專利名稱：一種惡性瘧疾疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種惡性瘧疾疫苗及其制備方法，尤其涉及惡性瘧疾疫苗制備中重組質(zhì)粒和重組病毒的制備，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
瘧疾是當(dāng)今世界對(duì)人類危害最為嚴(yán)重的傳染性疾病之一。據(jù)WHO最新估計(jì)，全球每年發(fā)生3億-5億起急性感染病例，有100多萬人因這一疾病而死亡，其中大多數(shù)為非洲撒哈拉以南地區(qū)5歲以下的兒童。近年來，由于耐藥性瘧原蟲株和耐藥蚊媒的不斷產(chǎn)生和擴(kuò)散，使瘧疾控制形勢(shì)更為嚴(yán)峻。因此，研制有效的瘧疾疫苗，成為控制瘧疾的發(fā)病率和病死率迫切需要解決的課題。在眾多的瘧疾疫苗候選抗原中，惡性瘧原蟲裂殖子頂端膜抗原Kapicalmembrane antigen-1, AMA-1)在裂殖子入侵宿主紅細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用，有希望的抗瘧原蟲感染的疫苗候選分子。隨著AMAl分子生物學(xué)研究的深入，人們開始研制AMAl亞單位疫苗，目前世界上生物技術(shù)常用的生物體是大腸桿菌和酵母，用大腸桿菌表達(dá)的AMAl蛋白無免疫原性和保護(hù)性，而酵母表達(dá)AMAl也不能產(chǎn)生有效的中和抗體。哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(CHO)等表達(dá)系統(tǒng)雖然效果好，但因表達(dá)量低，同時(shí)需大量培養(yǎng)基和牛血清蛋白，成本高，不適合生產(chǎn)需要。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種克服上述缺陷的惡性瘧疾疫苗。本發(fā)明通過構(gòu)建一種家蠶重組桿狀病毒，并運(yùn)用重組桿狀病毒表面展示技術(shù)構(gòu)建表達(dá)惡性瘧原蟲主要抗原AMAl胞外域的重組桿狀病毒&iigp64AMAl，以家蠶蛹作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組桿狀病毒，并以此重組桿狀病毒作為瘧疾疫苗原生產(chǎn)疫苗，相比傳統(tǒng)疫苗生產(chǎn)具有安全性好、生產(chǎn)成本低、產(chǎn)量高、易于操作、適用于大規(guī)模生產(chǎn)的特點(diǎn)。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種家蠶重組桿狀病毒Bmgp64AMAl，該病毒于2011年12月15日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心其簡(jiǎn)稱為CGMCC(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為家蠶核型多角體病毒{Bombyx mori nucleopolyhedrovirus ), 1 ! ^% CGMCC No. 5601。上述家蠶重組桿狀病毒aiigp64AMAl的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟
(1)由PCR擴(kuò)增的方法獲得桿狀病毒囊膜蛋白gp64信號(hào)肽基因序列和桿狀病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列，分別通過I和煬ο I /歷III雙酶切插入PFastBacI載體多克隆位點(diǎn)上下游兩端構(gòu)建的表面展示載體pFaStBaCI-gp64 ；
(2)由PCR擴(kuò)增的方法獲得惡性瘧原蟲主要抗原AMAl胞外域基因序列，其5’和3’端分別引入^I和I酶切位點(diǎn)后，連接到步驟⑴所得表面展示載體pi^StBaCI-gp64，構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBacI-gp64-AMAl ；
(3)取步驟( 所得的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBaCI-gp64-AMAl轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、X-gal和IPTG的LB培養(yǎng)板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，避光培養(yǎng)4(Γ4 !后挑取白斑，培養(yǎng)2(T24h后用異丙醇抽提重組桿狀病毒基因組，并用M13通用引物做PCR鑒定；
(4)取步驟C3)鑒定成功的重組病毒基因組通過脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞，發(fā)病后獲得一代病毒懸液(T4°C保存，提取病毒基因組用M13通用引物進(jìn)行PCR鑒定，獲得所述家蠶重組桿狀病毒&iigp64AMAl。本發(fā)明還提供上述家蠶重組桿狀病毒aiigp64AMAl表達(dá)的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 4 所示。上述蛋白的制備方法包括以下步驟
將上述家蠶桿狀病毒Bmgp64AMAl感染家蠶BmN細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增；針刺接種法接入家蠶五齡幼蟲或蠶蛹；收集表達(dá)的上述蛋白。本發(fā)明進(jìn)一步提供上述重組桿狀病毒&iigp64AMAl在制備惡性瘧疾疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供上述蛋白在制備惡性瘧疾疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)效果如下
利用家蠶幼蟲、蛹作為生物反應(yīng)器，家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)具有極高臨床應(yīng)用價(jià)值瘧疾疫苗的方法，本方法適用于大規(guī)模生產(chǎn)，降低了成本，且產(chǎn)量高，所生產(chǎn)的瘧疾疫苗應(yīng)用價(jià)值大；
瘧疾疫苗尚無利用桿狀病毒表面展示技術(shù)生產(chǎn)，家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是真核表達(dá)，具有翻譯后修飾功能。AMAl胞外域蛋白的免疫原性與其正確構(gòu)型有關(guān)，利用真核表達(dá)可以具備較好的免疫原性。


圖1 融合桿狀病毒囊膜蛋白gp64信號(hào)肽和跨膜區(qū)的表面展示載體pFastBacI-gp64 ；
圖2 含有PfAMAl ectodomain的融合基因結(jié)構(gòu)示意pPolh 多角體啟動(dòng)子；SP :gp64基因的信號(hào)肽序列；PfAMAl ectodomain 惡性瘧原蟲頂端膜抗原胞外域；TM :gp64基因的跨膜區(qū)序列；Poly (A)多腺苷酸化信號(hào)；Stu I 酶切位點(diǎn)；》ιο I 酶切位點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式應(yīng)該指出，以下具體說明都是例示性的，旨在對(duì)本發(fā)明提供進(jìn)一步的發(fā)明。除非另有說明，本文使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域人員通常理解的相同含義。本發(fā)明所述惡性瘧疾疫苗的制備方法，通過PCR的方法獲得惡性瘧原蟲主要抗原AMAl胞外域基因序列(惡性瘧原蟲頂端膜抗原胞外域)，將其插入融合gp64信號(hào)肽和跨膜區(qū)的表面展示載體pFastBacI-gp64中，獲得pFastBacI-gp64_AMAl重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，通過轉(zhuǎn)座獲得重組Bacmid-AMAl，將其轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)裝配形成重組桿狀病毒&iigp64AMAl，并復(fù)制擴(kuò)增，用第三代aiigp64AMAl接種家蠶幼蟲，蛹，經(jīng)5-7天后收集幼蟲體液和蛹體，勻漿、離心、分離純化，冷凍干燥，無菌條件下制成惡性瘧疾疫苗凍干粉實(shí)現(xiàn)。下面結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)闡述本發(fā)明的具體內(nèi)容。實(shí)施例1 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBacI-gp64_AMAl的構(gòu)建
以桿狀病毒gp64序列為模板，分別用引物PI、P2和P3、P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增gp64的信號(hào)肽(SP)序列和跨膜區(qū)序列01)』0 產(chǎn)物通過及 !! I/EcoR I和煬ο I /Λ /7 /ΙΙΙ雙酶切插入PFastBacI載體多克隆位點(diǎn)上下游兩端，構(gòu)建展示載體pFStBaCI-gp64(載體結(jié)構(gòu)如圖1所示)。然后以惡性瘧原蟲3D7標(biāo)準(zhǔn)株cDNA為模板，用引物P5、P6進(jìn)行PCR擴(kuò)增惡性瘧原蟲頂端膜抗原胞外域AMAl ectodomain，PCR產(chǎn)物通過Sto I和ZAo I雙酶切插入表面展示載體pFastBacI-gp64，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacI-gp64-AMAl。該重組轉(zhuǎn)移載體包括多角體啟動(dòng)子(pPolh)、gp64信號(hào)肽(SP)和跨膜區(qū)(TM)、惡性瘧原蟲頂端膜抗原AMAl胞外域(PfAMAl ectodomain)，結(jié)構(gòu)如圖 2 所示，將含有 PfAMAl ectodomain (融合有 gp64 )的通過Mu I和B10 I插入到多角體啟動(dòng)子下，利用該多角體啟動(dòng)子啟動(dòng)AMAl融合基因的表達(dá)，使融合蛋白N端具有信號(hào)肽(SP)，C端具有跨膜區(qū)(TM)，由于該啟動(dòng)子屬于極晚期基因啟動(dòng)子且為強(qiáng)啟動(dòng)子，即使融合蛋白是對(duì)桿狀病毒和宿主細(xì)胞有毒性的蛋白，由于以該啟動(dòng)子啟動(dòng)融合基因表達(dá)時(shí)病毒粒子已經(jīng)形成，所以融合蛋白也可以得到高效、大量地表達(dá)。惡性瘧原蟲頂端膜抗原胞外域(PfAMAl)通過桿狀病毒囊膜蛋白gp64的信號(hào)肽(SP)引導(dǎo)和跨膜區(qū)(TM)錨定展示于桿狀病毒表面，形成刺猬狀(偽病毒)，末端的多腺苷酸化信號(hào)PolyA對(duì)融合蛋白的翻譯有重要作用。引物序列設(shè)計(jì)如下
Psp 1CGC.GGATCC ATGGTAGGCGCTATTGTTTXATAC'GTG
CTTTTGGC'CjGC" GGfsp 1 -40)
Psp2C GAC GTAGGCCTTTGAATTCTfba C4054-40DCGC. CG
Panxa6 CCGC"TC'GAGTTT€ATTTTATCAX4ACt(l)gp64信號(hào)肽(SP)的擴(kuò)增以gp64 DNA為模板，PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)計(jì)為，94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，68°C復(fù)性延伸30s, 30個(gè)循環(huán)，68°C延伸5min。
在一個(gè)無菌的0. 5ml離心管中，混合下列成分IOXPCR Buffer10 μ 125mmol MgCl28μ 1
2. 5 mmol dNTPs8μ 1
Pspl1 μ 1
Psp21 μ 1
模板1 μ 1
KOD-Plus DNA 聚合酶 1 μ 1 加無菌雙蒸水至100 μ 1
各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計(jì)30個(gè)循環(huán)。待反應(yīng)結(jié)束后，電泳鑒定擴(kuò)增片斷，同時(shí)切膠回收目的片斷。(2) gp64跨膜域(TM)的擴(kuò)增
以gp64 DNA為模板，PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)計(jì)為，94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，68°C復(fù)性延伸30s, 30個(gè)循環(huán)，68°C延伸5min。100 μ 1的反應(yīng)體系同上，所用引物為Ptm3和Ptm4，各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計(jì)30個(gè)循環(huán)。待反應(yīng)結(jié)束后，電泳鑒定擴(kuò)增片斷，同時(shí)切膠回收目的片斷。(3) AMAl ectodomain 基因的擴(kuò)增
以惡性瘧原蟲3D7標(biāo)準(zhǔn)株cDNA為模板，PCR反應(yīng)參數(shù)為94°C預(yù)變性5min，94°C變性45s，53°C退火30s，68°C復(fù)性延伸90s, 35個(gè)循環(huán)，68°C延伸IOmin。在一個(gè)無菌的0. 5ml離心管中，混合下列成分10XPCR Buffer5μ 1
2. 5mmol MgSO42μ 1
2.5 mmol dNTPs5 μ 1
Pamal1. 5 μ 1
Pama21. 5 μ 1
模板1 μ 1
KOD-Plus DNA 聚合酶 1 μ 1加無菌雙蒸水至50 μ 1
各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計(jì)35個(gè)循環(huán)。待反應(yīng)結(jié)束后，電泳鑒定擴(kuò)增片斷，同時(shí)切膠回收目的片斷。(4)重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒構(gòu)建
將上述PCR擴(kuò)增獲得的gp64的信號(hào)肽(SP)序列和跨膜區(qū)序列(TM)分別通過BamHI、EcoR I和Xho I、HindIII (購自Fermentas公司)雙酶切插入pFastBacI載體(購自hvitrogen公司)多克隆位點(diǎn)上下游兩端，構(gòu)建展示載體pFstBaCI-gp64。然后將AMAlectodomain的PCR產(chǎn)物通過Mu I和Β ο I (購自！^ermentas公司)雙酶切插入展示載體pFastBacI-gp64,構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBacI-gp64_AMAl。通過酶切分析、雙向測(cè)序鑒定基因序列正確。實(shí)施例2 家蠶重組桿狀病毒aiigp64AMAl的獲得
鑒定重組成功的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBacI-gp64-AMAl轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞(購自hvitrogen公司)，在含有卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、X_gal和IPTG的LB培養(yǎng)板(購自上海生工生物公司)上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，避光培養(yǎng)4 后挑取白斑，培養(yǎng)24h后用異丙醇抽提重組桿狀病毒基因組，并用M13通用引物做PCR鑒定。鑒定成功的重組病毒基因組通過脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞(購自hvitrogen公司)(方法參照hvitrogen 公司脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin II Reagent說明書)，發(fā)病后(顯微鏡觀察)獲得一代病毒懸液4°C保存，提取病毒基因組用M13通用引物鑒定，獲得所述家蠶重組桿狀病毒株 Bmgp64AMAl0實(shí)施例3 =AMAl融合蛋白在家蠶5齡幼蟲和蛹中的表達(dá)
將家蠶重組桿狀病毒&iigp64AMAl以10M0I病毒感染BmN細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增，按 IX 10PFU/條針刺接種法接入家蠶五齡幼蟲或蠶蛹(購自浙江中奇生物藥業(yè)股份有限公司)，感染5-7天后，采取幼蟲體或蛹體勻漿，經(jīng)高速離心(12000rpm，30min)，取上清，檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)。高速離心后的上清加入等體積的2X蛋白質(zhì)上樣緩沖液(IOOMm Tris HC1，4%SDS，0. 15% 溴酚藍(lán)，10% 甘油)，100°C加熱 IOmin,取 20 μ 1 進(jìn)行 SDS-PAGE 分析，結(jié)果表明，該家蠶重組桿狀病毒已表達(dá)AMAl融合蛋白，蛋白測(cè)序結(jié)果顯示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4 所示。實(shí)施例4 惡性瘧疾疫苗的獲得
(1)從蠶蛹中分離純化AMAl融合蛋白(惡性瘧疾疫苗)
a.取500g經(jīng)&iigp64AMAl感染的蠶蛹樣品，4°C解凍后，與IL滅菌ddH20混合，勻漿至漿液細(xì)致均勻即可；
b.將約1.3L勻漿液加入500ml離心管中，配平，8000rpm離心30min，取上清，小心棄
去油脂；
c.將8000rpm離心上清液倒入50ml離心管，配平，12000rpm離心30_120min，取上清，
棄油脂；
d.將12000rpm離心上清液倒入50ml離心管，配平，15000rpm離心30_120min，取上清，
棄油脂；
e.將15000rpm離心上清液倒入50ml離心管，配平，18000rpm離心30_120min，取上清，
棄油脂；
f.ISOOOrpm離心后的上清，在超凈臺(tái)上分裝于滅菌的超離管中，用注射器趕走管內(nèi)氣泡，平衡，放入日立CP70MX離心機(jī)中，35000rpm離心30_90min ；
(2)超濾
收集35000rpm離心后上清液(約500mL)，用截留分子量為300KD的中空纖維膜進(jìn)行超濾，不斷加入無菌水，所用無菌水體積約為樣品的10倍，整個(gè)超濾過程均在4°C環(huán)境下操作。(3)疫苗效果
惡性瘧疾疫苗進(jìn)行動(dòng)物體中試驗(yàn)，免疫動(dòng)物為新西蘭雄兔(購自天津市奧臣實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銷售有限公司，11周齡，2. 3kg)，皮下注射，注射劑量為0. l-50mg/kg，2-4周后檢測(cè)抗體效價(jià)，其保護(hù)抗體效價(jià)大于1 :150，攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示該劑量(0. l-50mg/kg)疫苗能產(chǎn)生中和抗體并具有明顯抵抗病毒的效果。惡性瘧疾疫苗進(jìn)行惡性瘧原蟲(云南昆明醫(yī)學(xué)院)侵染實(shí)驗(yàn)，其保護(hù)抗體效價(jià)大于1 :150，并具有明顯抵抗瘧原蟲侵染的效果。以上所述，僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)中的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的核心技術(shù)特征的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些潤(rùn)飾和改進(jìn)也應(yīng)屬于本發(fā)明的專利保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種家蠶重組桿狀病毒angp64AMAl，該病毒保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 5601。
2.—種權(quán)利要求1所述家蠶重組桿狀病毒Bmgp64AMAl的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(1)由PCR擴(kuò)增的方法獲得桿狀病毒囊膜蛋白gp64信號(hào)肽基因序列和桿狀病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列，分別通過1/EcoR I和損οIII雙酶切插入PFastBacI載體多克隆位點(diǎn)上下游兩端構(gòu)建的表面展示載體pFaStBaCI-gp64 ；(2)由PCR擴(kuò)增的方法獲得惡性瘧原蟲主要抗原AMAl胞外域基因序列，其5’和3’端分別引入^I和I酶切位點(diǎn)后，連接到步驟(1)所得表面展示載體pFastBaCI-gp64，構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBacI-gp64-AMAl ；(3)取步驟( 所得的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBaCI-gp64-AMAl轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，在含有卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、X-gal和IPTG的LB培養(yǎng)板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，避光培養(yǎng)4(Γ4 !后挑取白斑，培養(yǎng)2(T24h后用異丙醇抽提重組桿狀病毒基因組，并用M13通用引物做PCR鑒定；(4)取步驟C3)鑒定成功的重組病毒基因組通過脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞，發(fā)病后獲得一代病毒懸液(T4°C保存，提取病毒基因組用M13通用引物進(jìn)行PCR鑒定，獲得所述家蠶重組桿狀病毒&iigp64AMAl。
3.—種權(quán)利要求1所述的家蠶重組桿狀病毒Bmgp64AMAl表達(dá)的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 4 所示。
4.一種權(quán)利要求3所述蛋白的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(1)將權(quán)利要求1所述的重組桿狀病毒Bmgp64AMAl感染家蠶BmN細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)增；(2)針刺接種法接入家蠶五齡幼蟲或蠶蛹；(3)收集表達(dá)的權(quán)利3所述蛋白。
5.一種權(quán)利要求1所述重組桿狀病毒Bmgp64AMAl在制備惡性瘧疾疫苗中的應(yīng)用。
6.一種權(quán)利3所述蛋白在制備惡性瘧疾疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種惡性瘧疾疫苗及其制備方法，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過構(gòu)建一種家蠶重組桿狀病毒，并運(yùn)用重組桿狀病毒表面展示技術(shù)構(gòu)建表達(dá)惡性瘧原蟲主要抗原AMA1胞外域的重組桿狀病毒，以家蠶蛹作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)該重組桿狀病毒，并以此重組桿狀病毒作為瘧疾疫苗原生產(chǎn)疫苗。相比傳統(tǒng)疫苗生產(chǎn)具有安全性好、生產(chǎn)成本低、產(chǎn)量高、易于操作、適用于大規(guī)模生產(chǎn)的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/866GK102559613SQ20121000557
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月10日
發(fā)明者張耀洲, 申俊, 舒特俊, 陳劍清 申請(qǐng)人:特菲(天津)生物醫(yī)藥科技有限公司