專利名稱：嗜水氣單胞菌適體及其篩選方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的致病病原菌一嗜水氣單胞菌，特別涉及嗜水氣單胞菌適體及其篩選方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
嗜水氣單胞菌(Aerotnoims hydrophila)在自然界分布廣泛，是多種水生動物的原發(fā)性致病菌，可產(chǎn)生多種致病因子，對水產(chǎn)動物，畜禽和人類均有致病性，可引起多種動物的敗血癥和人類腹瀉，給人類健康帶來了威脅，同時也給養(yǎng)殖業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失(I.張翠娟，于宙亮，趙寶華，何宏軒.嗜水氣單胞菌研究進(jìn)展[J].中國獸醫(yī)雜志，2008，42(7) :46-50.)。因此，對于作為水源污染指示菌的嗜水氣單胞菌污染，其檢測力度仍需進(jìn)一步加強(qiáng)。目前嗜水氣單胞菌的檢測一直是個棘手的問題，傳統(tǒng)的化學(xué)病理檢測過程繁瑣，耗 費時間；酶聯(lián)免疫、多重PCR技術(shù)則成本過高(2.王利.魚類嗜水氣單胞菌的幾種檢測方法[J].內(nèi)陸水產(chǎn)，2006，(2):22-23.)。因此，開發(fā)一種操作簡便，成本低廉，快速方便的嗜水氣單胞菌檢測方法，成為本領(lǐng)域技術(shù)人員迫切需要解決的技術(shù)難題。SELEX ( Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)即指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)，是1990年由美國的Tuerk和Gold創(chuàng)建的一種體外合成篩選寡核苷酸適體的化學(xué)組合技術(shù)(3.孟慶玲，陳創(chuàng)夫.SELEX技術(shù)及其應(yīng)用前景[J].塔里木大學(xué)學(xué)報，2008，20 (3) :44-48. 4.廖世奇，劉巍，王黎.SELEX技術(shù)應(yīng)用研究進(jìn)展[J].甘肅醫(yī)藥，2009，(02) :96-97.)。由于適體具有特異性高、庫容量大、合成時間短(5.王聰艷，孫偉，李建國，等.SELEX技術(shù)應(yīng)用研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報，2006，(SI) :232-236.)等優(yōu)點，SELEX技術(shù)現(xiàn)在廣泛應(yīng)用在疾病防控、藥物篩選、臨床診斷等不同的技術(shù)領(lǐng)域，隨著技術(shù)的不斷創(chuàng)新與發(fā)展，逐漸產(chǎn)生了一些新的SELEX篩選方法，如導(dǎo)向SELEX技術(shù)、復(fù)合靶分子SELEX技術(shù)、基因組SELEX技術(shù)等新的研究手段(6.孟慶玲，陳創(chuàng)夫.SELEX技術(shù)及其應(yīng)用前景[J].塔里木大學(xué)學(xué)報，2008，20 (3) :44-48.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的在于提供嗜水氣單胞菌適體。本發(fā)明的第二目的在于提供所述嗜水氣單胞菌適體的篩選方法。本發(fā)明的第三目的在于提供所述嗜水氣單胞菌適體在檢測述嗜水氣單胞菌中的應(yīng)用。所述嗜水氣單胞菌適體的核酸序列如序列表中1-22號中的序列所示。所述嗜水氣單胞菌適體的篩選方法是將指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(即SELEX篩選)應(yīng)用于嗜水氣單胞菌適體的篩選，所述SELEX篩選的具體步驟包括
O構(gòu)建并合成待篩選的嗜水氣單胞菌適體ssDNA文庫，并設(shè)計合成相應(yīng)的引物；
2)取適量所述ssDNA文庫與嗜水氣單胞菌進(jìn)行結(jié)合；
3)分離獲得與嗜水氣單胞菌結(jié)合的ssDNA，以該ssDNA為模板進(jìn)行PCT擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物再次進(jìn)行SELEX篩選直至獲得相應(yīng)適體。在步驟I)中，所述 ssDNA 文庫可為5 ' -GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTCAA-N35-TT CGA CAT GAG GCC CGG ATC-3'。所述引物可為
引物 I :5' -GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-3'；
引物 II 5/ -GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3'；
引物III 5/ -地高辛-GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-3'；
引物IV 5/ -生物素-GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3'。
在步驟3)中，所述SELEX篩選共進(jìn)行12輪。本發(fā)明采用SELEX技術(shù)篩選出致病性嗜水氣單胞菌的高親和力寡核苷酸適體，所述適體為嗜水氣單胞菌的快速檢測技術(shù)的開發(fā)以及在水產(chǎn)病害控制方面的應(yīng)用提供參考，可廣泛應(yīng)用于嗜水氣單胞菌的檢測與分析。


圖I為PCR產(chǎn)物3%瓊脂糖凝膠電泳圖。在圖I中，M為50bp DNA marker, 1、3、
5、7、9、11、12 分別表示第 1、3、5、7、9、11、12 輪的 PCR 產(chǎn)物。圖2為適體與嗜水氣單胞菌結(jié)合的吸光度。在圖2中，橫坐標(biāo)為篩選輪數(shù)，縱坐標(biāo)為A450nm時的吸光度。圖3-圖5為本發(fā)明所篩選的核酸適體二級結(jié)構(gòu)圖。圖3中的結(jié)構(gòu)最小自由能為-7. 60千卡/摩，圖4中的結(jié)構(gòu)最小自由能為I. 83千卡/摩，圖5中的結(jié)構(gòu)最小自由能為-3. 11千卡/摩。
具體實施例方式一、ssDNA文庫及引物的合成
參照文獻(xiàn)(7、劉豐偉，蘭小鵬.體外篩選銅綠假單胞菌適體的研究及初步應(yīng)用[D].福州福建醫(yī)科大學(xué)，2007.)中公開的方法，用于SELEX篩選的隨機(jī)ssDNA文庫和引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。所用文庫為5'-GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-N35-TT CGA CAT GAG GCCCGG ATC-3'。所用引物分別為
引物 I :5' -GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-3'；
引物 II 5/ -GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3'；
引物III 5/ -地高辛-GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-3'；
引物IV 5/ -生物素-GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3'。上述引物在合成后用分子生物學(xué)中常用的TE緩沖液(pH8. O)稀釋至濃度為10 μ mol, -20°c保存?zhèn)溆谩６?、實驗試劑及緩沖液制備
Dynabeads 鏈酶親和素磁珠 M-280 試劑盒、2 X Taq PCR MasterMix、50bp DNA LadderMarker、牛血清白蛋白(BSA)均購自廈門鷺隆生物技術(shù)有限公司，PCR膠回收純化試劑盒購自omega公司，抗地高辛堿性磷酸酶購自Roche公司，對硝基苯磷酸二鈉為Amresco公司產(chǎn)品。緩沖液參照參考文獻(xiàn)(劉豐偉，蘭小鵬.體外篩選銅綠假單胞菌適體的研究及初步應(yīng)用[D].福州福建醫(yī)科大學(xué)，2007.)配制。三、菌種嗜水氣單胞菌ASl. 1801購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。四、SELEX篩選
取一定量隨機(jī)ssDNA文庫(首輪篩選用量為600pmol，隨后每輪減少用量)，加入600 μ L選擇緩沖液稀釋ssDNA，于95°C變性5min，冷卻lOmin。加入30 μ L的嗜水氣單胞菌菌懸液(菌的數(shù)量約為I. 5Χ108個)，混勻置搖床室溫結(jié)合30min，15000r/min，4°C下離心lOmin。之后棄上清液，加入600 μ L選擇緩沖液重懸，如此重復(fù)洗滌3次，洗去未與嗜水氣單胞菌結(jié)合的ssDNA,結(jié)合了 ssDNA的嗜水氣單胞菌沉淀用100 μ L ddH20重懸,96°C加熱5min,離心后取上清為模板，用引物I、IV進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得標(biāo)記生物素的雙鏈DNA (dsDNA)，利用M-280磁珠通過生物素一鏈親和素之間的相互作用分離ssDNA，作為下一輪篩選的次級庫。依照上述方法，對次級庫再次進(jìn)行SELEX篩選，先后進(jìn)行12輪SELEX篩選。 五、各輪適體與嗜水氣單胞菌結(jié)合率的測定以及適體的序列測定與分析
將第1、3、5、7、9、11、12輪SELEX篩選的產(chǎn)物(即該輪的洗脫上清)，用弓I物III和引物IV進(jìn)行PCR擴(kuò)增，各輪均擴(kuò)增320 μ L。PCR擴(kuò)增體系為2X Taq PCR MasterMix 10ul，上游引物(IOum)、下游引物(IOum)各O. 4ul，模板lul，用去離子水補(bǔ)足到20ul。PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性 3min ;94°C變性 30s，58°C _70°C退火 30s，72°C延伸 20s，24 個循環(huán)；72°C延伸 3min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用膠回收純化試劑盒進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物利用3%的瓊脂糖電泳檢測，可以看出電泳條帶越來越致密，同時彌散現(xiàn)象越來越少，條帶隨著篩選次數(shù)的增加越來越整齊且亮度有所增加。說明隨著篩選次數(shù)的增加，特異性適體得到了富集，其同源性可能比較高
純化后的PCR產(chǎn)物用鏈霉親和素磁珠將純化的dsDNA解鏈成ssDNA，此ssDNA即帶有地高辛標(biāo)記，測定其含量。再按ssDNA :嗜水氣單胞菌=300pmol I. 5 X IO8的比例，將兩者在500 μ L選擇緩沖液中結(jié)合30min，離心后加入100 μ L I 15000稀釋的抗地高辛抗體標(biāo)記的堿性磷酸酶反應(yīng)IOmin,離心棄上清并用500 μ L選擇緩沖液懸浮嗜水氣單胞菌,重復(fù)洗滌3次，洗去未與嗜水氣單胞菌上ssDNA-地高辛結(jié)合的抗地高辛抗體標(biāo)記的堿性磷酸酶，然后加入100 μ L對硝基苯磷酸鹽溶液顯色，顯色好后加入IOOyL 2mol/L NaOH終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀于405 nm測定吸光度值，實驗結(jié)果參見圖I。該親和力測定結(jié)果表明，隨著篩選輪數(shù)的增加，適體與菌液的親和力逐漸增大，在第九輪時達(dá)到最大，之后親和力變化不大、趨于平緩，說明適體達(dá)到了飽和。再用引物I和引物II將第12輪的PCR產(chǎn)物大量擴(kuò)增，純化后送于英駿生物技術(shù)有限公司克隆、克隆之后隨機(jī)取24個克隆子測序，獲得22條符合要求的適體序列。按照隨機(jī)序列堿基的數(shù)目分為A群、B群兩個群。A群(見表I)包括13條適體序列，與預(yù)期長度一致，B群(見表2)包含9條序列，均短于預(yù)期長度。測序結(jié)果見表I。用Macaw 2. 05軟件包分析22個適體的同源序列，獲得4個保守序列=GTTTTX (見于Al-I、Al_8、Al-13、A1-17、Α1-20、Α1-21、Α1-26、Α1-30 號適體);GTGGGT (見于 A1-1、A1-7、A1-12、A1-15、A1-22、A1_29);GTTTX (見于 Α1-1、Α1-5、Α1-7、Α1-10、Α1-13、Α1-14、Α1-15、Α1-18、Α1-21、Α1-22、Α1-29)；XTTTT (見于Al-14、Al-26、A1-27)。有的適體中同一保守序列出現(xiàn)多次，如A1-18中三次出現(xiàn)GTTTG ;有的適體中則出現(xiàn)多個保守序列，但沒有發(fā)現(xiàn)存在于所有適體中的保守序列。
適體序歹瞭中的編號核酸序歹Li_ Al-3 ~TGGTGGTCTGCTAGCGGTTTATGTTTTTGTCTGGT—
Al-42~AGGATGGATTAGTGGGATTGGTGGTTAGGGGGGG—
Al-53~GACCTCGTCTTCGGTGTGATCGTTTCTTGTTGTTG—
Al-74~GGTGTGTTGGTGGGTGTGTGTTTGGGTTCTTGGGT—
Al-145~TGCGGCTGTGTGGGTGGTTTGGGTTTGTTGCTTTT—
Al-156~GCGGTGGGTGGTAGGTTTGTGTTTGTTAATGGGTG—
Al-177~GTTGTCTCTGGTGTTTTGGATTGATGGCCTTGCTG—
Al-188~GGTGTCTGGTTTGTTGTGGTTGTTTGTGGTTTGTG—
A1-2Q9~GCGGTTATGTGAAATTATGGCATGGTTTTGTGGTG—
Al-26~GGTCCATTGGCTGTGTTTTCTAGGTGTTATGTTTT—
Al-27~GGTCGTTAGACGGGGCTAGTAATATATTTCCTTTT—
Al-29~CTGTCGTGTGTTTGGGTGTGGGTCGTGTGGTTGGT—
Ai-31 113Igtatagatgtactgctgtgcatatcctatgcaact表I A群嗜水氣單胞菌適體_
適體序歹瞭中的編號_核酸序歹Li_
Al-I~GGTGGTGGGTGTTTTGTCGGTTTGGTGTTTGGT—
Al-8~TGGCGGTGTTTTTGGGTGGGGTTATAGG—
Al-IQ~CTGGCTGTTCGTTTAGAATGAACCGGTCATG—
Al-12TTGTTGTGGTGGGGTCGGAGGTTGTCTGGT—
Al-13~TGGTGTTTGGTTGTTTTGTTTGG—
Al-21~TTTGTGGCGGGGTTTGCTTGGTTTTGTGGTGG—
Al-222Q~GGGGTGGGTGGGTGTGTGTTTGGTTGGTTTG—
Al-302 ~GGGTTGGTTTGGGGGGGGCTGTTTTG—
Al-28 \22Igggtgggttggttggtggttgtttttgtg
表2 B群嗜水氣單胞菌適體
用DNAMAN軟件對所測得的22條序列進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析，根據(jù)結(jié)構(gòu)可將其分為三類第一類5'端的固定序列區(qū)堿基與:V端的第6個堿基起形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，中間隨機(jī)區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，3'端的5個固定堿基形成一個小的口袋結(jié)構(gòu)(圖3)。這種結(jié)構(gòu)的適體有Α1-3、Α1-5、Α1-7、Α1-13、Α1-14、Α1-20、Α1-22 共七條；
第二類5'端的第3個至21個堿基形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，3'端固定序列區(qū)堿基與中間隨機(jī)區(qū)堿基形成莖環(huán)并凸起，然后再由5'端、3'端固定序列區(qū)堿基和中間隨機(jī)區(qū)形成一個口袋結(jié)構(gòu)(圖 4)，這種結(jié)構(gòu)的適體有 Al-1、Al-4、Al-12、Al-15、Al-17、Al-18、Al-21、Α1-27、Α1-28、Α1-29、Α1-30、Α1_31 共十二條；
第三類5'端、3'端固定序列區(qū)部分堿基分別與隨機(jī)區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，然后由5'端、3'端固定序列區(qū)堿基和中間隨機(jī)區(qū)再形成一個大的口袋結(jié)構(gòu)(圖5)。這種結(jié)構(gòu)的適體有 Α1-8、Α1-10、Α1-26 三條。申請人:人工合成的ssDNA文庫全長78bp，中間35bp為隨機(jī)核苷酸，由于每個位點有A、G、C、T四種可能，這樣的話中間35個序列就有435個可能組合，即其庫容量達(dá)到了 IO16之多，雖然實際實驗中可能只到IO14左右，但這也滿足了篩選目的寡核苷酸的需要(8、李衛(wèi)濱，蘭小鵬，楊湘越，等.SELEX技術(shù)在篩選環(huán)孢霉素A適體中的運用[J].福州總醫(yī)院學(xué)報，2007，(03) :171-173)。在前兩輪篩選的過程中，申請人添加的文庫量比較多，這樣的目的是盡可能的獲得比較多的與嗜水氣單胞菌特異性結(jié)合的適體。但隨著篩選輪數(shù)的增加，次級文庫的量就要相應(yīng)的減少，這是因為文庫的濃度越來越大的緣故。為了增加適體的特異性，申請人相應(yīng)增加了洗脫次數(shù)，同時文庫與菌液結(jié)合的時間也相從前幾輪的30min減少到后來的20min。PCR條件的優(yōu)化對適體的篩選也十分重要，每一輪篩選，申請人都要先做一個梯度PCR，在得到最適退火溫度的前提下再做PCR擴(kuò)增，這樣有效的避免了非特異性擴(kuò)增等問題。申請人:實驗用的是鏈霉親和素磁珠來富集次級文庫，它操作簡單、不需要離心，只要在磁場的作用下即可達(dá)到分離的效果，同時它得到的次級文庫比較穩(wěn)定，純度更高，不易出現(xiàn)不對稱PCR中的非特異性擴(kuò)增的問題。通過12輪篩選、克隆測序得到的22條適體中，有13條適體與預(yù)期長度一直一致。 利用DNAMAN軟件對其二級結(jié)構(gòu)分析,從結(jié)果中可以看出，這些序列的二級結(jié)構(gòu)都是由莖環(huán)和口袋(勺狀)結(jié)構(gòu)組成，這說明了莖環(huán)和口袋結(jié)構(gòu)可能是適體與嗜水氣單胞菌結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，莖可能起著穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的作用，環(huán)可能是其結(jié)合部位。有些二級結(jié)構(gòu)中含有勺狀的口袋，這些口袋也可能起著同環(huán)一樣的作用，即可能是與受體結(jié)合的結(jié)合部位。在這些莖結(jié)構(gòu)中，其堿基主要是G-C為主，由于G-C的結(jié)構(gòu)能大于A-T，這一點也說明莖可能起著穩(wěn)定作用。本發(fā)明初步建立了 SELEX法篩選嗜水氣單胞菌適體的方法，同時獲得了具有特異性的嗜水氣單胞菌的適體，并對適體群的二級結(jié)構(gòu)初步進(jìn)行了研究，得到其二級結(jié)構(gòu)的一些結(jié)構(gòu)組成，這為以后研究嗜水氣單胞菌的分子結(jié)構(gòu)打下了一定的基礎(chǔ)，同時也為嗜水氣單胞菌的檢測提供了一種新的方法。
權(quán)利要求
1.嗜水氣單胞菌適體，其特征在于，其序列如序列表中1-22號所示。
2.如權(quán)利要求I所述嗜水氣單胞菌適體的篩選方法，其特征在于，所述篩選方法采用SELEX篩選，所述SELEX篩選的步驟包括 .1)構(gòu)建并合成待篩選的嗜水氣單胞菌適體ssDNA文庫，并設(shè)計合成相應(yīng)的引物； .2)取適量所述ssDNA文庫與嗜水氣單胞菌進(jìn)行結(jié)合； .3)分離獲得與嗜水氣單胞菌結(jié)合的ssDNA，以該ssDNA為模板進(jìn)行PCT擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物再次進(jìn)行SELEX篩選直至獲得如權(quán)利要求I所述的適體。
3.如權(quán)利要求2所述嗜水氣單胞菌適體的篩選方法，其特征在于在步驟I)中，所述ssDNA 文庫為5' -GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-N35-TT CGA CAT GAG GCC CGGATC-3'。
4.如權(quán)利要求2所述嗜水氣單胞菌適體的篩選方法，其特征在于在步驟I)中，所述引物為 引物 I :5' -GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-3'；引物 II 5/ -GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3'； 引物III 5/ -地高辛-GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-3'； 引物IV :5'-生物素-GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3'。
5.如權(quán)利要求2所述嗜水氣單胞菌適體的篩選方法，其特征在于在步驟3)中，所述SELEX篩選共進(jìn)行12輪。
6.如權(quán)利要求I所述嗜水氣單胞菌適體在檢測述嗜水氣單胞菌中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及嗜水氣單胞菌適體及其篩選方法與應(yīng)用。提供嗜水氣單胞菌適體以及所述嗜水氣單胞菌適體的篩選方法與應(yīng)用。所述嗜水氣單胞菌適體的篩選方法的具體步驟包括構(gòu)建并合成待篩選的嗜水氣單胞菌適體ssDNA文庫，并設(shè)計合成相應(yīng)的引物；取適量所述ssDNA文庫與嗜水氣單胞菌進(jìn)行結(jié)合；分離獲得與嗜水氣單胞菌結(jié)合的ssDNA，以該ssDNA為模板進(jìn)行PCT擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物再次進(jìn)行SELEX篩選直至獲得相應(yīng)適體。本發(fā)明采用SELEX技術(shù)篩選出致病性嗜水氣單胞菌的高親和力寡核苷酸適體，所述適體可廣泛應(yīng)用于嗜水氣單胞菌的檢測與分析。
文檔編號C12R1/01GK102643821SQ20121000177
公開日2012年8月22日 申請日期2012年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月5日
發(fā)明者李元躍, 段博文, 王雷, 陳融斌, 黎中寶 申請人:集美大學(xué)