專利名稱：一株無色桿菌及其不對稱催化還原碳碳雙鍵的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株無色桿菌并應(yīng)用該菌轉(zhuǎn)化 (Z) -3-芳基-3-氰基-丙烯酸，環(huán)狀酰亞胺和不飽和硝基化合物制備光學(xué)純?nèi)彪娮油闊N化合物的方法，是無色桿菌屬首次應(yīng)用于不對稱催化還原碳碳雙鍵。
背景技術(shù)：
光學(xué)純?nèi)彪娮油闊N化合物是有機(jī)合成中的重要合成塊，可以用來制備光學(xué)純手性藥物。碳碳雙鍵還原酶(enoate reductase)不對稱催化還原帶有強(qiáng)吸電子基團(tuán)的碳碳雙鍵，可同時得到具有一個或兩個手性中心的光學(xué)純?nèi)彪娮油闊N化合物，是廣泛用來制備手性缺電子烷烴類的方法之一(Stuermer et al. 2007 Asymmetric bioreduction of activated C = C bonds using enoate reductases from the old yellow enzyme family. [Review], Curr Opin Chem Biol 11:203-213)。近幾十年來，隨著不對稱催化還原帶有強(qiáng)吸電子基團(tuán)的碳碳雙鍵的快速發(fā)展，越來越多合成家開始關(guān)注碳碳雙鍵還原酶的新酶源的開發(fā)及底物譜的擴(kuò)增。經(jīng)過數(shù)十年的探索，已經(jīng)從許多不同的生物來源中得到了碳碳雙鍵還原酶，如高等植物(地錢，長春花，煙草，番茄等)，細(xì)菌和真菌(Toogood et al.2010 Biocatalytic Reductions and Chemical Versatility of the Old Yellow Enzyme Family of Flavoprotein Oxidoreductases. Chemcatchem 2:892-914)。由于微生物具有培養(yǎng)簡單，周期短等特點(diǎn)，所以在全細(xì)胞催化的生物轉(zhuǎn)化中，絕大數(shù)為微生物。相比之下，植物細(xì)胞培養(yǎng)比較復(fù)雜，不僅需要光照，而且周期較長，因此很少用于生物轉(zhuǎn)化中。碳碳雙鍵還原酶不對稱催化還原的底物類型主要有烯醛、烯酮、炔酮、不飽和硝基、不飽和硝基酯、不飽和腈、不飽和羧酸及其衍生物(Toogood et al.2010 Biocatalytic Reductions and Chemical Versatility of the Old Yellow Enzyme Family of Flavoprotein Oxidoreductases. Chemcatchem 2:892-914)。與生物催化羰基還原相比， 生物催化碳碳雙鍵還原的研究較少，商品化的碳碳雙鍵還原酶更少(Chaparro-Riggers et al. 2007Comparison of three enoate reductases and their potential use for biotransformations. Adv Synth Catal 349 :1521-1531)。其主要原因是酶的活力低、穩(wěn)定性差，不適合應(yīng)用。因此，新型酶源的發(fā)掘?qū)τ诎l(fā)展碳碳雙鍵還原酶具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開一株無色桿菌，該菌于2011年10月31日在中國武漢武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC M 2011369，分類命名=AchromcAacter sp. JA81，并利用該菌具有生產(chǎn)高活力、高對映選擇性的碳碳雙鍵還原酶的特性，還原底物 (Z)-3-芳基-3-氰基-丙烯酸制備光學(xué)純(R)-3-芳基-3-氰基丙酸，該(R)型產(chǎn)物是合成光學(xué)純Y-氨基丁酸的關(guān)鍵手性中間體。同時，該菌還可以催化環(huán)狀酰亞胺和不飽和硝基化合物制備光學(xué)純?nèi)彪娮油闊N類化合物。為無色桿菌首次用于不對稱催化還原碳碳雙鍵。本發(fā)明無色桿菌(AchromcAacter sp. JA81)的篩選方法
以檸檬醛和(Z)-2_苯基丁 -2-烯腈為唯一碳源對來自成都龍泉果園和四川師范大學(xué)果園的土壤樣品進(jìn)行富集，得到純培養(yǎng)菌株46株，以此46株菌株對模式底物馬來酰亞胺進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，得到活力菌株16株，將此16株菌株對目標(biāo)底物(Z) -3-苯基-3-氰基-丙烯酸進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，對目標(biāo)底物有活性的菌株進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。經(jīng)篩選得到本發(fā)明涉及的無色桿菌JA81。具體方案見實(shí)施例。以無色桿菌JA81作為生物催化劑，轉(zhuǎn)化目標(biāo)底物(Z)-3-苯基-3-氰基-丙烯酸生成相應(yīng)的(R)-3-苯基-3-氰基丙酸。具體方法如下1.菌株培養(yǎng)斜面保存培養(yǎng)基組分為胰蛋白胨lg/100mL;酵母提取物0. 5g/100mL;NaCl lg/IOOmL ；瓊脂粉 2g/100mL ；液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成為胰蛋白胨lg/100mL;酵母提取物0.5g/100mL;NaCl lg/IOOmL ；溶于去離子水，用NaOH調(diào)pH值為7. 0，105kPa，121°C，滅菌20分鐘。斜面培養(yǎng)將篩選得到的純培養(yǎng)菌株接種于斜面保存培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng) 24-48h ；種子培養(yǎng)將單菌落無菌條件下用滅菌槍頭接種于約IOml液體發(fā)酵培養(yǎng)基中， 300C，230rpm,培養(yǎng)Mh，制得種子液；搖瓶培養(yǎng)以的接種量將種子液接入新鮮的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C， 230rpm，培養(yǎng) 36h02.收集菌體取步驟(1)中的搖瓶培養(yǎng)的菌液在4°C、7000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心8 分鐘，收集菌體，并用濃度為0. 79g/100mL的生理鹽水充分洗滌2次，得到濕菌體作為生物催化劑。3.生物轉(zhuǎn)化將步驟O)中得到的濕菌體以pH7. 0,0. IM磷酸鉀緩沖液配成細(xì)胞濃度為100-300g/L的菌懸液，加入底物(Z) -3-苯基-3-氰基-丙烯酸(底物溶于二甲亞砜，用量為100g/L)，終濃度為l-10g/L，按每IOOmL加入Ig的葡萄糖和5mL的異丙醇作為輔酶再生底物。生物轉(zhuǎn)化條件為30°C，230rpm，轉(zhuǎn)化時間為48h。4.分離樣品調(diào)反應(yīng)液pH為6. 0-6. 5左右，分別用一倍體積的乙酸乙酯萃取兩次，合并有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾除去乙酸乙酯，所得產(chǎn)品經(jīng)Meglich酯化 (Neises and Steglich 1978 Simple Method for the Esterification of Carboxylic Acids. Angew Chem Int Ed 17: 522-5 )，得到甲酯化產(chǎn)物，分離純化，所得物充分溶于 ImL異丙醇(HPLC級)溶劑為備用檢測樣品。5.HPLC檢測取步驟中IyL樣品進(jìn)樣，利用手性色譜柱測定(R)_3_苯基-3-氰基丙酸甲酯的含量，最后計(jì)算ee值。檢測ee值時手性色譜柱為Daicel Chiralcel 0D_!K250X4. 6mm)，流動相正己烷異丙醇=90 10，流速0.8ml/min，(R) _3_苯基-3-氰基丙酸甲酯和(S)-3-苯基-3-氰基丙酸甲酯的保留時間分別為11. 480min和14. 809min。其反應(yīng)式如下
權(quán)利要求
1.一株無色桿菌(AchromcAacter sp.) JA81，保藏于中國武漢武漢大學(xué)，中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M 2011369。
2.以權(quán)利要求1所述的無色桿菌應(yīng)用于不對稱催化還原碳碳雙鍵的方法，其特征在于培養(yǎng)無色桿菌CCTCC M 2011369，離心收集菌體，經(jīng)生理鹽水洗滌后，獲得濕菌體，并重懸于磷酸鉀緩沖液，制成菌懸液，加入生物催化的底物，并加入葡萄糖和異丙醇作為輔酶再生底物，轉(zhuǎn)化后得產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的無色桿菌應(yīng)用于不對稱催化還原碳碳雙鍵的方法，其特征在于30°C培養(yǎng)無色桿菌CCTCC M 2011369，至36h，離心收集菌體，經(jīng)濃度為0. 79g/100mL的生理鹽水洗滌2次后，獲得濕菌體，并重懸于0. 1M、Ph6. 0 8. 0的磷酸鉀緩沖液制成細(xì)胞濃度為100-300g/L的菌懸液，加入l-10g/L生物催化的底物，并按每IOOmL加入0 IOg 的葡萄糖和0 IOmL的異丙醇作為輔酶再生底物，于30°C，230rpm，轉(zhuǎn)化4 獲得產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的無色桿菌應(yīng)用于不對稱催化還原碳碳雙鍵的方法，其特征在于所述磷酸鉀緩沖液的拖7. 0，按每IOOmL加入Ig的葡萄糖和5mL的異丙醇作為輔酶再生底物。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4所述的無色桿菌應(yīng)用于不對稱催化還原碳碳雙鍵的方法，其特征在于生物催化的底物為(Z)-3-苯基-3-氰基-丙烯酸或(Z)-3-(4-氯芳基)-3-氰基-丙烯酸或2-甲基-N-苯基-馬來酰亞胺或(E) -2-苯基-1-硝基-1-丙烯或(E)-1-苯基-2-硝基-1-丙烯或(E) -2-氰基-3-苯基-丙烯酸。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株無色桿菌(Achromobacter sp.)JA81，保藏號為CCTCC M 2011369，以及利用該無色桿菌作為生物催化劑轉(zhuǎn)化(Z)-3-芳基-3-氰基-丙烯酸，環(huán)狀酰亞胺和不飽和硝基化合物，獲得缺電子烷烴化合物的方法，而且可獲得的最高對映體過量達(dá)到＞99％，最高轉(zhuǎn)化率達(dá)到100％。本發(fā)明的催化劑無色桿菌菌體易于制備，反應(yīng)條件溫和，是綠色制造手性缺電子烷烴化合物的有效方法之一。
文檔編號C12P13/00GK102559553SQ201210004039
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月8日
發(fā)明者劉艷杰, 吳中柳, 林暉 申請人:中國科學(xué)院成都生物研究所