_2 10U，進一步優(yōu)選為IXKT1 IU。核酸的濃度只要是能溶解于溶液的范圍則沒有特別限定。核酸分解 反應優(yōu)選在本發(fā)明的核酸酶A和核酸酶B具有活性且穩(wěn)定地維持活性的溫度附近、例如在25 35°C下實施。對于pH而言，優(yōu)選在本發(fā)明的核酸酶A和核酸酶B具有活性且穩(wěn)定地維持活性的條件下進行，例如在7.5 9.5下進行是適當?shù)?。在上述條件下觀察到充分的核酸分解的時刻結(jié)束反應，通常在I 100小時結(jié)束反應。核酸分解反應結(jié)束后，在含有核酸的試樣中含有目標物質(zhì)的情況下，對目標物質(zhì)進行分離純化，分別回收本發(fā)明的核酸酶A和核酸酶B。根據(jù)目標物質(zhì)和含有核酸的試樣的性質(zhì)，可以將反應液加熱至60 135°C、優(yōu)選65 100°C而使酶失活或者利用降低pH(添加鹽酸等酸)等適當?shù)姆椒ㄊ姑甘Щ疃Ｖ狗磻?。作為含有核酸的試樣，可以假定為含有雙鏈DNA、單鏈DNA、RNA等的試樣，優(yōu)選為含有能夠成為本發(fā)明的核酸酶A和核酸酶B中的任何一種酶的底物的雙鏈DNA和單鏈DNA等DNA的試樣。以下，利用實施例更詳細地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于這些實施例。實施例1.培養(yǎng)上清中存在的核酸分解酶的利用活性染色的檢測通過以對質(zhì)粒DNA的核酸分解活性為指標的篩選，分離出在培養(yǎng)上清中分泌高產(chǎn)核酸分解酶的深海來源的鏈霉菌MBE174(以下也稱為MBE174)。通過SDS-PAGE和以來自于鮭魚精的脫氧核糖核酸鈉鹽(西格瑪奧德里奇公司制造，目錄號D1626-1G)為底物的活性染色，可知本菌株在培養(yǎng)上清中生產(chǎn)的核酸分解酶為分子量約66.5kDa和在17 21kDa的低分子區(qū)域具有分布的多個蛋白質(zhì)。2.MBE174的分類學位置對MBE174的16S rRNA基因序列(1483個堿基對)進行了分析，結(jié)果與秋吉鏈霉菌(Streptomyces akiyoshiensis)NBRC12434T (AB184095) > 產(chǎn)綠色鏈霉菌(S.viridochromogenes)NBRC3113T(AB184728)、稀奇鏈霉菌(S.paradoxus)NBRC14887T(AB184628)、山丘鏈霉菌(S.collinus)NBRC12759T(AB184123)、灰黃鏈霉菌(S.griseoflavus)LMG19344T(AJ781322)有99%—致。由此判斷本菌株為鏈霉菌屬細菌。種水平上的鑒定需要進一步的分類學分析。3.低分子核酸分解酶核酸酶S的純化使用陰離子交 換(SuperQ)、羥磷灰石、陽離子交換(CM瓊脂糖)、肝素親和層析(參考圖1)、凝膠過濾層析對分子量約17 21kDa的低分子核酸分解酶(命名為核酸酶S，以下省略為NucS)進行純化。純化的概要示于表I中。[表 I]
權(quán)利要求
1.一種鏈霉菌屬細菌來源的細胞外分泌型核酸酶，其以雙鏈DNA、單鏈DNA和RNA為底物，并且純化后在含有ImM MgCl2和ImM CaCl2、pH為8.5的20mM Tris/HCl中在37°C下供于雙鏈DNA30分鐘時的比活性與 >'/f 一七' (注冊商標)的比活性為同等程度或高于 >'/f 一七的比活性。
2.如權(quán)利要求1所述 的核酸酶，其中，利用SDS-PAGE法測定的分子量為17000 21000。
3.如權(quán)利要求1所述的核酸酶，其中，需要Mg2+或Mn2+作為二價金屬離子。
4.如權(quán)利要求1所述的核酸酶，其中，鏈霉菌屬細菌是保藏編號為FERMP-21987的鏈霉菌(Streptomyces sp.)MBE174。
5.—種核酸酶，其中，包含: (1)序列表的序列號I中記載的氨基酸序列、 (2)序列表的序列號I中記載的氨基酸序列中缺失、取代或添加一個至數(shù)個氨基酸后得到的氨基酸序列、或 (3)與序列表的序列號I中記載的氨基酸序列具有90%以上的同源性的氨基酸序列。
6.一種鏈霉菌屬細菌來源的細胞外分泌型核酸酶，其以雙鏈DNA和單鏈DNA為底物，并且在IOOmM Na+存在下的比活性為未添加Na+時的比活性的60%以上。
7.如權(quán)利要求6所述的核酸酶，其中，利用SDS-PAGE法測定的分子量為約66500。
8.如權(quán)利要求6所述的核酸酶，其中，需要Mg2+作為二價金屬離子。
9.如權(quán)利要求6所述的核酸酶，其中，鏈霉菌屬細菌是保藏編號為FERMP-21987的鏈霉菌(Streptomyces sp.)MBE174。
10.一種核酸酶，其中，包含: (a)序列表的序列號2中記載的氨基酸序列、 (b)序列表的序列號2中記載的氨基酸序列中缺失、取代或添加一個至數(shù)個氨基酸后得到的氨基酸序列、或 (c)與序列表的序列號2中記載的氨基酸序列具有85%以上的同源性的氨基酸序列。
11.一種粗酶，其中，含有權(quán)利要求1 5中任一項所述的核酸酶和/或權(quán)利要求6 IO中任一項所述的核酸酶作為核酸酶活性成分。
12.—種細胞外分泌型核酸酶 的制造方法，其中，包括對保藏編號為FERM P-21987的鏈霉菌(Streptomyces sp.)MBE174進行培養(yǎng)而得到至少一種細胞外分泌型核酸酶的步驟。
13.一種細胞外分泌型核酸酶或其粗酶，其通過權(quán)利要求12所述的制造方法得到。
14.鏈霉菌(Sti^ptomycessp.)MBE174，其保藏編號為 FERMP-21987。
15.—種分解核酸的方法,其中,包括將權(quán)利要求1 5中任一項所述的核酸酶和/或權(quán)利要求6 10中任一項所述的核酸酶供于含有核酸的試樣而使所述核酸分解的步驟。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述核酸為DNA。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供由天然的非病原性微生物分泌到細胞外且比活性比現(xiàn)有核酸酶的比活性高、在工業(yè)性規(guī)模的核酸分解中有用的核酸酶。上述目的通過一種鏈霉菌屬細菌來源的細胞外分泌型核酸酶來實現(xiàn)，其以雙鏈DNA、單鏈DNA和RNA為底物，并且純化后在含有1mM MgCl2和1mM CaCl2、pH為8.5的20mM Tris/HCl中在37℃下供于雙鏈DNA30分鐘時的比活性與ベンゾナーゼ(注冊商標)的比活性為同等程度或高于ベンゾナーゼ的比活性。
文檔編號C12Q1/42GK103108950SQ20118004491
公開日2013年5月15日 申請日期2011年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月16日
發(fā)明者森梢, 大田優(yōu)佳莉, 秦田勇二, 中村信之, 宮崎征行 申請人:獨立行政法人海洋研究開發(fā)機構(gòu)