降鈣素原單克隆抗體對及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，特別是涉及降鈣素原(PCT)單克隆抗體對、其制備方法及其 在降鈣素原檢測中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 降鈣素原(PCT)是由116個氨基酸組成的激素原，是一種分子量約為13KD的糖蛋 白，在正常生理情況下，由甲狀腺C細(xì)胞分泌產(chǎn)生，在體內(nèi)半衰期為25~30個小時。PCT由神 經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞(包括甲狀腺、肺和胰腺組織的C細(xì)胞)表達(dá)，經(jīng)酶切分解為(未成熟）降鈣素、 羧基端肽和氨基端肽。健康人血液中的PCT濃度非常低，小于0.05ng/ml。在炎癥刺激特別是 細(xì)菌感染/膿毒血癥狀態(tài)下，機(jī)體各個組織、多種細(xì)胞類型均可產(chǎn)生PCT，并釋放進(jìn)入血液循 環(huán)系統(tǒng)。因此通過測量人體血清中PCT的含量，可以鑒別細(xì)菌感染程度。
[0003] 動物模型試驗顯示機(jī)體發(fā)生膿毒血癥時，多組織均能表達(dá)PCT。膿毒血癥患者體內(nèi) 的PCT只含有114個氨基酸，缺少氨基末端的Ala-Pro 1CT水平升高見于細(xì)菌性膿毒血癥，尤 其是重癥膿毒血癥和感染性休克。PCT可作為膿毒血癥的預(yù)后指標(biāo)，也是急性重癥胰腺炎及 其主要并發(fā)癥的可靠指標(biāo)。2012年9月發(fā)表的《降鈣素原PCT急診臨床應(yīng)用的專家共識》指 出：膿毒癥患者的PCT水平明顯高于非膿毒癥患者。且PCT升高對細(xì)菌感染導(dǎo)致的膿毒癥特 異性很高，可作為診斷膿毒癥和鑒別嚴(yán)重細(xì)菌感染的生物標(biāo)志物。同時，與單純的臨床檢測 標(biāo)準(zhǔn)相比，PCT檢測可顯著提高SIRS/膿毒癥診斷的敏感性(97% )和特異性(78% )。把PCT加 入診斷標(biāo)準(zhǔn)后，診斷準(zhǔn)確率從0.77提高到0.94。
[0004] 對于社區(qū)獲得性呼吸道感染和空調(diào)誘導(dǎo)性肺炎患者，PCT可作為抗生素選擇以及 療效判斷的指標(biāo)，因此發(fā)明降鈣素原(PCT)體外診斷試劑配對抗體原料對于臨床診斷具有 重大的社會價值和經(jīng)濟(jì)價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一對降鈣素原單克隆抗體對，它可以提高降 鈣素原體外檢測的準(zhǔn)確性。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的降鈣素原單克隆抗體對，包括檢測抗體和捕獲抗 體;所述檢測抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示； 所述捕獲抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.9 所示，輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 11所示。
[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供上述降鈣素原單克隆抗體對的制備方法。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的降鈣素原單克隆抗體對制備方法，步驟包括：
[0009] 1)制備降鈣素原重組抗原；
[0010] 2)制備小鼠降鈣素原單克隆抗體；
[0011] 3)高通量篩選降鈣素原單克隆檢測抗體和捕獲抗體對。
[0012] 較佳的，步驟1)，采用293F真核表達(dá)系統(tǒng)獲得降鈣素原重組抗原。
[0013] 較佳的，步驟3)，采用酶聯(lián)免疫化學(xué)發(fā)光檢測方法篩選降鈣素原單克隆抗體對。
[0014] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之三是提供上述單克隆抗體對在降鈣素原檢測中的應(yīng) 用。
[0015] 較佳的，可以采用酶聯(lián)免疫化學(xué)發(fā)光檢測方法進(jìn)行降鈣素原的檢測。
[0016] 本發(fā)明通過建立酶聯(lián)免疫化學(xué)發(fā)光檢測(ELISA)平臺，篩選降鈣素原最佳配對抗 體，這種篩選方法不僅減少了后期純化工作，而且提高了 PCT體外診斷試劑的產(chǎn)品質(zhì)量，用 篩選得到的降鈣素原最佳配對抗體對可以有效地體外檢測人體血清或血漿中的PCT含量， 提高細(xì)菌感染診斷的準(zhǔn)確性。
【附圖說明】
[0017] 圖1是蛋白純化結(jié)果圖。
[0018] 圖2是3只小鼠免疫血清檢測結(jié)果圖。
[0019] 圖3是陽性血清檢測二次亞克隆結(jié)果。其中，第一次稀釋倍數(shù)5倍，第二次稀釋倍數(shù) 10000倍，暴露時間3分鐘?？装錋-E排5個陽性PCT血清的濃度分別為:A:18.41ng/ml，B: 6 · 99ng/ml，C: 19 · 66ng/ml，D:0 · 829ng/ml，E: 1 · 5ng/ml?？装錐排為濃度0 ·82mg/ml的重組 PCT蛋白，G排為濃度100ng/ml的重組PCT蛋白，孔板Η排為PBS(磷酸鹽緩沖液）。
[0020] 圖4是l-d(l作為捕獲抗體，d作為檢測抗體)配對檢測結(jié)果。最低檢測限0.1ng/ml。 [0021 ]圖5是使用最佳配對抗體對的酶聯(lián)免疫ELISA檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實施方式】
[0022]為對本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、特點與功效有更具體的了解，現(xiàn)結(jié)合附圖及具體實施例， 對本發(fā)明詳述如下：
[0023] 實施例1
[0024] 一、PCT抗原設(shè)計和表達(dá)
[0025] 1.PCT抗原氨基酸序列（SEQ ID N0.1):
[0026] APFRSALESSPADPATLSEDEARLLLAALVQNYVQMKASELEQEQEREGSSLDSPRSKRCGNLSTCMLGTYTQDFNK FHTFPQTAIGVGAPGKKRDMSSDLERDHRPHVSMPQNAN
[0027] 堿基序列（SEQ ID NO.2):
[0028] GCTCCTTTCCGCAGCGCTCTCGAATCTAGCCCCGCCGACCCAGCTACACTGTCCGAGGACGAGGCTAGACTGCTGCT GGCCGCCCTGGTGCAGAACTATGTACAGATGAAGGCTTCTGAGCTGGAGCAGGAACAAGAGCGGGAGGGGTCGAGCC TCGACTCTCCTAGATCGAAGCGGTGCGGAAACCTGTCTACCTGTATGCTCGGAACATACACCCAGGACTTCAACAAG TTCCACACATTCCCTCAGACAGCTATTGGCGTGGGCGCTCCCGGCAAGAAGCGCGACATGTCTTCTGACTTAGAAAG AGACCACCGGCCTCACGTTTCCATGCCACAGAACGCCAAC
[0029] 2.表達(dá)系統(tǒng)
[0030] 采用293F真核系統(tǒng)表達(dá)。
[0031] HEK 293細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達(dá)的糖基化藥物蛋 白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面接近于天然蛋白分子。293F現(xiàn)已可采用無血清 懸浮培養(yǎng)，無血清懸浮培養(yǎng)是用已知人源或動物來源的蛋白或激素代替動物血清的一種細(xì) 胞培養(yǎng)方式，它能減少后期純化工作，提高產(chǎn)品質(zhì)量。
[0032] 3.質(zhì)粒構(gòu)建
[0033] 合成基因序列:包括5 '端EcoRI，3 '端Xhol酶切位點，N端添加 Kozak(GCCGCCACC)以 及CD33信號肽序列（ATGCCGCTGCTGCTACTGCTGCCCCTGCTGTGGGCAGGGGCGCTAGCT)，C端添加 His Tag序列（CATCATCACCATCACCAT)以及終止密碼（TGATAG)。并將此序列構(gòu)建至pcDNA4.0To myc HisA載體。合成的基因序列如下（SEQ ID N0.3):
[0034] gaattcGCCGCCACCATGCCGCTGCTGCTACTGCTGCCCCTGCTGTGGGCAGGGGCGCTAGCTGCTCCTTTCCGCAG CGCTCTCGAATCTAGCCCCGCCGACCCAGCTACACTGTCCGAGGACGAGGCTAGACTGCTGCTGGCCGCCCTGGTGC AGAACTATGTACAGATGAAGGCTTCTGAGCTGGAGCAGGAACAAGAGCGGGAGGGGTCGAGCCTCGACTCTCCTAGA TCGAAGCGGTGCGGAAACCTGTCTACCTGTATGCTCGGAACATACACCCAGGACTTCAACAAGTTCCACACATTCCC TCAGACAGCTATTGGCGTGGGCGCTCCCGGCAAGAAGCGCGACATGTCTTCTGACTTAGAAAGAGACCACCGGCCTC ACGTTTCCATGCCACAGAACGCCAACCATCATCACCATCACCATTGATAGctcgag
[0035] 4.質(zhì)粒提取、蛋白表達(dá)、蛋白純化與檢測
[0036]用真核表達(dá)載體大量提取無內(nèi)毒素質(zhì)粒(Max Extract)。將所提取的無內(nèi)毒素質(zhì) 粒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。收集細(xì)胞上清及細(xì)胞裂解液，采用Ni柱親和層析，收集樣品進(jìn)行SDS-PAGE Westernblot檢驗，濃度檢測，將合格樣品（純度>90%)透析至PBS(磷酸鹽緩沖液），并將蛋 白濃縮至>1 .〇mg/ml，蛋白純化結(jié)果如圖1所示。
[0037]二、免疫與采血
[0038] 1)選取3只BALB/c小鼠（雌性，6周齡以上)進(jìn)行免疫。
[0039] 2)第0周：免疫前，小鼠眼眶靜脈采血50μ1/只，37°C放置lh后，以5000rpm離心 5min，制備陰性血清，-20°C保存。進(jìn)行小鼠第一次免疫，抗原劑量為100yg/只，弗氏完全佐 劑(Sigma-F5881)，分多點皮下注射。
[0040] 3)第2周：小鼠第二次免疫，抗原劑量為50yg/只，不完全佐劑(Sigma-F5506)，注射 方式與劑量同初次免疫。
[0041 ] 4)第4周:小鼠第三次免疫，免疫劑量和免疫方法同第二次免疫。
[0042] 5)第5周：小鼠眼眶靜脈采血50μ1/只，37°C放置lh后，以5000rpm離心5min，制備血 清，進(jìn)行ELI SA檢測，檢測結(jié)果如圖2所示。剩余血清-20