專利名稱：篩選與皮膚老化有關(guān)的基因和防止皮膚老化的材料的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及篩選表現(xiàn)出與皮膚老化有關(guān)的特性變化的基因的方法以及通過控制這些基因的表達(dá)篩選防止皮膚老化的物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
到目前為止，主要在皮膚真皮層(dermal layer)的變化方面進(jìn)行了關(guān)于皮膚老化的研究，且主要集中于調(diào)節(jié)膠原蛋白和膠原酶MMP (基質(zhì)金屬蛋白酶，matrixmetal1proteinase)的生物合成。而且,抗老化化妝品中的唯一活性成分是視黃醇,眾所周知，該活性成分能夠有效地促進(jìn)膠原蛋白的生物合成。然而，通過簡單的促進(jìn)膠原蛋白合成不能充分實(shí)現(xiàn)皮膚老化的預(yù)防，而且，皮膚老化的癥狀和相關(guān)因素隨著導(dǎo)致老化的原因不同而不同。因此，為了下一代功能性化妝品的發(fā)展，需要研究全面考慮了各種不同因素的新方法。另外，必需通過綜合分析與皮膚老化有關(guān)的特性基因的變化以確定引起皮膚老化的原因和理解皮膚老化的機(jī)理，從而開發(fā)預(yù)防和治療皮膚老化的技術(shù)，控制與皮膚老化有關(guān)的靶基因的表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題相應(yīng)地，為獲得與防止老化有關(guān)的新的靶基因，本發(fā)明的發(fā)明人利用基因芯片，通過全面篩選顯示出與皮膚老化有關(guān)的特性變化的基因而進(jìn)行了大量的嘗試。因此，本發(fā)明的目的是提供新的與防止老化有關(guān)的靶基因。本發(fā)明的另一個(gè)·目的是提供篩選新物質(zhì)的方法，所述物質(zhì)通過控制以上基因的表達(dá)而表現(xiàn)出抑制皮膚老化和治療皮膚疾病的效果。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種篩選與皮膚老化有關(guān)的基因的方法，該方法包括以下步驟:1)從皮膚組織中提取總RNA，并將提取到的RNA進(jìn)行微陣列分析；2)利用生物信息學(xué)技術(shù)(bioinformatics technique)分析隨老化而改變的基因；3)選擇與皮膚老化有關(guān)的候選基因；以及4)通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)確認(rèn)所述候選基因。本發(fā)明還提供了一種用于篩選防止皮膚老化的物質(zhì)的方法，該方法包括以下步驟:1)用控制細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的候選物質(zhì)處理皮膚細(xì)胞樣品；2)將皮膚細(xì)胞樣品暴露于具有皮膚老化因子的環(huán)境中，以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)；以及3)測試步驟2)中皮膚老化因子誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)。有益效果根據(jù)本發(fā)明的篩選方法，可以根據(jù)引起皮膚老化的不同原因而篩選與皮膚老化有關(guān)的基因。此外，不僅可以研究與UV輻射引起的光老化有關(guān)的基因，而且還可以研究引起與更年期相關(guān)的自然老化(intrinsic aging)的基因，而且根據(jù)靶基因的不同，可以開發(fā)差異化產(chǎn)品(differentiated products)。因此,可以從根本上防止皮膚老化。


圖1顯示了對(duì)年輕人和老年人的皮膚中甘丙肽前體肽源(galaninprepropeptide)進(jìn)行的微陣列分析和定量RT-PCR的結(jié)果。圖2和3顯示了通過SiRNA方法抑制甘丙肽前體肽源的表達(dá)，然后測試抗老化標(biāo)記(MMP)和炎癥因子的表達(dá)中UV誘導(dǎo)的變化，以分析甘丙肽前體肽源的功能而獲得的結(jié)
果O圖4顯示了甘丙肽前體肽源和膠原蛋白的表達(dá)之間的關(guān)系，應(yīng)用與圖2和3所示的相似方法，通過抑制甘丙肽前體肽源的表達(dá)而確定的該關(guān)系。圖5顯示了對(duì)年輕人和老年人的皮膚中骨甘氨酸(osteoglycin)進(jìn)行的微陣列分析和定量RT-PCR的結(jié)果。圖6顯示了甘丙肽前體肽源和膠原蛋白的表達(dá)之間的關(guān)系，通過抑制骨甘氨酸的表達(dá)而確定的該關(guān)系。圖7顯示了 16個(gè)脂溢性角化病中表達(dá)增強(qiáng)的基因。
具體實(shí)施例方式盡管皮膚老化是由不同因素引起的，但是將著重從以下方面對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述。1、由于時(shí)間推移而引起的自然老化
2、由激素引起的更年期老化3、脂溢性角化病

本發(fā)明提供了一種篩選與皮膚老化有關(guān)的基因的方法，該方法包括以下步驟:1)從皮膚組織中提取總RNA，并將提取到的RNA進(jìn)行微陣列(miCToarray)分析；2)利用生物信息學(xué)技術(shù)分析隨老化而改變的基因；3)選擇與皮膚老化有關(guān)的候選基因；以及4)通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)確認(rèn)所述候選基因。參與或者不參與皮膚老化的基因、男性或女性中表達(dá)增強(qiáng)或減弱的基因，隨引起皮膚老化的原因不同而不同，而且表達(dá)改變的基因可被確定為與皮膚老化有關(guān)的基因。因此，可以挑選這些基因作為與皮膚老化有關(guān)的候選基因。在本發(fā)明中，通過篩選方法發(fā)現(xiàn):甘丙肽前體肽源、Wnt3、TNS4、骨甘氨酸等可以作為與皮膚老化有關(guān)的新的靶基因，但是，本發(fā)明的范圍并不局限于此。本發(fā)明還提供了一種篩選物質(zhì)的方法，所述物質(zhì)通過控制以上靶基因的表達(dá)而具有防止皮膚老化的能力。具有防止皮膚老化作用的候選物質(zhì)可以通過使用細(xì)胞搜索系統(tǒng)搜索，然后利用志愿者的皮膚評(píng)估其對(duì)人體的作用而進(jìn)行篩選。本發(fā)明還提供了一種用于篩選防止皮膚老化的物質(zhì)的方法，該方法包括以下步驟:1)用控制細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的候選物質(zhì)處理皮膚細(xì)胞樣品；2)將皮膚細(xì)胞樣品暴露于具有皮膚老化因子的環(huán)境中，以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)；以及3)測試步驟2)中皮膚老化因子誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)。關(guān)于本發(fā)明所述方法的步驟I)中的細(xì)胞樣品，可以使用任何細(xì)胞，只要將它們置于導(dǎo)致皮膚老化的環(huán)境中時(shí)，能誘導(dǎo)與皮膚老化有關(guān)的基因的表達(dá)即可。具有皮膚老化因子的環(huán)境的實(shí)例包括但并不限于各種引起皮膚老化的因子，包括:紫外線、熱和激素。在本發(fā)明所述方法的步驟3)中，皮膚老化因子誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)可以通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)進(jìn)行測試。根據(jù)以上所述的方法，我們可以找到與皮膚老化有關(guān)的新的靶基因，并開發(fā)新的和差異化產(chǎn)品，根據(jù)皮膚老化有關(guān)的基因的不同原因，所述產(chǎn)品作用于與皮膚老化有關(guān)的基因。實(shí)施例下文中，將結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。但是，應(yīng)當(dāng)理解的是，這些實(shí)施例是以說明為目的的，在不脫離本發(fā)明范圍和精神的情況下，各種修改、添加和替換都是被允許的。測試實(shí)施例1:自然老化模型的微陣列分析為了篩選與由于時(shí)間推移而引起的自然老化有關(guān)的基因，在人皮膚上進(jìn)行測試。挑選18-25歲的年輕人(4男4女)和78_82歲的老年人(4男4女)作為受試者，從每個(gè)受試者身上通過4-8mm的穿刺活檢(punch biopsy)采集4_6個(gè)臀部皮膚樣品。從采集的皮膚樣品中提取總RNA并進(jìn)行微陣列分析(Affymetrix GeneChipHuman HG-U133 Plus2.0),利用生物信息學(xué)技術(shù)(DAVID Bioinformatics Resources/Genespring)分析隨年齡而改變的基因。根據(jù)分析結(jié)果選擇與皮 膚老化有關(guān)的候選基因，并通過定量RT-PCR的結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。下表I顯示了在男性或女性中表達(dá)增強(qiáng)或減弱的基因數(shù)。表I
只在男性中存在共同的只在女性中存在
男性女性
總數(shù) 497200200123
增強(qiáng)的 405%3856
減弱的 92 6216267(Ρ〈=0.05，2 倍變換 U133-2 探針(probes)，無 FDR)因?yàn)闆]有在男性中增強(qiáng)、女性中減弱的探針，因此，共同基因中不存在在男性和女性之間具有差異的探針。下表2顯示了在老年男性和老男女性皮膚中表達(dá)都增強(qiáng)的基因。表權(quán)利要求
1.一種篩選與皮膚老化有關(guān)的基因的方法，該方法包括以下步驟: O從皮膚組織中提取總RNA，并將提取到的RNA進(jìn)行微陣列分析； 2)利用生物信息學(xué)(bioinformatics)技術(shù)分析隨老化而改變的基因； 3)選擇與皮膚老化有關(guān)的候選基因；以及 4)通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)確認(rèn)所述候選基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，皮膚老化是由于時(shí)間推移而引起的自然老化、由激素引起的更年期老化或者脂溢性角化病。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述自然老化與選自由LPL、ADIPOQ、PLN、AL0X15B、SPRR1A、STP12A、INSIGl和GAL組成的組中的一種或多種基因有關(guān)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述更年期老化與選自由MMP3、FIGF,CMAl、RSP03、DPP4、C0L1A1、LPHN3、GREBl和OGN組成的組中的一種或多種基因有關(guān)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述脂溢性角化病與選自由L0XL2、WNT3、C0L17A1、CIDEB、H0XA7、CDH3、SILV、MXl、PLAT、CCL2、ID1、AQP3、TNS4、ISG15、FGFR3 和 pl6組成的組中的一種或多種基因有關(guān)。
6.一種用于篩選防止皮膚老化的物質(zhì)的方法，該方法包括以下步驟: 1)用控制細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的候選物質(zhì)處理皮膚細(xì)胞樣品； 2)將皮膚細(xì)胞樣品暴露于具有皮膚老化因子的環(huán)境中，以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)；以及 3)測試步驟2)中皮膚老化因子誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)；
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述細(xì)胞內(nèi)基因是指與由于時(shí)間推移而引起的自然老化、由激素引起的更年期老化或者脂溢性角化病有關(guān)的基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述自然老化與選自由LPL、ADIPOQ、PLN、AL0X15B、SPRR1A、STP12A、INSIGl和GAL組成的組中的一種或多種基因有關(guān)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述更年期老化與選自由MMP3、FIGF,CMAURSP03、DPP4、C0L1A1、LPHN3、GREBl和OGN組成的組中的一種或多種基因有關(guān)。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述脂溢性角化病與選自由L0XL2、WNT3、C0L17A1、CIDEB、H0XA7、CDH3、SILV、MXl、PLAT、CCL2、ID1、AQP3、TNS4、ISG15、FGFR3 和 pl6組成的組中的一種或 多種基因有關(guān)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種篩選皮膚老化特異性基因的方法以及通過控制基因表達(dá)篩選抗老化材料的方法。本發(fā)明能夠提供一種新材料，所述新材料通過獲得與皮膚老化有關(guān)的新靶基因和控制基因的表達(dá)而具有防止皮膚老化和治療皮膚疾病的功效。
文檔編號(hào)C12N15/12GK103249842SQ201180056031
公開日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2011年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月30日
發(fā)明者孫義東, 李真锳, 羅勇柱, 金惠暻, 金知賢, 安秀美, 金漢坤, 鄭振鎬, 樸致炫, 徐銀英, 李玟政, 吳仁憬, 尹鉉善 申請(qǐng)人:株式會(huì)社愛茉莉太平洋, 首爾大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)