專利名稱：一種粘紅酵母及其在不對稱催化制備(r)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及不對稱生物催化技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種微生物新菌種粘紅酵母 (Rhodotorula mucilaginosa)CCZU-G5,以及該微生物在水/有機(jī)溶劑兩相體系中全細(xì)胞不對稱催化2-氧代-4-苯基丁酸乙酯合成(R) -2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的制備方法。
背景技術(shù)：
(R) -2-羥基-4-苯基丁酸乙酯[(R) -HPBE]是有機(jī)合成中一種重要的手性醫(yī)藥中間體，被廣泛用于賴諾普利、苯那普利、西拉普利、依那普利和雷米普利等眾多普利類血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)的合成中。這些普利類藥物通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的活性和血管緊張素的生成來產(chǎn)生降壓作用，是目前市場上最暢銷的用于治療高血壓和充血性心力衰竭等心血管疾病的藥物之一。
(R) -HPBE的制備方法主要有化學(xué)法和生物法，二者又都包括拆分和合成兩種途徑。拆分法是通過物理、化學(xué)或生物的手段將外消旋化合物分離成某單一對映體的手性化合物，但該方法需要先合成外消旋的目標(biāo)底物，然后再進(jìn)行拆分，理論產(chǎn)率不超過50%。從原子經(jīng)濟(jì)的角度來說，該方法較實(shí)用但不夠經(jīng)濟(jì)?；瘜W(xué)合成法，主要包括由手性試劑催化的不對稱還原和由手性催化劑催化的不對稱還原兩種。化學(xué)合成法原子經(jīng)濟(jì)性較高，但光學(xué)選擇性較差，副產(chǎn)物較多，污染較嚴(yán)重，且手性試劑和催化劑的價(jià)格昂貴，制備也比較困難。生物法中直接利用醇脫氫酶催化底物制備(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯，雖然具有反應(yīng)條件溫和、立體選擇性高、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，但是整個(gè)反應(yīng)過程中不僅要有酶蛋白參加反應(yīng)，而且還要添加價(jià)格昂貴的輔助因子，在實(shí)際應(yīng)用中受到一定的限制。
生物催化是利用酶或微生物細(xì)胞作為催化劑進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)的過程，具有高度的專一性、催化效率高、環(huán)境友好、操作條件溫和等優(yōu)點(diǎn)。與水相生物催化反應(yīng)相比，非水相生物催化有其獨(dú)特的優(yōu)越性，如可大幅度增加水不溶性底物和產(chǎn)物的溶解度；可改變反應(yīng)的平衡點(diǎn)，使 反應(yīng)向所期望的方向進(jìn)行；能提高有機(jī)溶劑中酶的熱力學(xué)和操作穩(wěn)定性；可減少水相中副反應(yīng)的發(fā)生；減少反應(yīng)后產(chǎn)物的分離過程等。對于微生物催化的羰基不對稱還原反應(yīng)，由于反應(yīng)需要昂貴的輔酶參與，而微生物細(xì)胞含有可以接受廣泛非天然底物的多種脫氫酶、所有必需的輔酶及其再生途徑，輔酶循環(huán)再生由細(xì)胞自動(dòng)完成。進(jìn)行不對稱還原反應(yīng)時(shí)只需加入少量的能源物質(zhì)如葡萄糖或醇類等作為輔助底物即可，同時(shí)所有的酶和輔酶處在天然的細(xì)胞環(huán)境中，可減少環(huán)境因素對酶活的影響。因此，與純酶催化相比，利用微生物全細(xì)胞進(jìn)行不對稱催化反應(yīng)具有不可比擬的優(yōu)勢。
由于生物催化高度的專一性，利用微生物全細(xì)胞催化不對稱還原，可以直接將前手性的底物直接轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物，因此全細(xì)胞催化成為國內(nèi)外研究和開發(fā)的熱點(diǎn)。同時(shí)由于2-羰基-4-苯基丁酸乙酯易于合成且價(jià)格低廉，以其為底物進(jìn)行微生物催化的不對稱還原反應(yīng)獲得具有光學(xué)活性的(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯是非常經(jīng)濟(jì)有效的制備途徑，而且反應(yīng)產(chǎn)物不易為微生物代謝所利用，用微生物活細(xì)胞催化制備(R)-2_羥基-4-苯基丁酸乙酯非常有利。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對目前(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的合成在成本，立體選擇性，產(chǎn)物產(chǎn)率，對環(huán)境的影響方面存在的缺陷，為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種可供生物轉(zhuǎn)化2-羰基-4-苯基丁酸乙酯合成(R) -2-羥基-4-苯基丁酸乙酯微生物新菌種粘紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa)CCZU_G5,以及該菌株在不對稱生物催化合成(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的應(yīng)用，該應(yīng)用在保證高產(chǎn)率和高光學(xué)純度的同時(shí)提高底物了底物的濃度，降低生物催化不對稱還原制備(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的生產(chǎn)成本，其反應(yīng)條件溫和、操作簡單、耗能少、轉(zhuǎn)化效率高、產(chǎn)物易于分離、反應(yīng)過程無污染。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是
本發(fā)明所述的粘紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa) CCZU-G5,保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中國科學(xué)院微生物研究所內(nèi)，保藏號CGMCC No. 6328，保藏日期2012年7月12日。
該粘紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa) CCZU-G5菌落特征和生化特性在光學(xué)顯微鏡下菌株呈橢圓形，瓊脂板培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出紅色，表面光滑、有光澤，質(zhì)地粘稠、邊緣整齊。
菌株來源本發(fā)明中所述的微生物菌株粘紅酵母CCZU-G5是從江蘇常州周邊油脂廠、化工廠和學(xué)校 食堂周圍采集的80份土樣中篩選得到。
將上述粘紅酵母CCZU-G5應(yīng)用于不對稱催化制備(R) -2-羥基_4_苯基丁酸乙酯中，該應(yīng)用是以2-氧代-4-苯基丁酸乙酯為底物，以粘紅酵母CCZU-G5全細(xì)胞為生物催化劑，在水/有機(jī)溶劑兩相體系中進(jìn)行微生物不對稱催化還原反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液經(jīng)過分離純化得到(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯。具體按照如下步驟進(jìn)行的
( I)粘紅酵母濕菌體的制備
將粘紅酵母CCZU-G5經(jīng)過活化培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)后得到發(fā)酵培養(yǎng)液，經(jīng)過離心得到粘紅酵母CCZU-G5濕菌體，作為全細(xì)胞生物催化劑；
(2)配制反應(yīng)體系
在有機(jī)溶劑與pH 5 9的磷酸鹽緩沖液配制成反應(yīng)體系中，加入濃度為20 100g/L的2-氧代-4-苯基丁酸乙酯作為底物，再加入一定量的輔助底物；
(3)生物催化反應(yīng)
在步驟(2)的反應(yīng)體系中加入步驟(I)所述濕菌體，在反應(yīng)溫度為20 50°C，搖床轉(zhuǎn)速100 250r/min條件下反應(yīng)I 30h ;
(4)轉(zhuǎn)化液后處理
在步驟(3)的生物催化反應(yīng)后轉(zhuǎn)化液經(jīng)過離心分離菌體，取出上層有機(jī)相，下層水相用乙酸乙酯萃取，合并萃取液和有機(jī)相，再干燥脫水過夜，將有機(jī)相用濾紙過濾，收集有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，得到無色油狀液體(R) -2-羥基-4-苯基丁酸乙酯。
作為對本發(fā)明的限定，在上述步驟(I)中活化培養(yǎng)是按以下步驟進(jìn)行的將活化培養(yǎng)基的各組分按照以下濃度配制葡萄糖10 100g/L,蛋白胨10 100g/L,酵母粉 10 100g/L，pH自然；115°C滅菌30分鐘，滅菌后冷卻，接入斜面種子，在20 40°C，搖床轉(zhuǎn)速100 250r/min的條件下培養(yǎng)I 5天，作為活化培養(yǎng)種子液。
在上述步驟(I)中發(fā)酵培養(yǎng)液是按以下步驟制備的將發(fā)酵培養(yǎng)基的各組分按照濃度濃度配制葡萄糖10 100g/L,蛋白胨10 100g/L，酵母粉10 100g/L,MgSO4O.1 lg/L, (NH4)2SO4O.1 Ig/L, K2HPO4 ·3Η20 O.1 lg/L, KH2PO4O.1 lg/L，pH 5 9，115。。滅菌30分鐘，滅菌后冷卻，按接種量體積比3 10%接種活化培養(yǎng)種子液，在溫度20 40°C， 搖床轉(zhuǎn)速100 250r/min的條件下培養(yǎng)I 5天后，得發(fā)酵培養(yǎng)液。
在上述步驟(2)中所述的有機(jī)溶劑是乙酸乙酯、乙酸丁酯、苯、甲苯、正己烷、正庚烷、正辛烷、異辛烷、壬烷或癸烷中的一種，上述產(chǎn)品均為市售分析純；在用有機(jī)溶劑與PH 5 9的磷酸鹽緩沖液配制成反應(yīng)體系時(shí)，按有機(jī)溶劑的體積百分濃度為5 80%配制成水/有機(jī)溶劑兩相體系，其中水相即指磷酸緩沖溶液。所述的磷酸緩沖溶液采用本領(lǐng)域常規(guī)的配制方法配制即可。
微生物催化的不對稱還原反應(yīng)通常需要輔酶的參與，微生物全細(xì)胞尤其是酵母細(xì)胞中含有可催化氧化還原反應(yīng)的多種脫氫酶和輔酶，用微生物整細(xì)胞作為生物催化劑可省去酶的分離純化步驟，同時(shí)不需要添加輔酶再生系統(tǒng)。但是微生物細(xì)胞中的輔酶含量有限， 添加一定量的輔助底物有利于輔酶的回收利用。因此，在上述步驟(2)中添加輔助底物，輔助底物選自乙醇、異丙醇、甘油、乳糖、蔗糖、葡萄糖中的一種，其加入量為10 100g/L。
步驟(3)中所述的濕菌體的加入量為10 100g/L。
本發(fā)明產(chǎn)物的分析方法是取(R) -2-羥基-4-苯基丁酸乙酯0. 05g,溶于乙酸乙酯中，定容至5mL,用GC-MS進(jìn)行定性分析,樣品與標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma Co.)質(zhì)譜圖對照,確定為同一物質(zhì)。步驟(3)所得轉(zhuǎn)化液經(jīng)過處理后通過氣相色譜(GC)測定產(chǎn)物濃度，再結(jié)合帶手性柱的高校液相色譜(HPLC)測定產(chǎn)物的對映體過量值(e. e.值)，確定轉(zhuǎn)化液的主要組分， 具體如下
(I)產(chǎn)物(R) -2-羥基-4-苯基丁酸乙酯產(chǎn)率測定使用日本島津GC-14C氣相色譜儀，F(xiàn)ID檢測器；毛 細(xì)管柱SE-30 (25mX0. 25mmX0. 25μπι)，色譜條件為汽化室250°C， 檢測器250°C，程序升溫160°C下保留1. 5min,以10°C /min升溫至250°C維持lOmin，以正十二烷為內(nèi)標(biāo)物，進(jìn)樣量0. 2 μ L ;柱流速2. OmL/min ;載氣H2流速30mL/min，分流比:50:1。
(2)產(chǎn)物(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯e. e.值測定使用安捷倫1260高效液相色譜儀，Chiral 0D-H柱(4. 6_X 250mm, 5 μ m),流動(dòng)相正己燒異丙醇=95:5 (V/V);進(jìn)樣量5 μ L，流速lmL/min ;柱溫20°C ;紫外檢測波長225nm。(R) -2-羥基-4-苯基丁酸乙酯e. e.值由下式計(jì)算
權(quán)利要求
1.一種粘紅酵母CCZU-G5，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏日期2012年7月12日，保藏編號CGMCC No. 6328。
2.一種如權(quán)利要求1所述的粘紅酵母CCZU-G5在不對稱催化制備(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯中的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用是以2-氧代-4-苯基丁酸乙酯為底物，以粘紅酵母CCZU-G5全細(xì)胞為生物催化劑，在水/有機(jī)溶劑兩相體系中進(jìn)行微生物不對稱催化還原反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液經(jīng)過分離純化得到(R) -2-羥基-4-苯基丁酸乙酯。
3.如權(quán)利要求2所述的粘紅酵母CCZU-G5在不對稱催化制備(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯中的應(yīng)用，其特征在于所述的生物催化劑粘紅酵母CCZU-G5全細(xì)胞來自粘紅酵母CCZU-G5經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液離心得到的濕菌體。
4.如權(quán)利要求2所述的粘紅酵母CCZU-G5在不對稱催化制備(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯中的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用具體是按照以下步驟進(jìn)行的 (1)粘紅酵母濕菌體的制備 粘紅酵母CCZU-G5經(jīng)過活化培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)后，將得到的發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)過離心得到粘紅酵母CCZU-G5濕菌體，作為全細(xì)胞生物催化劑； (2)配制反應(yīng)體系 在有機(jī)溶劑與pH 5 9的磷酸鹽緩沖液配制成反應(yīng)體系中，加入濃度為20 100g/L的2-氧代-4-苯基丁酸乙酯作為底物，再加入一定量的輔助底物； (3)生物催化反應(yīng) 在步驟(2)的反應(yīng)體系中加入步驟(I)所述濕菌體，在反應(yīng)溫度為20 50°C，搖床轉(zhuǎn)速100 250r/min條件下反應(yīng)I 30h ; (4)轉(zhuǎn)化液后處理 在步驟(3)的生物催化反應(yīng)后轉(zhuǎn)化液經(jīng)過離心分離菌體，取出上層有機(jī)相，下層水相用乙酸乙酯萃取，合并萃取液和有機(jī)相，再干燥脫水過夜，將有機(jī)相用濾紙過濾，收集有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，得到無色油狀液體(R) -2-羥基-4-苯基丁酸乙酯。
5.如權(quán)利要求4所述的粘紅酵母CCZU-G5在不對稱催化制備(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯中的應(yīng)用，其特征在于步驟(I)中活化培養(yǎng)是按以下步驟進(jìn)行的將活化培養(yǎng)基的各組分按照以下濃度配制葡萄糖10 100g/L,蛋白胨10 100g/L,酵母粉10 IOOg/L，pH自然；115°C滅菌30分鐘，滅菌后冷卻，接入斜面種子，在20 40°C，搖床轉(zhuǎn)速100 250r/min的條件下培養(yǎng)I 5天，作為活化培養(yǎng)種子液。
6.如權(quán)利要求4所述的粘紅酵母CCZU-G5在不對稱催化制備(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯中的應(yīng)用，其特征在于步驟(I)中發(fā)酵培養(yǎng)液是按以下步驟制備的將發(fā)酵培養(yǎng)基的各組分按照濃度濃度配制葡萄糖10 100g/L,蛋白胨10 100g/L,酵母粉10 IOOg/L, MgSO4O.1 lg/L, (NH4) 2S040.1 lg/L, K2HPO4 · 3H20 O.1 lg/L, KH2PO4O.1 lg/L,pH 5 9，115°C滅菌30分鐘，滅菌后冷卻，按接種量體積比3 10%接種活化培養(yǎng)種子液，在溫度20 40°C，搖床轉(zhuǎn)速100 250r/min的條件下培養(yǎng)I 5天后，得發(fā)酵培養(yǎng)液。
7.如權(quán)利要求4所述的粘紅酵母CCZU-G5在不對稱催化制備(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯中的應(yīng)用，其特征在于步驟(2)中所述的有機(jī)溶劑是乙酸乙酯、乙酸丁酯、苯、甲苯、正己烷、正庚烷、正辛烷、異辛烷、壬烷或癸烷中的一種。
8.如權(quán)利要求4所述的粘紅酵母CCZU-G5在不對稱催化制備(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯中的應(yīng)用，其特征在于步驟(2)中用有機(jī)溶劑與pH 5 9的磷酸鹽緩沖液配制成反應(yīng)體系時(shí)，有機(jī)溶劑的體積百分比為5 80%。
9.如權(quán)利要求4所述的粘紅酵母CCZU-G5在不對稱催化制備(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯中的應(yīng)用，其特征在于步驟(2)中所述的輔助底物是乙醇、異丙醇、甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖中的一種，其加入量為10 100g/L。
10.如權(quán)利要求4所述的粘紅酵母CCZU-G5在不對稱催化制備(R)_2_羥基-4-苯基丁酸乙酯中的應(yīng)用，其特征在于步驟(3)中所述的濕菌體的加入量為10 100g/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微生物新菌種粘紅酵母CCZU-G5及其在生物催化2-氧代-4苯基丁酸乙酯制備(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯中的應(yīng)用，所述的粘紅酵母CCZU-G5保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為6328。所述的方法是以2-氧代-4-苯基丁酸乙酯為底物，以粘紅酵母CCZU-G5全細(xì)胞為生物催化劑，在水/有機(jī)溶劑兩相體系中進(jìn)行微生物不對稱催化還原反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液經(jīng)過分離純化得到(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯。本發(fā)明與傳統(tǒng)方法相比，在保證高產(chǎn)率和高立體選擇性的同時(shí)提高底物的摩爾轉(zhuǎn)化率，整個(gè)反應(yīng)過程不需要添加輔酶，反應(yīng)條件溫和，操作簡單、產(chǎn)品易于分離、無副產(chǎn)物生成、對設(shè)備要求不高、環(huán)境友好且生產(chǎn)成本明顯降低，在工業(yè)上是一種能提高生產(chǎn)效益的新方法。
文檔編號C12P7/62GK102994403SQ20121029576
公開日2013年3月27日 申請日期2012年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月20日
發(fā)明者王利群, 汪云, 汪慶, 何玉財(cái), 卿青, 朱劼, 王明慧 申請人:常州大學(xué)