專利名稱：硫酯酶及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
公開了編碼硫酯酶的核苷酸序列、產(chǎn)生它們的方法、它們?cè)谛纬闪蝓サ姆椒ㄖ械挠猛?。背景?duì)于干酪、蔬菜、肉和咖啡產(chǎn)品等而言，硫酯是重要調(diào)味化合物。特別有用的硫酯包括但不限于硫代丁酸甲酯(下文稱作“MTB”)、硫代乙酸甲酯(下文稱作“MTA”)和硫代丙酸甲酯(下文稱作“MTP”)?？梢院铣傻禺a(chǎn)生硫酯。然而，因?yàn)槭称汾厔?shì)和健康顧慮及福祉顧慮，對(duì)于從天然產(chǎn)物直接獲得或通過(guò)生物學(xué)過(guò)程產(chǎn)的調(diào)味化合物(如硫酯)存在特殊需要。這類化合物的一個(gè)特殊優(yōu)點(diǎn)是，可以將它們稱作“天然”的并且可能在消費(fèi)產(chǎn)品上這樣標(biāo)注。已知多種細(xì)菌在發(fā)酵期間產(chǎn)生硫酯。然而，這些現(xiàn)有過(guò)程的產(chǎn)量和產(chǎn)物比率難以影響。因此，將有益的是，開發(fā)更可預(yù)測(cè)和可能在經(jīng)濟(jì)上更有可行性的產(chǎn)生硫酯的方法，所述硫酯可能用于消費(fèi)產(chǎn)品中并且標(biāo)注為“天然的”。詳述申請(qǐng)人:現(xiàn)在已經(jīng)鑒定編碼硫酯酶的核苷酸序列。這項(xiàng)研究結(jié)果使這些核苷酸序列能夠用于以下方法中，其中所述方法能夠高效地產(chǎn)生可以添加至消費(fèi)產(chǎn)品并標(biāo)記為“天然”的硫酯。另外，這些核苷酸序列可以用于鑒定能夠形成硫酯的其他野生型細(xì)菌的篩選方法中。根據(jù)第一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案，提供了編碼具有硫酯酶活性的酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公開的核苷酸序列或其功能等同物。不限于并且僅以說(shuō)明的方式，這些核酸可以從屬于短桿菌屬(Brevibacterium)家族的細(xì)菌分離。根據(jù)某些實(shí)施方案，這些核酸可以從屬于擴(kuò)展短桿菌(Brevibacteriumlinens)物種的細(xì)菌分離，一個(gè)非限制性實(shí)例是美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(下文稱作ATCC)菌株 9174 (BL2)。核苷酸序列的功能等同物包括這些核苷酸序列，其因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而擁有與本文中公開的那些核苷酸序列不同的核苷酸序列，但是編碼具有相同活性的相同氨基酸序列。功能等同物包括本文所述序列的天然存在變體以及合成核苷酸序列，例如，通過(guò)化學(xué)合成或天然存在的DNA重組所獲得的那些核苷酸序列。功能等同物可以是天然或合成性置換、添加、缺失、替換或插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸的結(jié)果。功能等同物的實(shí)例包括這些核酸序列，它們包含因不導(dǎo)致多肽活性的改變并因此可以在功能上視為中性的至少一個(gè)保守氨基酸置換而產(chǎn)生的有義突變。提供功能相似氨基酸的保守性置換表是本領(lǐng)域熟知的。例如，選擇保守性置換的一個(gè)示例性指導(dǎo)包括(原始?xì)埢S示例性置換):ala/gly或ser ；arg/lys ；asn/gln或his ;asp/glu ；cys/ser ；gln/asn ；gly/asp ；gly/ala 或 pro ；his/asn 或 gin ；ile/leu 或val ；leu/ile 或 val ；lys/arg 或 gin 或 glu ；met/leu 或 tyr 或 ile ；phe/met 或 leu 或 tyr ；ser/thr ；thr/ser ；trp/tyr ;tyr/trp 或 phe ;val/ile 或 leu。替代的示例性指導(dǎo)使用以下6個(gè)組，每個(gè)組含有彼此互為保守性置換的氨基酸:1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸⑴；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E) ；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)、賴氨酸(I)；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V);和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。另一個(gè)的示例性指導(dǎo)是允許全部帶電荷的氨基酸彼此作為保守性置換，無(wú)論它們是否帶正電荷或帶負(fù)電荷。在編碼序列中改變、添加或缺失單個(gè)氨基酸或小百分比(例如至多到26%、至多到20%、至多到10%或至多到5%)的氨基酸的單個(gè)置換、缺失或添加還視為功能等同物。功能等同物的其他非限制性的實(shí)例包括片段、直向同源物、剪接變體、單核苷酸多態(tài)性和等位變體。這類功能等同物將與本文中公開的核苷酸序列具有60%、75%、80%、90%、95%或更大的同源性。核苷酸序列同源性可以通過(guò)序列同一性或通過(guò)雜交確定。序列同一性可以使用基本局部比對(duì)搜索工具技術(shù)(下文稱作BLAST)確定。BLAST技術(shù)是由可在http://www.ncb1.nlm.nih.gov獲得的程序blastn使用的啟發(fā)式檢索算法。如果通過(guò)雜交確定同源性，則應(yīng)當(dāng)將這些核苷酸序列視為基本上同源的，前提是它們能夠選擇性地雜交至本文中公開的核苷酸序列。雜交應(yīng)當(dāng)在嚴(yán)格雜交條件下在42° C的溫度在由50%甲酰胺、5x標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鈉(下文稱作SSC)和1%十二烷基硫酸鈉(下文稱作SDS)組成的溶液中實(shí)施。洗滌可以在65° C在0.2xSSC和0.1%SDS的溶液中實(shí)施。背景雜交可能因?yàn)槠渌塑账嵝蛄写嬖谟诶鏲DNA中而發(fā)生。小于隨靶DNA所觀察到的特異性相互作用的強(qiáng)度10倍的任何信號(hào)應(yīng)當(dāng)視為背景?？梢詼y(cè)量相互作用的強(qiáng)度，例如，通過(guò)將探針例如用32P進(jìn)行放射標(biāo)記。核苷酸序列也可以包含以下項(xiàng)中的一個(gè)或多個(gè):合適的5’非翻譯區(qū)、能夠?qū)崿F(xiàn)在適宜的宿主細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子、合適的3’非翻譯區(qū)、終止密碼子和標(biāo)簽。標(biāo)簽的非限制性實(shí)例包括但不限于膜輸出標(biāo)簽和用于硫酯酶檢測(cè)的標(biāo)簽，包括但不限于His標(biāo)簽、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽(GST)。5’非翻譯區(qū)可以包含影響轉(zhuǎn)錄或翻譯效率的其他操縱基因或基序。3’非翻譯區(qū)可以包含其他信號(hào)如用于轉(zhuǎn)錄性終止的信號(hào)。影響轉(zhuǎn)錄或翻譯的操縱基因或基序的非限制性實(shí)例包括但不限于使轉(zhuǎn)錄物高效多聚腺苷酸化所需的信號(hào)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、識(shí)別位點(diǎn)例如EcoRl。根據(jù)所討論的宿主細(xì)胞和所需的結(jié)果，選擇合適的5’和3’非翻譯區(qū)、標(biāo)簽、終止密碼子和影響轉(zhuǎn)錄或翻譯的操縱基因或基序完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。在本文所包括的實(shí)施例中給出非限制性實(shí)例。在SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公開的核苷酸序列或其功能等同物可以用來(lái)產(chǎn)生包含SEQ.1D.N0.2、4、6和8中所公開的氨基酸序列或其功能等同物的硫酯酶。可以通過(guò)充分建立的克隆技術(shù)實(shí)現(xiàn)具有硫酯酶活性的酶的表達(dá)，其中所述酶包含SEQ.1D.N0.2、4、6和8中所公開的氨基酸序列或其功能等同物中的一個(gè)或多個(gè)。
根據(jù)另一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案，提供了用SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公開的核苷酸序列或其功能等同物中的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。這類宿主細(xì)胞能夠表達(dá)具有硫酯酶活性的酶，其中所述酶包含SEQ.1D.N0.2、4、6和8中所公開的氨基酸序列或其功能等同物中的一個(gè)或多個(gè)。合適的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物源的原核生物和真核細(xì)胞。根據(jù)一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案，細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞或真菌細(xì)胞。在另一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案中，細(xì)胞選自以下一種或多種:大腸桿菌(Escherichiacoli)、短桿菌屬(Brevibacterium)、棒狀桿菌屬(Cornynebacterium)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、諾卡菌屬(Nocardia)、甲基桿菌屬(Methylobacteri)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、片球菌屬(Pediococcus)、酒球菌屬(Oenococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、魏斯氏菌屬(Weisella)、肉食桿菌屬(Carnobacterium)和四體球菌屬(Tetragenococcus)。丙酸桿菌屬物種(Proprionibacterium sp.)、雙歧桿菌屬某些物種(Bifidobacterium spp.)、腸球菌屬某些物種(Enterococcus spp.)、谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、節(jié)桿菌屬物種(Arthrobacter sp.)、藤黃微球菌(Micrococcus Iuteus)和馬胃葡萄球菌(Staphylococcus equorum)。白地霉(Geotrichumcandidum)、解脂耶羅維亞酵母(Yarrowia Iipolytica)、乳酸克魯維酵母(KluyveromycesIactis)、漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。如本領(lǐng)域熟知，宿主細(xì)胞可以用核苷酸序列或其功能等同物瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染?？梢允褂脤⒑塑账嵝蛄袑?dǎo)入宿主細(xì)胞的任何已知方法。僅需要所用的具體基因工程方法能夠成功地將所需的核苷酸序列或其功能等同物導(dǎo)入能夠表達(dá)所需的氨基酸序列或其功能等同物的宿主細(xì)胞中。這些方法可以包括將克隆的基因組DNA、cDNA、合成性DNA或其他外來(lái)遺傳物質(zhì)導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，并且包括使用磷酸I丐轉(zhuǎn)染法、polybrene (溴化己二甲胺)、原生質(zhì)體融合、電穿孔、脂質(zhì)體、微量注射、表達(dá)載體等。包含SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公開的至少一個(gè)核酸序列或其功能等同物的表達(dá)載體，作為獨(dú)立表達(dá)載體或作為表達(dá)載體文庫(kù)表達(dá)載體，均可以通過(guò)多種常規(guī)技術(shù)導(dǎo)入細(xì)胞的基因組、細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞的胞核中并且在其中表達(dá)。選擇合適的技術(shù)完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。根據(jù)一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案,表達(dá)載體可以用來(lái)用SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公開的核苷酸序列或其功能等同物轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了包含SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公開的核苷酸序列或其功能等同物的載體?？梢允褂萌魏芜m合的表達(dá)載體。載體類型的非限制性實(shí)例包括噬菌體、質(zhì)粒或粘粒DNA表達(dá)載體；病毒表達(dá)載體或細(xì)菌表達(dá)載體。根據(jù)所討論的宿主細(xì)胞和所需的結(jié)果，選擇合適的表達(dá)載體完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。在一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案中，載體選自pBL、pET-22b(+)、Pgem-5z、pGIVl。在轉(zhuǎn)染后，可以使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
技術(shù)人員將顯而易見，不同的細(xì)胞需要不同的培養(yǎng)條件，包括適宜的溫度和細(xì)胞培養(yǎng)基。根據(jù)所討論的宿主細(xì)胞和所需的最終結(jié)果，決定培養(yǎng)條件完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。在另一個(gè)方面，提供了產(chǎn)生具有硫酯酶活性的酶的方法，所述酶包含SEQ.1D.N0.2、4、6和8中所公開的氨基酸序列或其功能等同物中的一個(gè)或多個(gè)，所述方法包括將包含SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公開的核苷酸序列或其功能等同物的核苷酸序列插入載體中；用所述載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并在合適的培養(yǎng)基中培育轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。如上文所述，技術(shù)人員將顯而易見，不同的細(xì)胞需要不同的培養(yǎng)條件，包括適宜的溫度和細(xì)胞培養(yǎng)基。根據(jù)所討論的宿主細(xì)胞和所需的最終結(jié)果，決定培養(yǎng)條件完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。關(guān)于某些細(xì)胞的適宜培養(yǎng)基和條件的信息，可以在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)網(wǎng)站:http: //www.lgcstandards-atcc.0rg/Home/tab id/477/Default, aspx 上找至 l|。在一個(gè)具體的說(shuō)明性實(shí)施方案中，所用的細(xì)胞是短桿菌細(xì)胞、棒狀桿菌細(xì)胞或大腸桿菌細(xì)胞并且培養(yǎng)基是基于乳制品或乳清的。在另一個(gè)具體的說(shuō)明性實(shí)施方案中，所用的細(xì)胞是短桿菌細(xì)胞、棒狀桿菌細(xì)胞或大腸桿菌細(xì)胞并且培養(yǎng)基選自胰酪胨-大豆、deMan-Rogosa-Sharpe (MRS)、Elliker' s>M17、營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液或LB培養(yǎng)基。細(xì)胞在37° C孵育過(guò)夜。為了增加硫酯酶的產(chǎn)量，SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公開的核苷酸序列或其功能等同物可以通過(guò)將它們置于強(qiáng)組成型啟動(dòng)子控制下進(jìn)行過(guò)量表達(dá)。根據(jù)所討論的宿主細(xì)胞和所討論的載體，選擇合適的組成型啟動(dòng)子完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。如果需要包含SEQ.1D.N0.2、4、6和8中所公開的氨基酸序列或其功能等同物的硫酯酶，則可以使用本領(lǐng)域熟知的方法從培養(yǎng)基分離。包含SEQ.1D.N0.2、4、6和8中所公開的氨基酸序列或其功能等同物中至少之一的分離的硫酯酶或包含SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公開的核苷酸序列或其功能等同物中至少之一的轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞可以用來(lái)產(chǎn)生硫酯。在另一個(gè)方面，提供包括一種產(chǎn)生硫酯的方法，包括使包含SEQ.1D.N0.2、4、6和8中所公開的至少一個(gè)氨基酸序列或其功能等同物的至少一種硫酯酶和/或包含SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公開的至少一個(gè)核苷酸序列或其功能等同物的至少一種宿主細(xì)胞與至少一種合適的底物接觸，孵育所述混合物，分離含有硫酯的粗產(chǎn)物并且純化所述粗產(chǎn)物以便僅獲得硫酯。孵育可以在20°C至40°C的溫度，以4至9的pH實(shí)施范圍從I至100小時(shí)的時(shí)間。在一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案中，孵育可以在25°C至38°C的溫度，以6至8的pH實(shí)施范圍從I至72小時(shí)的時(shí)間。短鏈脂肪酸輔酶A衍生物已經(jīng)由申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)是包含SEQ.1D.N0.2、4、6和8中所公開的至少一個(gè)氨基酸序列或其功能等同物的硫酯酶的合適底物。在一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案中，合適的底物包含短鏈脂肪酸輔酶A(SCFA-CoA)。在另一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案中，合適的底物包括Cl-C8SCFA_CoA。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞和/或酶可以在運(yùn)動(dòng)或固定的形式下使用。在一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案中，這種酶和/或宿主細(xì)胞以固定的形式使用。任何純化技術(shù)可以用來(lái)純化粗產(chǎn)物并且決定采用這樣的技術(shù)完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍。純化技術(shù)的非限制性實(shí)例包括:親和純化、離心、層析。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供通過(guò)如本文所述的方法可獲得或產(chǎn)生的硫酯。在另一個(gè)方面提供一種用于產(chǎn)生硫酯的試劑盒，所述試劑盒包括至少一種硫酯酶和/或至少一種宿主細(xì)胞，所述硫酯酶包含SEQ.1D.N0.2、4、6和8中所公開的至少一個(gè)氨基酸序列或其功能等同物，所述宿主細(xì)胞包含SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公開的至少一個(gè)核苷酸序列或其功能等同物，和至少一種合適的底物。這種試劑盒可以用來(lái)實(shí)施如本文所公開的用于產(chǎn)生硫酯的方法。在一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案中，合適的底物包含短鏈脂肪酸輔酶A(SCFA-CoA)。在另一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案中，合適的底物包括Cl-C8SCFA_CoA。Cl-C8SCFA-CoA 底物可以按 0.01 μ Μ-500 μ Μ、0.01 μ Μ-200 μ Μ、0.01 μ Μ-50 μ M 的濃度提供。已知干酪中存在的硫酯的量和比率影響其風(fēng)味。硫酯由干酪中存在的微生物在其制造和成熟期間產(chǎn)生。經(jīng)常將這些微生物添加至干酪作為起子培養(yǎng)物。在另一個(gè)方面，提供一種對(duì)干酪調(diào)味的方法，其包括在干酪制造過(guò)程期間向其添加至少一種硫酯酶和/或至少一種宿主細(xì)胞，所述硫酯酶包含在序列ID編號(hào)2、4、6和8中所公開的至少一個(gè)氨基酸序列或其功能等同物，所述宿主細(xì)胞包含在序列ID編號(hào)1、3、5和7中所公開的至少一個(gè)核苷酸序列或其功能等同物。在一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案中，將硫酯酶和/或宿主細(xì)胞作為起子培養(yǎng)物的部分添加。在另一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案中，將硫酯酶和/或宿主細(xì)胞作為添加至乳的起子培養(yǎng)物的部分添加。在另一個(gè)方面，提供根據(jù)本文以上限定的方法可獲得或產(chǎn)生的干酪產(chǎn)品。在SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公開的核苷酸序列或其功能等同物可以用來(lái)篩選和鑒定野生型生物，其中所述野生型生物含有編碼硫酯酶的基因，所述硫酯酶由SEQ.1D.N0.2、4、6和8中所公開的氨基酸序列或其功能等同物編碼。在另一個(gè)方面提供在SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公開的核苷酸序列或其功能等同物作為篩選方法中標(biāo)記的用途，其中所述方法篩選能夠產(chǎn)生硫酯酶的野生型生物，所述硫酯酶由SEQ.1D.N0.2、4、6和8中所公開的氨基酸序列或其功能等同物編碼。在另一個(gè)方面提供一種鑒定能夠產(chǎn)生硫酯酶的生物的方法，所述硫酯酶由SEQ.1D.N0.2、4、6和8中所公開的氨基酸序列或其功能等同物編碼，所述方法包括使用SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公開的核苷酸序列或其功能等同物作為篩選方法中的標(biāo)記。這種方法中鑒定的生物可以是任何原核和真核生物。在一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案中，生物是野生型生物?？梢允褂萌魏我阎暮Y選方法。熟知篩選方法的實(shí)例包括但不限于，計(jì)算機(jī)驅(qū)動(dòng)的公共序列數(shù)據(jù)庫(kù)的核苷酸或蛋白質(zhì)同源性檢索法、通過(guò)高通量測(cè)序的核苷酸篩選法和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)篩選。
可以分離和純化通過(guò)本文中公開的方法形成的硫酯用作許多組合物和消費(fèi)產(chǎn)品中的調(diào)味化合物。在另一個(gè)方面，提供了包含通過(guò)本文中所述的方法所獲得或產(chǎn)生的至少一種硫酯的組合物。在另一個(gè)方面提供一種產(chǎn)生或調(diào)節(jié)組合物的風(fēng)味的方法，所述方法包括向所述組合物添加如本文中公開那樣所形成的至少一種硫酯。這些硫酯可以在凈形式下或在溶劑中存在或添加至組合物中，或它們可以首先例如通過(guò)用包埋材料(例如聚合物、膠囊、微膠囊、納米膠囊、脂質(zhì)體、前體、成膜物質(zhì)、吸收劑)，例如通過(guò)使用碳沸石、環(huán)狀寡糖及其混合物包埋加以修飾，或它們可以與適合在施加外源刺激如光、酶等時(shí)釋放硫酯的基材化學(xué)地結(jié)合。一個(gè)類型的硫酯可以是組合物的單一調(diào)味組分?？蛇x地，可以組合使用多個(gè)類型的硫酷。組合物可以額外地包含其他調(diào)味成分和賦形劑，例如香料組合物中常規(guī)使用的載體材料。所述其他調(diào)味成分包括但不限于天然香料、人工香料、香辛料、調(diào)料等。示例性調(diào)味成分包括合成香料油和調(diào)味芳香物質(zhì)和/或油、油樹脂(oleoresin)、精油、源自植物、葉、花、果實(shí)等的餾出液和提取物和包含前述至少一種的組合。其他調(diào)味成分的其他實(shí)施例可以在National Academy of Sciences, "ChemicalsUsed in Food Processing(食品加工中的化學(xué)品)〃，1274出版,第63-258頁(yè)中找到。香料組合物中常規(guī)使用的所述賦形劑包括但不限于溶劑(包括水、醇、乙醇、油、脂肪、植物油和miglyol)、粘合劑、稀釋劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、增味劑、著色劑、防腐劑、抗氧化齊U、乳化劑、穩(wěn)定劑、風(fēng)味增進(jìn)劑(flavour-enhancer)、抗結(jié)塊劑等。香料組合物中常規(guī)使用的調(diào)味成分和賦形劑的其他實(shí)施例可以在“Perfume andFlavour Materials of Natural Origin (天然來(lái)源的香料和香料物質(zhì))”，S.Arctander編著，Elizabeth, N.J.，1960 ;引自 “Perfume and Flavour Chemicals (香料和香料化學(xué)品)，，，S.Arctander 編著，第 I 和第 II 卷，Allured Publishing Corporation, CarolStream, USA, 1994 ；引 自 “Flavourings (香料)”，E.Ziegler 和 H.Ziegler (編著)，Wiley-VCHWeinheim, 1998 和 “CTFA Cosmetic Ingredient Handbook (CTFA 化妝品成分手冊(cè))，，，J.Μ.Nikitakis (編著)，第 I 版，The Cosmetic, Toiletry and FragranceAssociation (美國(guó)化妝品與香料協(xié)會(huì))，Inc., Washington, 1988.中找到。香料組合物的其他合適且合乎需要的成分在標(biāo)準(zhǔn)文件如“Handbook ofIndustrial Chemical Additives (工業(yè)化學(xué)品添加物手冊(cè))”，M.和 1.Ash,第 2版，(Synapse 2000)中描述。如本文中公開那樣形成的硫酯可以在組合物中以至多到100%的濃度使用。根據(jù)某些實(shí)施方案，硫酯可以以范圍約0.01%至約99%的濃度包含在組合物中。根據(jù)其他實(shí)施方案，硫酯可以以范圍約1%至約99%的濃度包含在組合物中。在另一個(gè)方面，提供一種產(chǎn)生、增強(qiáng)或調(diào)節(jié)消費(fèi)產(chǎn)品的風(fēng)味的方法，所述方法包括向所述消費(fèi)產(chǎn)品添加如本文中公開那樣所形成的至少一種硫酯。如本文中公開那樣形成的硫酯或含有如本文中公開那樣的至少一種硫酯的組合物可以通過(guò)使用將所述硫酯或組合物直接混入消費(fèi)產(chǎn)品的常規(guī)技術(shù)，添加至消費(fèi)產(chǎn)品。如本文中公開那樣形成的硫酯可以向消費(fèi)產(chǎn)品添加的量可以在寬范圍內(nèi)變動(dòng)，并且特別取決于消費(fèi)產(chǎn)品的性質(zhì)、取決于所需的效果、向消費(fèi)產(chǎn)品添加如本文中公開那樣形成的硫酯的目的，例如增強(qiáng)或產(chǎn)生味覺，并且取決于消費(fèi)產(chǎn)品中所包含的任何其他組分(例如其他香料成分)的性質(zhì)和量。根據(jù)所需的最終用途和效果，決定并入消費(fèi)產(chǎn)品中的如本文中公開那樣形成的硫酯的合適量完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)?；谙M(fèi)產(chǎn)品重量以重量ppm計(jì)，如本文中公開那樣形成的硫酯的常見非限制性濃度是約500ppm至約0.0lppm,更具體地約250ppm至約0.0lppm,仍更具體地約IOOppm至約 Ippm。在另一個(gè)方面，提供了包含通過(guò)本文中所述的方法所獲得或產(chǎn)生的至少一種硫酯的消費(fèi)產(chǎn)品。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“消費(fèi)產(chǎn)品”意指意在置于口腔中并攝取或已在口中使用并隨后拋棄的任何產(chǎn)品。合適的消費(fèi)產(chǎn)品包括但不限于醬汁、調(diào)味品、全部類型的食品原料、糖食產(chǎn)品，焙烘產(chǎn)品、甜品、美味產(chǎn)品，包括調(diào)味肉和肉產(chǎn)品和調(diào)味蔬菜和蔬菜產(chǎn)品、乳產(chǎn)品、飲料、口腔護(hù)理產(chǎn)品和其組合。示例性食品原料包括但不限于冷藏點(diǎn)心、甜點(diǎn)心和開胃點(diǎn)心、水果點(diǎn)心、薯片/薯?xiàng)l(chips/crisp)、膨化小吃、墨西哥圓餅/玉米片、爆米花、椒鹽卷餅、堅(jiān)果、其他甜點(diǎn)心和開胃點(diǎn)心、點(diǎn)心棒、燕麥棒、早餐棒、能量棒、水果棒、其他點(diǎn)心棒、代餐產(chǎn)品、瘦身產(chǎn)品、康復(fù)期飲料、快餐、罐裝快餐、冷凍快餐、干燥快餐、冷餐快餐、什錦正餐、冷凍匹薩、冷藏匹薩、湯、罐裝湯、脫水湯、速食湯、冷藏湯、UHT湯、冷凍湯、面食、罐裝面食、干燥面食、冷藏/新鮮面食、面條、素面條、方便面、杯裝/碗裝方便面、小袋裝方便面、冷藏面條、點(diǎn)心面條、干燥食品、什錦甜點(diǎn)、醬汁、調(diào)味汁和調(diào)味品、芳草和香辛料、涂抹醬、果醬和蜜餞、蜜、巧克力涂抹醬、基于堅(jiān)果的涂抹醬和基于酵母的涂抹醬。示例性糖食產(chǎn)品包括但不限于口香糖(其包括加糖香口膠、無(wú)糖香口膠、功能性香口膠和泡泡糖)、夾心糖、巧克力和其他巧克力糖果產(chǎn)品、藥制糖果產(chǎn)品、糖錠、片劑、糖果錠劑、薄荷糖、標(biāo)準(zhǔn)薄荷糖、提神薄荷糖(power mint)、奶糖、硬質(zhì)糖果、硬糖(boiledcandy)、呼吸和其他口 腔護(hù)理膜或條(breath and other oral care film or strip)、柺杖糖、棒棒糖、橡皮糖(gummy)、凍膠糖、乳脂軟糖、治糖、硬芯糖球和軟芯糖球(hard and softpanned good)、太妃糖、乳脂糖(taffy)、甘草糖(liquorice)、明膠糖、膠糖(gum drop)、凍膠糖豆(jelly bean)、牛軋?zhí)?、翻糖、一種或多種以上糖的組合和并入一種或多種以上糖的可食用組合物。示例性焙烘產(chǎn)品包括但不限于曲奇餅(alfajore)、面包、包裝/工業(yè)用面包、無(wú)包裝/手工面包、餡餅、蛋糕、包裝蛋糕、無(wú)包裝/手工蛋糕、餅干、巧克力掛涂餅干、夾心餅干、注心餅干、美味餅干和薄脆餅、面包代用品。示例性甜品包括但不限于早餐谷物食品、即食(“rte”)谷物食品、急停早餐谷物食品、薄片、muesl1、其他即食谷物食品、J L童早餐谷物食品、熱谷物食品。示例性美味產(chǎn)品包括但不限于咸味點(diǎn)心(馬鈴薯片、炸薯片、堅(jiān)果、墨西哥圓餅-烤面包(tortilla-tostada)、椒鹽卷餅、干酪點(diǎn)心、玉米點(diǎn)心、馬鈴薯點(diǎn)心、即食爆米花、可微波加工的爆米花、炸豬皮、堅(jiān)果、薄脆餅、薄脆餅點(diǎn)心、早餐谷物食品、肉、肉凍、腌肉(火腿、咸肉)、午餐肉/早餐肉(熱狗、冷盤冷、香腸)、番茄產(chǎn)品、人造奶油、花生黃油、湯(清湯、灌裝湯、奶油湯、速食湯、UHT湯)、罐裝蔬菜、意大利面醬。示例性乳產(chǎn)品包括但不限于、冰淇淋、速食冰淇淋(impulse ice cream)、單份裝乳類冰淇淋、單份裝水冰淇淋、多份裝乳類冰淇淋、多份裝水冰淇淋、家庭裝冰淇淋、家庭裝乳類冰淇淋、冰淇淋甜食、大塊冰淇淋、家庭裝水冰淇淋、冷凍酸奶、手工冰淇淋、乳產(chǎn)品、乳、鮮乳/巴氏消毒乳、全脂鮮乳/巴氏消毒乳、半脫脂鮮乳/巴氏消毒乳、長(zhǎng)貨架期/UHT乳、全脂長(zhǎng)貨架期/UHT乳、半脫脂長(zhǎng)貨架期/UHT乳、無(wú)脂長(zhǎng)貨架期/UHT乳、山羊乳、煉乳/淡乳、原味煉乳/淡乳、調(diào)味、功能性和其他煉乳、調(diào)味乳飲料、僅含乳的調(diào)味乳飲料、用果汁調(diào)味的乳飲料、酸乳、酸乳飲料、發(fā)酵乳類飲料、咖啡伴侶、乳粉、調(diào)味的乳粉飲料、奶油、酸奶、原味/天然酸奶、調(diào)味酸奶、果味酸奶、益生酸奶、飲用型酸奶、標(biāo)準(zhǔn)飲料飲用型酸奶、益生性飲用型酸奶、冷藏和貨架穩(wěn)定的甜食、基于乳的甜食、基于大豆的甜食。示例性飲料包括但不限于調(diào)味水、軟飲料、水果飲料、基于咖啡的飲料、基于茶的飲料、基于果汁的飲料(包括水果和蔬菜)、乳基飲料、凝膠飲料、碳酸飲料或非碳酸飲料、粉狀飲料、酒精飲料或無(wú)酒精飲料。對(duì)于乳產(chǎn)品，尤其干酪調(diào)味的產(chǎn)品，硫酯是特別重要的調(diào)味成分。具體而言，為提供真實(shí)干酪風(fēng)味伴隨良好的香影響，需要硫酯MTB，優(yōu)選地與MTA和/或MTP組合使用。在一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案中，包含至少一種如本文中公開那樣形成的硫酯的消費(fèi)產(chǎn)品是干釀?wù){(diào)味的廣品。在另一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施方案中，消費(fèi)產(chǎn)品是干酪調(diào)味的產(chǎn)品，其包含如本文中公開那樣形成的MTA和/或MTB和/或MTP。序列鑒定已經(jīng)參考以下序列ID編號(hào)描述本發(fā)明:SEQ ID N0.1-描述編碼硫酯酶425的核苷酸序列。SEQ ID N0.2_描述硫酯酶425的氨基酸序列。SEQ ID N0.3_描述編碼硫酯酶3320之一的核苷酸序列。SEQ ID N0.4_描述硫酯酶3320的氨基酸序列。SEQ ID N0.5_描述編碼硫酯酶1875的核苷酸序列。SEQ ID N0.6_描述硫酯酶1875的氨基酸序列。SEQ ID N0.7_描述編碼硫酯酶1874的核苷酸序列。SEQ ID N0.8_描述硫酯酶1874的氨基酸序列。闡述以下實(shí)施例以進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明和顯示所公開的方法和產(chǎn)物。然而，這些實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)以任何方式解釋為限制性的。
實(shí)施例實(shí)施例1 -克隆硫酉旨酶基因用于蛋白質(zhì)表達(dá)使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，以基因特異性引物(表I)，通過(guò)擴(kuò)增從擴(kuò)展短桿菌菌株ATCC9174 獲得硫酯酶(下文稱作 TE)TE 0425、TE1875、TE 3320 和 TE 1874 的 DNA 序列。引物包括允許基因定向克隆于pET_22b(+)載體(Novagen)中的限制性位點(diǎn)，同時(shí)避開在待克隆的基因內(nèi)部的位點(diǎn)。5’引物包括XbaI位點(diǎn)，后接序列AGGAGGATTAACATATG，此序列提供強(qiáng)力大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)和ATG起始密碼子。在ATG密碼子后，每條5’引物包括14-20個(gè)堿基的符合可讀框的基因特異性序列，其始于編碼特定蛋白質(zhì)的可讀框的
第二密碼子的第一堿基。3’引物包括SalI或XhoI位點(diǎn)和與除天然終止密碼子之外的特定可讀框的17_23堿基3’序列相對(duì)應(yīng)的基因特異性序列。pET-22b (+)載體由Novagen設(shè)計(jì)成在大腸桿菌中提供誘導(dǎo)型表達(dá)并通過(guò)并入已表達(dá)蛋白質(zhì)中的多組氨酸結(jié)構(gòu)域與鎳柱的結(jié)合而純化蛋白質(zhì)。將克隆至這個(gè)載體中的基因轉(zhuǎn)錄設(shè)計(jì)成需要添加誘導(dǎo)物IPTG，并且出于本發(fā)明中所概述的目的，完全根據(jù)制造商的推薦使用pET-22b(+)載體系統(tǒng)。為基因表達(dá)，使用大腸桿菌BL21(DE3)宿主細(xì)胞，其表達(dá)所用pET_22b (+)載體需要的T7RNA聚合酶。將所得到的基因特異性XbaI至SalI或XhoI片段克隆至pET_22b (+)載體，產(chǎn)生以下可讀框， 其具有編碼C端His標(biāo)簽結(jié)構(gòu)域的符合可讀框的序列和來(lái)自載體主鏈的終止密碼子。表1.用來(lái)克隆TE基因至pET_22b(+)載體中的基因特異性引物
權(quán)利要求
1.一種編碼具有硫酯酶活性的酶的核苷酸序列，其包含SEQ.1D.N0.1至4中所示序列的核苷酸或其功能等同物。
2.載體,其包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷酸序列。
3.宿主細(xì)胞,用根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體轉(zhuǎn)化。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌來(lái)源或真菌來(lái)源的。
5.產(chǎn)生具有硫酯酶活性的酶的方法，其包括:將根據(jù)權(quán)利要求1所述的序列插入表達(dá)載體中；用所述載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并且在合適的培養(yǎng)條件下培育所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
6.產(chǎn)生硫酯的方法，包括使包含SEQ.1D.N0.2、4、6和8中所公開的至少一個(gè)氨基酸序列或其功能等同物的至少一種硫酯酶和/或包含SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公開的至少一個(gè)核苷酸序列或其功能等同物的至少一種宿主細(xì)胞與至少一種合適的底物接觸，孵育所述混合物，分離含有硫酯的粗產(chǎn)物并且純化所述粗產(chǎn)物以便僅獲得硫酯。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述底物包括Cl-C8SCFA-CoA。
8.用于產(chǎn)生硫酯的試劑盒，包括至少一種硫酯酶和/或至少一種宿主細(xì)胞，所述硫酯酶包含SEQ.1D.N0.2、4、6和8中所公開的至少一個(gè)氨基酸序列或其功能等同物，所述宿主細(xì)胞包含SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公開的至少一個(gè)核苷酸序列或其功能等同物，和至少一種合適的底物。
9.對(duì)干酪調(diào)味的方法，其包括在干酪制造過(guò)程期間向其添加至少一種硫酯酶和/或至少一種宿主細(xì)胞，所述硫酯酶包含SEQ.1D.N0.2、4、6和8中所公開的至少一個(gè)氨基酸序列或其功能等同物，所述宿主細(xì)胞包含SEQ.1D.N0.1、3、5和7中所公開的至少一個(gè)核苷酸序列或其功能等同物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述硫酯酶和/或宿主細(xì)胞作為起子培養(yǎng)物的部分添加。
11.調(diào)味的干酪產(chǎn)品或干酪調(diào)味的產(chǎn)品，通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法可獲得或產(chǎn)生。
12.SEQ.1D.N0.1至4中所示的核苷酸序列或其功能等同物中任一種的用途，作為篩選生物的方法中的標(biāo)記物，所述生物能夠產(chǎn)生由所述核苷酸序列或其功能等同物編碼的硫酯。
13.組合物，其包含通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求6、7或9中任一項(xiàng)所述的方法獲得或產(chǎn)生的硫酯。
14.消費(fèi)產(chǎn)品，其包含通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求6、7或9中任一項(xiàng)所述的方法獲得或產(chǎn)生的硫酯。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的消費(fèi)產(chǎn)品，其中所述消費(fèi)產(chǎn)品選自干酪調(diào)味的產(chǎn)品或調(diào)味的干酪產(chǎn)品。
全文摘要
公開了編碼硫酯酶的核苷酸序列、用于產(chǎn)生它們的方法、它們?cè)谛纬闪蝓サ姆椒ㄖ械挠猛竞退鼈冊(cè)谟糜谀軌虍a(chǎn)生所述硫酯酶的其他野生型細(xì)菌的方法中的用途。另外，公開了包含由本文所公開方法產(chǎn)生的硫酯的組合物。
文檔編號(hào)C12N15/00GK103153085SQ201180045593
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2011年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月24日
發(fā)明者T·波夫米克, J·布羅德本特, D·威爾克, J·斯蒂爾, M·布迪尼西 申請(qǐng)人:奇華頓股份有限公司, 猶他州大學(xué), 威斯康星州男校友研究基金會(huì)