一種維氏氣單胞菌漁用注射疫苗的制備及使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于防治水產(chǎn)動(dòng)物疾病研宄技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種維氏氣單胞菌漁用注射疫苗的制備及使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]維氏氣單胞菌1983年在美國(guó)疾控預(yù)防中心被首次鑒定，它具有氣單胞菌屬典型的毒力因子，如氣溶素、腸毒素、一系列粘附因子、磷脂酶、絲氨酸蛋白酶等。維氏氣單胞菌是一種人和魚(yú)共患致病菌，在影響水產(chǎn)品質(zhì)量的同時(shí)，也對(duì)人類健康和安全造成了威脅。進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，由維氏氣單胞菌引發(fā)的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物致病情況呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，引起魚(yú)類感染和大量水產(chǎn)動(dòng)物死亡的報(bào)道也逐漸增多。利用疫苗預(yù)防疾病是近年來(lái)水產(chǎn)業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)，我國(guó)的漁用疫苗研宄十分薄弱，批準(zhǔn)使用的商用水產(chǎn)動(dòng)物疫苗屈指可數(shù)，有關(guān)維氏氣單胞菌滅活疫苗的研宄在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。目前，魚(yú)類易感染維氏氣單胞菌，但卻沒(méi)有成本低、制備容易、預(yù)防效果好的疫苗進(jìn)行魚(yú)類及水產(chǎn)動(dòng)物免疫，以至于造成他們的大量死亡。本發(fā)明通過(guò)分離鑒定得到維氏氣單胞菌并制備出滅活疫苗，用于魚(yú)類免疫后具有很好的免疫保護(hù)效應(yīng)，能夠有效地防控維氏氣單胞菌引起的魚(yú)類等疾病。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種維氏氣單胞菌漁用注射疫苗的制備方法，解決了魚(yú)類感染維氏氣單胞菌引起疾病的問(wèn)題。
[0004]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種維氏氣單胞菌漁用注射疫苗的使用方法。
[0005]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是按照以下三個(gè)步驟進(jìn)行:
[0006]①維氏氣單胞菌的來(lái)源及分離鑒定:發(fā)明人從發(fā)病的烏鱧體內(nèi)分離到一株優(yōu)勢(shì)菌，經(jīng)人工感染后證實(shí)其對(duì)鯽魚(yú)等有相同的病兆現(xiàn)象，具有較強(qiáng)的致病性。以分子鑒定16SrRNA序列為主，結(jié)合分離菌株的生理生化鑒定結(jié)果，確定病原菌為維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，表明該菌16SrRNA序列與同源性較高的前40位的菌株均為維氏氣單胞菌(A.veronii)，同源性在99%以上，由此選用此菌株制備維氏氣單胞菌滅活疫苗。
[0007]②維氏氣單胞菌漁用注射疫苗制備方法是按照以下步驟進(jìn)行:
[0008]步驟1:挑取維氏氣單胞菌形成的單個(gè)菌落，接種培養(yǎng)于普通肉湯培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)12h，擴(kuò)大培養(yǎng)維氏氣單胞菌到最高峰值；
[0009]步驟2:之后用無(wú)菌槍頭吸取0.2mL菌液涂布于普通平板上培養(yǎng)，4h后用無(wú)菌生理鹽水洗下維氏氣單胞菌；
[0010]步驟3:用麥?zhǔn)媳葷岱y(cè)定細(xì)菌濃度，直至用無(wú)菌生理鹽水稀釋維氏氣單胞菌濃度至 2.5X109CFU/mL ；
[0011]步驟4:加入0.2 %的甲醛溶液，在28 °C條件下恒溫滅活24h，8000r/min離心洗滌3次，每次5min，去掉其他成分后，再用無(wú)菌生理鹽水將維氏氣單胞菌濃度稀釋至I X 108CFU/mL,即為維氏氣單胞菌滅活全菌苗；置于4°C的冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0012]③維氏氣單胞菌漁用注射疫苗的使用方法:將制得的維氏氣單胞菌滅活疫苗采用腹腔注射的方法對(duì)健康魚(yú)類進(jìn)行免疫注射，大小規(guī)格為40-60g的魚(yú)，接種量為每尾注射
0.2mL疫苗。
[0013]進(jìn)一步，所述注射是I次免疫注射；或者在I次免疫注射后第14?28d進(jìn)行第2次免疫注射。
[0014]本發(fā)明的有益效果是該疫苗能有效預(yù)防維氏氣單胞菌感染魚(yú)類，免疫效果好。
[0015]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:
[0016]①制備的維氏氣單胞菌漁用注射疫苗對(duì)魚(yú)類具有很好的免疫保護(hù)作用，能有效地預(yù)防維氏氣單胞菌對(duì)魚(yú)類的感染。維氏氣單胞菌疫苗免疫試驗(yàn)表明對(duì)魚(yú)類的免疫保護(hù)力在70%?90%之間，總體免疫保護(hù)力可達(dá)到85%以上。
[0017]②從魚(yú)類人工感染和回歸感染試驗(yàn)可見(jiàn)，制作漁用注射疫苗選用的維氏氣單胞菌株具有較強(qiáng)的毒力；在對(duì)鯽魚(yú)的急性毒性試驗(yàn)中，測(cè)得該菌株半致死量為
1.6X 17(Cells);用4X 108cfu/mL維氏氣單胞菌濃度進(jìn)行回歸感染試驗(yàn)，烏鱧的死亡率為100%。維氏氣單胞菌滅活疫苗具有安全性好、制備容易等特點(diǎn)，在保證其安全性的前提下，采取溫和的滅活條件保證了疫苗的抗原性和有效性；疫苗使用0.2%的甲醛在28°C條件下滅活24h，不但可以達(dá)到完全滅活的要求，還能最大程度的保護(hù)好其免疫原性。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0019]本發(fā)明的維氏氣單胞菌漁用注射疫苗的制備和使用方法如下:
[0020]維氏氣單胞菌滅活疫苗的制備:
[0021]步驟1:挑取維氏氣單胞菌形成的單個(gè)菌落，接種培養(yǎng)于普通肉湯培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)12h，擴(kuò)大培養(yǎng)維氏氣單胞菌到最高峰值；
[0022]步驟2:之后用無(wú)菌槍頭吸取0.2mL菌液涂布于普通平板上培養(yǎng)，4h后用無(wú)菌生理鹽水洗下維氏氣單胞菌；
[0023]步驟3:用麥?zhǔn)媳葷岱y(cè)定細(xì)菌濃度，直至用無(wú)菌生理鹽水稀釋維氏氣單胞菌濃度至 2.5X109CFU/mL ；
[0024]步驟4:加入0.2 %的甲醛溶液，在28 °C條件下恒溫滅活24h，8000r/min離心洗滌3次，每次5min，去掉其他成分后，再用無(wú)菌生理鹽水將維氏氣單胞菌濃度稀釋至I X 108CFU/mL,即為維氏氣單胞菌滅活全菌苗；置于4°C的冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0025]使用方法:
[0026]將制得的維氏氣單胞菌滅活疫苗采用腹腔注射的方法對(duì)健康魚(yú)類進(jìn)行免疫注射，大小規(guī)格為40-60g的魚(yú)，接種量為每尾注射0.2mL疫苗；免疫可以是I次免疫注射，也可以在I次免疫后第14?28d進(jìn)行第2次免疫注射。
[0027]實(shí)施例1:
[0028]將制備的維氏氣單胞菌漁用注射疫苗對(duì)鯽魚(yú)進(jìn)行二次免疫并攻毒，結(jié)果顯示鯽魚(yú)注射疫苗后血清抗體效價(jià)在14d達(dá)第一個(gè)峰值1:320，經(jīng)過(guò)二次免疫后抗體效價(jià)增加至1:640 ;攻毒后，維氏氣單胞菌疫苗對(duì)鯽魚(yú)的免疫保護(hù)力達(dá)到87.5%。鯽魚(yú)注射疫苗后外周血淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的分類百分比、吞噬細(xì)胞的吞噬百分比和吞噬指數(shù)均顯著高于對(duì)照組(p〈0.05)，由此表明維氏氣單胞菌滅活疫苗對(duì)鯽魚(yú)免疫保護(hù)的效果好。
[0029]實(shí)施例2:
[0030]將制備的維氏氣單胞菌漁用注射疫苗對(duì)草魚(yú)進(jìn)行免疫并攻毒，分為一次免疫組和進(jìn)行二次免疫組，結(jié)果顯示草魚(yú)注射疫苗后血清抗體效價(jià)一次免疫組在免疫后14d達(dá)到最大值1:320，二次免疫組在第2Id達(dá)到最大值1:640 ;攻毒后，維氏氣單胞菌疫苗對(duì)草魚(yú)的免疫保護(hù)力一次免疫組為70.59%，二次免疫組為88.24%，免疫組與對(duì)照組相比均差異顯著(P〈0.05)。草魚(yú)注射疫苗后2個(gè)免疫組外周血淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的分類百分比，以及草魚(yú)免疫器官的肝指數(shù)、脾指數(shù)、腎指數(shù)均顯著高于對(duì)照組(P〈0.05)，由此表明維氏氣單胞菌滅活疫苗對(duì)草魚(yú)免疫保護(hù)的效果好。
[0031]以上所述僅是對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所做的任何簡(jiǎn)單修改，等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種維氏氣單胞菌漁用注射疫苗的制備方法，其特征在于按照以下步驟進(jìn)行: 步驟1:挑取維氏氣單胞菌形成的單個(gè)菌落，接種培養(yǎng)于普通肉湯培養(yǎng)基中，形成菌液，28°C培養(yǎng)12h，擴(kuò)大培養(yǎng)維氏氣單胞菌到最高峰值； 步驟2:之后用無(wú)菌槍頭吸取0.2mL菌液涂布于普通平板上培養(yǎng)，4h后用無(wú)菌生理鹽水洗下維氏氣單胞菌； 步驟3:用麥?zhǔn)媳葷岱y(cè)定維氏氣單胞菌濃度，用無(wú)菌生理鹽水稀釋維氏氣單胞菌濃度至 2.5X109CFU/mL ； 步驟4:加入0.2 %的甲醛溶液，在28°C條件下恒溫滅活24h，8000r/min離心洗滌3次，每次5min，再用無(wú)菌生理鹽水將維氏氣單胞菌濃度稀釋至IX 108CFU/mL，即為維氏氣單胞菌滅活全菌苗；置于4°C的冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>2.按照權(quán)利要求1所述維氏氣單胞菌漁用注射疫苗的使用方法，其特征在于:將制得的維氏氣單胞菌滅活疫苗采用腹腔注射的方法對(duì)健康魚(yú)類進(jìn)行免疫注射，大小規(guī)格為40-60g的魚(yú)，接種量為每尾注射0.2mL疫苗。
3.按照權(quán)利要求2所述維氏氣單胞菌漁用注射疫苗的使用方法，其特征在于:所述注射是I次免疫注射；或者在I次免疫注射后第14?28d進(jìn)行第2次免疫注射。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種維氏氣單胞菌漁用注射疫苗的制備及使用方法，維氏氣單胞菌單個(gè)菌落普通肉湯中28℃培養(yǎng)12h；用無(wú)菌槍頭吸取涂布于普通平板，4h后用無(wú)菌生理鹽水洗下維氏氣單胞菌；用無(wú)菌生理鹽水稀釋維氏氣單胞菌至2.5×109CFU/mL；加入0.2％的甲醛溶液，在28℃條件下恒溫滅活24h，8000r/min離心洗滌3次，每次5min，再用無(wú)菌生理鹽水稀釋維氏氣單胞菌至1×108CFU/mL；將制得的維氏氣單胞菌滅活疫苗采用腹腔注射的方法對(duì)健康魚(yú)類進(jìn)行免疫注射，大小規(guī)格為40-60g的魚(yú)，接種量為每尾注射0.2mL疫苗。本發(fā)明的有益效果是該疫苗能有效預(yù)防維氏氣單胞菌感染魚(yú)類，免疫效果好。
【IPC分類】A61K39-02, A61P31-04
【公開(kāi)號(hào)】CN104784683
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510114225
【發(fā)明人】鄭曙明, 吳青, 李正偉
【申請(qǐng)人】西南大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年7月22日
【申請(qǐng)日】2015年3月16日