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      葉綠體衍生的人類瘧疾疫苗抗原的制作方法

      文檔序號:1146655閱讀:311來源:國知局

      專利名稱::葉綠體衍生的人類瘧疾疫苗抗原的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      :本發(fā)明涉及傳染病領(lǐng)域,更具體說,涉及媒介傳播疾病瘧疾和植物中表達(dá)的免疫原性瘧疾抗原。
      背景技術(shù)
      :瘧疾是媒介傳播的原蟲疾病。瘧原蟲屬的四個不同的種影響人類(惡性瘧原蟲(P.falciparum)、間日瘧原蟲(P.vivax)、三日瘧原蟲(P.malariae)和卵形瘧原蟲(P.ovale)),惡性瘧原蟲是最有致病力的種,導(dǎo)致世界上發(fā)病和死亡的大部分。超過20億人處于瘧疾風(fēng)險中,每年有大約5億病例和100萬死亡,主要是撒哈拉以南非洲(sub-SaharanAfrica)的兒童(Greenwood,Fidock等.2008;Langhorne,Ndungu等.2008)。數(shù)十年來,瘧疾一直是國際衛(wèi)生界突出的公共衛(wèi)生問題,急需建立有效的瘧疾控制計劃(Greenwood,Bojang等.2005)。瘧原蟲的生命周期瘧疾寄生蟲在雌瘧蚊(Anophelesmosquitoes)中繁殖并在蚊子食血時被傳遞給人。當(dāng)蚊子刺穿真皮食血時,瘧原蟲子孢子和唾液一起進(jìn)入血流,遷移至肝,在那里穿透肝細(xì)胞,其中寄生蟲擴(kuò)增持續(xù)2至9天,因此是紅細(xì)胞外周期(Langhorne,Ndungu等.2008)。寄生蟲在活細(xì)胞破裂后分化為成千上萬的裂殖子,屆時,裂殖子侵入紅細(xì)胞(RBC)并開始生命周期的無性紅細(xì)胞內(nèi)期。在RBC中,在用適當(dāng)染料(例如Giemsa染料)處理的血涂片中,發(fā)育中的寄生蟲顯微鏡顯示為細(xì)胞內(nèi)的小環(huán)。寄生蟲的環(huán)階段在RBC內(nèi)產(chǎn)生營養(yǎng)子,最終成熟為裂殖體階段,根據(jù)其根據(jù)瘧原蟲的種而在大約每48至72小時的波浪中破裂并釋放裂殖子(Langhorne,Ndimgu等.2008)。這些血液階段寄生蟲的釋放是疾病的臨床表現(xiàn)(例如高燒和寒戰(zhàn))的主要原因。一些釋放的寄生蟲發(fā)育成性紅細(xì)胞雄性(小配子母細(xì)胞)和雌性(大配子母細(xì)胞)配子母細(xì)胞,其之后在蚊子食血并吞入配子母細(xì)胞時相遇融合以形成動合子。當(dāng)寄生蟲在蚊子腸內(nèi)繁殖時開始了孢子生殖周期。動合子在蚊子中腸壁中發(fā)育成囊合子。這些囊合子生長、破裂并釋放子孢子,子孢子遷移至蚊子唾液腺。它們?nèi)缓鬁?zhǔn)備感染新的人類宿主而繼續(xù)瘧疾生命周期。瘧疾的臨床表現(xiàn)瘧疾的最普通癥狀包括流感樣病,伴有發(fā)燒、戰(zhàn)栗、嘔吐、關(guān)節(jié)痛、肌肉痛和頭痛。瘧疾的經(jīng)典癥狀是如下周期突如其來的戰(zhàn)栗寒冷,隨后發(fā)燒,然后持續(xù)6至10小時的出汗。該周期定期重復(fù),由于瘧原蟲無性紅細(xì)胞內(nèi)期的釋放。瘧疾患者經(jīng)歷的其他癥狀包括眩暈、乏力、肌痛、腹痛、輕度腹瀉和干咳。重癥瘧疾的致病生物體通常是惡性瘧原蟲(P.falciparum),后果包括昏迷和死亡(如果未治療)。重癥瘧疾的其他并發(fā)癥可以發(fā)生,并且包括脾大、腦缺血、肝大、低血糖癥、血紅蛋白尿、腎衰竭、肺水腫和酸中毒。幼兒和懷孕婦女以及免疫缺乏或降低的個體最容易受到重癥瘧疾的傷害,典型例子是HIV患者。重癥瘧疾被認(rèn)為是醫(yī)療突發(fā)事件并且應(yīng)該緊急治療,因為它能夠在數(shù)小時或數(shù)天內(nèi)快速發(fā)展為死亡(Trampuz,Jereb等.2003)。瘧疾的診斷和治療瘧疾病例數(shù)不斷增加,藥物抗性是普遍的,因此迅速診斷是減少發(fā)病率和致死率所必要的(Yamey2004)?;颊吲R床診斷包括檢查患者的癥狀,但是實驗室觀點的“金標(biāo)準(zhǔn)”是通過顯微鏡檢查來檢查Giemsa染料染色的血涂片(lcke,Davis等.2005)。如果顯微鏡和染色試劑不可獲得并缺乏高質(zhì)量的顯微鏡,可以在診斷中使用現(xiàn)代抗原檢測試劑盒(例如“浸漬片”)和分子技術(shù)作為替代(Greenwood,Bojang等·2005)(lcke,Davis等·2005)。使用抗原檢測試劑盒和分子實踐產(chǎn)生了幾個問題,例如成本效益比、結(jié)果準(zhǔn)確性和現(xiàn)場條件下足夠的表現(xiàn)。瘧疾必須無耽擱地被發(fā)現(xiàn),以治療患者并防止進(jìn)一步的疾病傳播。瘧疾的治療可以不用住院而進(jìn)行,但如果重癥瘧疾持續(xù),則如果可能應(yīng)該建議住院。幾種抗瘧疾藥物可用于治療,例如氯喹、磺胺多辛-乙胺嘧啶、甲氟喹、奎寧和強(qiáng)力霉素,但組合治療是理想的。藥物組合是優(yōu)選的,因為不同的作用方式可以組合而幫助抑制藥物抗性寄生蟲的出現(xiàn)(Greenwood,Bojang等.2005)。當(dāng)治療瘧疾患者時應(yīng)該考慮許多因素,例如感染寄生蟲的種、人口區(qū)域、成本、懷孕、預(yù)存條件和藥物過敏。對瘧疾疫苗的需求用蚊帳和驅(qū)蟲劑以及噴灑殺蟲劑防治蚊子叮咬可以減少瘧疾傳播或?qū)Π嘿F預(yù)防藥物的需求,然而寄生蟲再現(xiàn)持續(xù)。再現(xiàn)的原因包括對普通抗瘧疾藥(例如氯喹、抗葉酸劑、磺胺多辛和蒿素)的藥物抗性;蚊子對廣泛使用的殺蟲劑的抗性;制藥行業(yè)開發(fā)新藥的興趣缺乏;有效控制措施執(zhí)行的缺乏;旅游業(yè)增加;和無免疫人群向瘧疾流行區(qū)的遷移(Aide,Bassat等.2007)(Hyde2007)。有效減少巨大疾病負(fù)擔(dān)的傳統(tǒng)公共衛(wèi)生工具是開發(fā)有效的抗瘧疾疫苗(Doolan和Stewart2007)。接種是預(yù)防疾病傳播的最有效方式之一,在減少新感染中是成本有效的,并且容易施用。當(dāng)開發(fā)有效疫苗時產(chǎn)生許多憂慮。例如,抗原瘧原蟲的復(fù)雜性貫穿其生命周期的不同階段,寄生蛋白的高多態(tài)性,沒有合適的動物模型來測試疫苗效力,設(shè)計疫苗的高成本,疫苗在由制藥公司上市之前的開發(fā)時長(Aide,Bassat等.2007)。目前,還沒有許可的有效疫苗用于預(yù)防瘧疾。假設(shè),預(yù)防瘧疾進(jìn)展的期望的疫苗將含有來自生命和周期不同階段的多抗原。瘧疾疫苗是可行的有四種主要的理由支持瘧疾疫苗是可行的觀點(Aide,Bassat等.2007)。生活在流行區(qū)的個體通過產(chǎn)生針對重癥瘧疾的部分免疫性而進(jìn)行性地表現(xiàn)自然獲得性免疫性(Gupta,Snow等.1999)。個體依然可以被瘧疾感染,但由于寄生蟲血癥被抑制至不可檢測的水平而不存在臨床表現(xiàn)和癥狀(Webster和Hill2003)??贵w從免疫瘧疾患者被動傳遞或在環(huán)孕期間母體傳遞分別保護(hù)了暴露于寄生蟲的患者(Sabchareon,Burnouf等.1991)或新生兒(Ballou,ArevaloHerrera等.2004)。十九世紀(jì)七十年代,對暴露于UV輻射的弱化的子孢子并用正常子孢子再次激發(fā)的非免疫志愿者進(jìn)行實驗,90%病例表現(xiàn)出短命的免疫性(Rieckmarm,Beaudoin等.1979)。幾項研究報道了最近開發(fā)的保護(hù)性瘧疾疫苗候選物在人類中的效力。瘧疾疫苗的靶由于瘧疾生命周期復(fù)雜性,疫苗可以靶向開始于初始紅細(xì)胞外期的不同的階段。疫苗開發(fā)和子孢子和肝階段寄生蟲的特定靶向的最終目標(biāo)是通過防止入侵肝細(xì)胞或抑制寄生蟲在肝細(xì)胞中發(fā)育而完全預(yù)防感染(Greenwood,F(xiàn)idock等.2008)。該階段引發(fā)的抗體將殺傷子孢子或阻斷肝細(xì)胞入侵。破壞性寄生蟲在感染的肝細(xì)胞中發(fā)育將涉及細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的溶解。最早和現(xiàn)在最前沿的前紅細(xì)胞研究疫苗候選物利用環(huán)子孢子蛋白(CSP)作為靶,因為它是該階段最豐富的表面抗原(Greenwood,Bojang等.2005)。利用GSP的當(dāng)前疫苗試驗設(shè)計了與乙型肝炎表面抗原和三組分佐劑AS02的雜交體,稱為RTS.S/AS02A,但是僅提供了短期保護(hù)(Greenwood,Bojang等.2005)。臨床試驗中的其他抗原包括TRAP和LSA,但具有令人失望的結(jié)果(Maher2008)。疫苗開發(fā)中的另一個策略可以靶向生命周期的第二期,紅細(xì)胞內(nèi)期,還稱為無性血期。該階段靶向疫苗被設(shè)計為預(yù)防疾病而非最初的感染,通過減少循環(huán)血階段寄生蟲的數(shù)目(Greenwood,F(xiàn)idock等.2008)。該疫苗可以預(yù)防裂殖子繁殖或入侵RBC,目前研究主要集中在紅細(xì)胞入侵涉及的抗原(Greenwood,Bojang等.2005)??贵w可以被引出以在裂殖體破裂之前凝集裂殖子或阻斷入侵RBC。目前的臨床試驗正在觀察幾種血液階段候選物例如AMA-I、MSP-1和RESA(Greenwood,Bojang等.2005)(Maher2008)。疫苗開發(fā)的最終方法是靶向開發(fā)中的最后階段,稱為有性期。靶向該階段的疫苗,還稱為阻斷傳播,在減少宿主之間寄生蟲傳播中是重要的,通過防止進(jìn)食蚊子被感染或通過干擾蚊子中腸中配子母細(xì)胞的有性融合(Greenwood,Bojang等.2005)(Saxena,Wu等.2007)。這是提供保護(hù)的間接方法,但是其幫助減少社區(qū)疾病傳播(Greenwood,F(xiàn)idock等.2008)??贵w可以被誘導(dǎo)殺傷配子母細(xì)胞,干擾配子母細(xì)胞的受精,防止接合子轉(zhuǎn)化成動合子,或阻礙動合子排出成為有活力的子孢子。使用傳播阻斷疫苗的方法通常與靶向其他階段的其他疫苗組合(Greenwood,F(xiàn)idock等.2008)。目前對傳播阻斷疫苗候選物的研究包括Pfs25/28、Pfs48/45和Pfs230(Greenwood,Bojang等.2005)(Saxena,Wu等.2007),并且可以在減少群體傳播中起作用。頂膜抗原-1(AMA-I)AMA-I是最重要的有性血液階段疫苗候選物(Good,Kaslow等.1998),因為它在瘧原蟲寄生蟲入侵中起關(guān)鍵作用。AMA-I是I型整合膜蛋白(Remarque,F(xiàn)aber等.2008),并且最初作為83kDa前體蛋白傳遞至微線體,并且在輸出至裂殖子表面之前被酶解加工為PfAMA-166。涉及AMA-1,其在與作為頂端細(xì)胞器的裂殖子再適應(yīng)中和入侵期間RBC膜對齊中起作用(Mitchell,Thomas等.2004)。動物和體外研究支持AMA-I在RBC入侵期間的關(guān)鍵作用,例如通過生長抑制分析抑制入侵的抗AMA-I抗體(Hodder,Crewther等.2001),抗體介導(dǎo)的抗原加工的抑制(Dutta,Haynes等.2003),通過血清流行病學(xué)調(diào)查在暴露個體中發(fā)現(xiàn)的抗AMA-I抗體(Thomas,Trape等.1994),并且AMA-I在免疫研究中賦予保護(hù)(Narum,Ogun等.2000)。使用AMA-I作為疫苗候選物的重要問題是其是高度多態(tài)性的(Healer,Murphy等.2004),并且這降低了對抑制性抗體作用的敏感性。即使AMA-I表現(xiàn)出高多態(tài)性,但C端區(qū)是高度保守的,并且可以被抑制性抗體阻斷。AMA-I不僅存在于無性血液階段裂殖子,而且還由子孢子和活階段裂殖子表達(dá)(Remarque,Faber等.2008)。作為疫苗候選物的靶向AMA-I不僅可以降低導(dǎo)致臨床疾病的瘧疾感染的風(fēng)險,而且降低細(xì)胞免疫性被刺激的可能性和紅細(xì)胞外生存力的降低。目前文獻(xiàn)明確支持AMA-I作為疫苗組分的觀點和潛力。裂殖子表面抗原-1(MSP-I)MSP-I也是另外一種最重要的無性血液階段疫苗候選物(Siddiqui,Tarn等.1987),并且被提出以在RBC的寄生蟲入侵中起作用(Blackman,Heidrich等.1990)。MSP-I是裂殖子表面發(fā)現(xiàn)的195kDa糖蛋白(Mehrizi,Zakeri等.2008),其經(jīng)歷進(jìn)入RBC的兩次蛋白水解裂解。第一次裂解發(fā)生在裂殖子從感染的RBC釋放時,導(dǎo)致四個多肽片段(83、30、38和42kDa),并且第二次裂解發(fā)生在RBC入侵期間,并且包括被裂解成33和19kDa多肽的C端43kDa片段(Mehrizi,Zakeri等·2008)。MSP-I19在RBC入侵發(fā)生時通過GPI尾保持錨定于裂殖子(Chenet,Branch等.2008)。MSP-I19的C端部分是一些mAb的靶,因為它們抑制寄生蟲的體外生長(Uthaipibull,Aufiero等.2001),并且顯示提供保護(hù)性免疫性(0,Donnell,deKoning-Ward等·2001)?;贛SP-1(包括MSP-142和MSP-I19)的C端區(qū)的疫苗在Aotus猴中寄生蟲激發(fā)后提供保護(hù)(Chang,Case等.1996)(Kumar,Yadava等.1995),顯示抗體抑制RBC入侵和寄生蟲生長(Chang,Case等.1996)(Blackman,Heidrich等.1990),并且抗MSP-I19與臨床免疫性相關(guān),具有降低的寄生蟲數(shù)目和熱性病(Branch,Udhayakumar等.1998)。無性階段疫苗開發(fā)的限制性因素在于,在不同地理區(qū)域分離的MSP-I寄生蟲的C端片段展現(xiàn)出序列變化(Mehrizi,Zakeri等.2008)。研究提供了使用MSP-I作為潛在的有前途的瘧疾疫苗抗原的見解。發(fā)明_既述考慮到上述,本發(fā)明有利地提供經(jīng)質(zhì)體轉(zhuǎn)化而在植物中表達(dá)的瘧疾抗原。用于本發(fā)明的優(yōu)選植物包括煙草和萵苣以及其他食用植物。根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的瘧疾抗原通過皮下注射或通過攝入精細(xì)加工的葉綠體轉(zhuǎn)基因組織而口服遞送至易感受治療者以評價它們誘導(dǎo)免疫反應(yīng)和防范瘧疾感染的效力。初步研究考察了在小鼠中表達(dá)免疫原性瘧疾抗原的可行性。如臨時申請序號60/984,111(其通過引用整體并入本文)中描述的,瘧疾小鼠菌株約式瘧原蟲(Plasmodiumyoelii)的裂殖子表面蛋白-I(MSP-I)基因被克隆進(jìn)有效轉(zhuǎn)化煙草植物普通煙草(Nicotianstabacum)中的質(zhì)體基因組的載體。裂殖子表面蛋白I(MSPl)的C端蛋白在紅細(xì)胞內(nèi)期表達(dá)在寄生蟲表面,被認(rèn)為是抑制寄生蟲侵入RBC的潛在疫苗候選物。由于葉綠體基因工程提供的各種優(yōu)點,PyMSPl19已經(jīng)通過葉綠體轉(zhuǎn)化而表達(dá)在煙草中,例如轉(zhuǎn)基因的超表達(dá)、多基因工程、位置效應(yīng)和基因沉默的缺乏、轉(zhuǎn)基因的母體遺傳、等等。PyMSPl19基因在葉綠體基因組內(nèi)的位點特異性整合通過使用特異性引物的PCR確定,通過Southern印跡確定同質(zhì)性對異質(zhì)性的百分比。Western印跡分析顯示還原條件下17kDa蛋白,轉(zhuǎn)基因系中PyMSPl19蛋白表達(dá)水平升至成熟葉中總可溶性蛋白(TSP)的2%。為了測試葉綠體衍生蛋白的功能性,小鼠用含有弗氏佐劑的富集葉綠體衍生的PyMSPl19蛋白免疫,它們顯示17000抗體滴度。經(jīng)免疫的小鼠用約式瘧原蟲感染的紅細(xì)胞(35-40%寄生蟲)激發(fā),百分比寄生蟲表明與免疫滴度負(fù)相關(guān)。對煙草植物的擴(kuò)展研究產(chǎn)生了表達(dá)與跨粘膜載體霍亂毒素B亞基(CTB-AMA-I)和CTB_MSP_1融合的瘧疾抗原的煙草植物的葉綠體轉(zhuǎn)基因系。CTB-AMA-I和CTB-MSP-I分別聚集達(dá)到總可溶性蛋白的9.5%和2%。葉綠體衍生的CTB-AMA-1、CTB-MSP-I或兩種抗原被口服或通過皮下注射施用至BALB/c小鼠。發(fā)現(xiàn)實驗動物的免疫反應(yīng)與對照動物相比是顯著的。使用免疫熒光分析(IFA)和免疫印跡,免疫小鼠血漿中發(fā)現(xiàn)的抗AMA-I和抗MSP-I分別識別天然寄生蟲和天然寄生蟲蛋白。體外寄生蟲抑制分析證明,抗瘧疾抗體抑制寄生蟲侵入紅細(xì)胞。這些考察的結(jié)果可以導(dǎo)致在發(fā)展中國家非常需要的成本有效的瘧疾疫苗??汞懠惨呙绲闹参镂覀冋J(rèn)為,需要制備有效增強(qiáng)表達(dá)水平和潛在防范瘧疾感染的疫苗的替代方法。其他表達(dá)系統(tǒng)(例如酵母、細(xì)菌和桿狀病毒)的使用具有幾個缺點,例如重組蛋白的不正確折疊、低收率和昂貴的生產(chǎn)程序。認(rèn)為植物是最佳表達(dá)系統(tǒng),因為它們可以減少純化、加工、冷藏和運輸?shù)某杀?Ruhlman,Ahangari等.2007)。煙草基因操作產(chǎn)生大生物質(zhì),成功可推廣至食用作物,例如胡蘿卜、西紅柿或萵苣。已經(jīng)顯示植物衍生疫苗的口服遞送誘導(dǎo)粘膜免疫和系統(tǒng)免疫(Verma和Daniell2007)(Nochi,Takagi等.2007)。植物基因工程可建立成本有效的疫苗開發(fā)方法,用于瘧疾感染最嚴(yán)重的貧窮的發(fā)展中國家。葉綠體基因工程的優(yōu)點許多作物種類已經(jīng)被基因改良而通過核基因組表達(dá)人類治療性蛋白,但外源蛋白表達(dá)水平一般不足以有效純化和口服遞送。葉綠體基因工程已成為目標(biāo)方法來克服使用核轉(zhuǎn)化的擔(dān)心,例如由于每細(xì)胞數(shù)千基因組的外源蛋白的高水平表達(dá)(DeCosa,Moar等.2001)(Daniell,Khan等.2002)、基因節(jié)制(Daniell2002)(Daniell和Parkinson2003)、基因沉默和位置效應(yīng)(DeCosa,Moar等.2001)、多效性效應(yīng)(Daniell,Lee等·2001)和單次轉(zhuǎn)化事件中多基因表達(dá)(Daniell和Dhingra2002)(DeCosa,Moar等.2001)。葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)出現(xiàn)在下述進(jìn)展中藥物,例如疾病抗性表達(dá)蛋白(DeGray,Rajasekaran等.2001)、生物藥物(Staub,Garcia等.2000)(Fernandez-SanMillan,Mingo-Castel等.2003)和疫苗(Daniell,Streatfield等.2001);和農(nóng)業(yè),例如殺蟲劑(Daniell,Datta等.1998)和抗蟲性(Kota,Daniell等.1999),和轉(zhuǎn)基因植物中毒性金屬的植物修復(fù)(Ruiz,Hussein等.2003)(Hussein,Ruiz等.2007)。基因工程通過與葉綠體基因組的基因間區(qū)同源重組而穩(wěn)定整合外源基因的側(cè)翼序列而實現(xiàn)(Kumar和Daniell2004)。質(zhì)體轉(zhuǎn)化和葉綠體基因工程的使用允許外源基因以口服遞送疫苗的最佳水平表達(dá)。通過葉綠體基因組表達(dá)的疫苗抗原已經(jīng)使用葉綠體基因工程方法表達(dá)了幾種疫苗抗原(Ruhlman,Ahangari等.2007)。在上列葉綠體中表達(dá)抗原的許多優(yōu)點支持目前產(chǎn)生表達(dá)感興趣疫苗抗原的轉(zhuǎn)基因系的理論。通過葉綠體表達(dá)的許多疫苗抗原靶向針對細(xì)菌、病毒和原蟲病原體,例如瘟疫Fl-V融合抗原(Arlen,Singleton等.2008)、溶組織內(nèi)阿米巴(Chebolu和Daniell2007)、炭疽桿菌的保護(hù)性抗原(Watson,Koya等·2004)(Koya,Moayeri等·2005)、輪狀病毒的VP6蛋白(Birch-Machin,Newell等·2004)、烈性犬細(xì)小病毒(CPV)的2L21肽(Molina,Hervas-Stubbs等.2004)和霍亂的CTB(Nochi,Takagi等.2007)(Daniel1,Lee等.2001)。Fl-V融合抗原的表達(dá)水平累計達(dá)到TSP的14.8%,用噴霧的鼠疫耶氏菌(Yersiniapestis)激發(fā)后,所有對照動物在三天內(nèi)死亡,接受皮下注射F1_V的加強(qiáng)免疫的動物的33%和接受口服加強(qiáng)Fl-V的小鼠的88%受到保護(hù)(Arlen,Singleton等·2008)。該發(fā)現(xiàn)使使用葉綠體技術(shù)的方法和可口服遞送的成本有效疫苗的希望更接近現(xiàn)實?;魜y毒素B亞基(CTB)革蘭氏陰性細(xì)菌霍亂弧菌分泌稱為霍亂毒素(CT)的腸毒素。CT是由六個蛋白AB5組成的寡聚體,蛋白AB5由一個毒性27kDaA亞基和5個每個重11.6kDa的非毒性B亞基組成(Daniell,Lee等.2001)。該六聚體復(fù)合物通過霍亂毒素B亞基(CTB)和GM1神經(jīng)節(jié)苷脂受體促進(jìn)進(jìn)入腸的粘膜上皮(Daniell,Lee等.2001)。GMl神經(jīng)節(jié)苷脂發(fā)現(xiàn)于腸上皮細(xì)胞表面,并且已知CTB具有對這些鞘糖脂的高親和力(Mor,Gomez-Lim等.1998)。已知CTB在口服施用時是安全有效的粘膜免疫原和佐劑(Holmgren,Lycke等.1993)。CTB在與其他致病性抗原偶聯(lián)時具有增強(qiáng)免疫反應(yīng)的潛力(DanielLLee等.2001)。之前的研究使用CTB-GFP植物并口服施用轉(zhuǎn)基因葉材料至小鼠并觀察腸壁中CTB和小鼠腸粘膜、肝和脾中GFP熒光(Limaye,K0ya等.2006)。這提供了產(chǎn)生有效經(jīng)受體介導(dǎo)的腸吸收的可口服遞送的人類治療性蛋白(Ruhlman,Ahangari等.2007)??诜f送的生物包封口服遞送疫苗抗原進(jìn)入體內(nèi)產(chǎn)生擔(dān)心的問題。遞送的抗原需要是完整的并且保留其生物活性并經(jīng)受住胃中存在的消化酶。生物包封是應(yīng)用于植物細(xì)胞封裝并從而保護(hù)口服遞送的蛋白免受酸消化的能力的術(shù)語(Walmsley和Arntzen2000)??煽诜f送的疫苗蛋白需要跨粘膜障礙而在免疫系統(tǒng)遭遇病原體的事件中有效提供保護(hù)。之前報道顯示GFP經(jīng)受體介導(dǎo)的口服遞送和利用跨粘膜障礙CTB而被生物包封(Limaye,Koya等.2006)。口服遞送后,GFP而非CTB存在于小鼠肝中,表明其被保護(hù)而免受胃消化酶的作用。受體介導(dǎo)的口服遞送和生物包封的作用提供產(chǎn)生有效遞送疫苗抗原的低成本疫苗的啟示。本發(fā)明考慮到上述,本發(fā)明公開了在植物中產(chǎn)生瘧疾抗原的方法,所述方法包括通過將編碼并可操作表達(dá)選自AMA-I、MSP-I或兩者的瘧疾抗原多肽的核酸序列插入質(zhì)體基因組而穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物的方法?!胺€(wěn)定轉(zhuǎn)化”表示整合的DNA序列通過質(zhì)體基因組復(fù)制由子細(xì)胞或生物體遺傳。該穩(wěn)定性由建立由含有外源DNA的群體組成的持久細(xì)胞系、克隆或轉(zhuǎn)基因植物的能力來表現(xiàn)。本發(fā)明方法還包括通過有效引發(fā)抗原反應(yīng)的途徑向宿主施用植物中產(chǎn)生的瘧疾抗原多肽而治療易感瘧疾的宿主。本發(fā)明方法進(jìn)一步包括有效增強(qiáng)被免疫個體瘧疾抗體反應(yīng)的可口服遞送的疫苗。而且,本發(fā)明還包括有效穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物質(zhì)體基因組以表達(dá)一種或多種瘧疾抗原多肽的表達(dá)盒。該盒包含核酸序列,包括兩個與質(zhì)體基因組部分同源并有效用于插入質(zhì)體基因組的未翻譯側(cè)翼區(qū),以及在所述側(cè)翼區(qū)之間的編碼選自AMA-1、MSP-I及其組合的瘧疾抗原多肽的區(qū)、編碼賦予對選擇劑抗性的標(biāo)志物的區(qū)和有效用于組成型表達(dá)至少瘧疾抗原多肽和抗性標(biāo)志物的啟動子區(qū)。表達(dá)盒優(yōu)選在側(cè)翼區(qū)之間具有編碼霍亂毒素B亞基的區(qū),以9便表達(dá)的瘧疾抗原多肽是與其融合的多肽。本發(fā)明還包括所述盒表達(dá)的并以從轉(zhuǎn)化的植物純化的形式的融合多肽以及被所述盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的含有質(zhì)體基因組的轉(zhuǎn)化植物本身及其切割物、種子和后代。本發(fā)明還包括有效增加易感宿主中瘧疾抗體的口服疫苗,所述疫苗包含食用植物的葉材料,所述食用植物含有質(zhì)體,該質(zhì)體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化,以組成型表達(dá)主要由霍亂毒素B亞基和選自AMA-I、MSP-1或兩者的瘧疾抗原多肽組成的融合多肽。本發(fā)明部分包括治療易感瘧疾的宿主的方法,該方法包括口服施用權(quán)利要求14所述的疫苗。本文還額外公開了制備瘧疾疫苗的方法,該方法包括通過將編碼并可操作以組成型表達(dá)選自AMA-1、MSP-I或兩者的瘧疾抗原多肽的核酸序列插入其質(zhì)體基因組而穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物。所述方法還包括全部或部分收獲穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物,從收獲的植物純化表達(dá)的瘧疾抗原多肽,并在無菌條件下以預(yù)定劑量的量包裝純化的抗原多肽。優(yōu)選用于所述方法的植物是煙草屬(genusNicotiana)并且最優(yōu)選是普通煙草的許多種。本發(fā)明方法還包括制備口服瘧疾疫苗的方法,通過將編碼并可操作以組成型表達(dá)選自AMA-1、MSP-I或兩者的瘧疾抗原多肽的核酸序列插入其質(zhì)體基因組而穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物,收獲穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的食用植物或其部分,并包裝收獲物以口服食用。收獲物優(yōu)選以干形式包裝。附圖簡述已經(jīng)說明了本發(fā)明的一些特征、優(yōu)點和益處,其他特征、優(yōu)點和益處將隨著結(jié)合附圖進(jìn)行的描述而變得明顯,附圖的提出僅為了示例目的而不是要限制相關(guān)發(fā)明,并且其中圖1是顯示“葉綠體pLD-UTRCTB-瘧疾抗原”的示意圖,并說明根據(jù)本發(fā)明實施方案所提出的轉(zhuǎn)基因進(jìn)入葉綠體載體的方向;圖2顯示CTB、FCAMA-I和MSP-I的PCR分析;圖3示例描述將CTBFCAMA-I和CTBMSP-I克隆進(jìn)pLD-UTR葉綠體載體的分析;圖4描述野生型和陽性轉(zhuǎn)化子的PCR分析;圖5是southern印跡對轉(zhuǎn)基因整合入同質(zhì)植物葉綠體基因組的評價;圖6顯示各代轉(zhuǎn)基因植物,(A)是粒子轟擊后4至5周,(B)在2至3周內(nèi)出現(xiàn)的芽,和(C)被轉(zhuǎn)移到溫室后的同質(zhì)植物;圖7顯示確認(rèn)CTB-瘧疾抗原在普通煙草粗提取物中表達(dá)的免疫印跡分析;圖8顯示示例說明葉綠體衍生的CTB-瘧疾表達(dá)的定量的圖;圖9是顯示葉綠體衍生的CTBFC-AMA-I蛋白在Talon純化后增加的分辨率的凝膠分離;圖10描繪瘧疾抗原從普通煙草提取物富集的免疫印跡分析;圖11是被洗脫的蛋白級分被分析并與CTB蛋白的已知量比較的免疫印跡;圖12顯示確認(rèn)抗AMA-I和抗MSPl抗體對天然瘧疾蛋白的識別的免疫印跡;圖13提供了顯示天然寄生蟲被抗AMA-I和抗MSPl抗體識別的可見的免疫熒光顯微照片;圖14顯示用于評價治療小鼠的幾組中寄生蟲血液水平的血涂片的四個顯微照片;圖15是萵苣葉綠體轉(zhuǎn)化載體和轉(zhuǎn)基因整合入靶向載體的位點的示意圖;southern印跡分析的限制位點;(a)質(zhì)粒pLsDVCTB-AMAl載體的圖,顯示側(cè)翼序列、啟動子、選擇性標(biāo)志物基因盒和CTB-AMAl蛋白表達(dá)盒,具有用于southern分析的限制位點;(b)質(zhì)粒pLsDVCTB-MSPl載體的設(shè)計,顯示側(cè)翼序列、啟動子、選擇性標(biāo)志物基因盒和CTB-MSPl蛋白表達(dá)盒;圖16分析顯示來自pLsDVCTB-AMA-I的所有6個抗性芽和來自pLsDVCTB-MSP-I的5個是葉綠體轉(zhuǎn)基因系PCR陽性;圖17顯示所有來自第三輪選擇的pLsDVCTB-AMA-I和pLsDVCTB-MSP-l轉(zhuǎn)基因植物顯示同質(zhì)性;圖18和19免疫印跡在含有CTB-AMA-I和CTB-MSP-I轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因系上進(jìn)行;用CTB多克隆抗體免疫檢測顯示CTBAMA-I印跡上27.5kDaCTB融合的多肽(圖18和19);大量蛋白可以在圖19沉淀中檢測;圖20是圖18和19中的免疫印跡,但是顯示在CTBMSP-I印跡上23kDa的CTB融合多肽;觀察到CTB-AMAl和CTB-MSPl融合蛋白的二聚體、三聚體、四聚體和五聚體的形成;圖21是顯示煙草成熟葉的CTB-AMA-I和CTB_MSP_1蛋白表達(dá)水平分別達(dá)到TSP的12.3%和8%的條形圖;而在萵苣中,在溫室生長條件下,CTB-AMA-I和CTB-MSP-I蛋白表達(dá)水平分別達(dá)到TSP的9.4%和4.8%;圖22顯示葉綠體轉(zhuǎn)化的萵苣的產(chǎn)生(圖9)篩選三周后從轟擊的葉獲得的奇霉素抗性芽;來自抗性芽的葉剪成0.5cm2并在LR培養(yǎng)基上次培養(yǎng)而用于第二輪篩選以獲得同質(zhì)芽;然后將衍生的芽轉(zhuǎn)移至LD培養(yǎng)基生根。Southern分析確認(rèn)的同質(zhì)植物被轉(zhuǎn)移至苗缽(jiffypot)以適應(yīng)環(huán)境;健康和強(qiáng)化的植物被轉(zhuǎn)移至溫室;成熟的植物產(chǎn)生正常的花和種子;和圖23顯示野生型和轉(zhuǎn)化的種子發(fā)芽而顯示轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞質(zhì)遺傳性并沒有孟德爾分離。優(yōu)選實施方案詳述現(xiàn)在參考附圖在下文更詳細(xì)地描述本發(fā)明,其中顯示了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。除非另外定義,本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬
      技術(shù)領(lǐng)域
      普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。盡管與本文描述相似或等價的方法和材料可用于實施或試驗本發(fā)明,但適合的方法和材料在下文描述。本文提到的任何出版物、專利申請、專利和其他參考文獻(xiàn)通過引用以其整體并入本文。如果沖突,以本發(fā)明說明書(包括任何定義)為準(zhǔn)。此外,所給材料、方法和實施例的性質(zhì)僅是示例性的,并且不是要限制。因此,本發(fā)明可以許多不同形式來具體實施,并且不應(yīng)解釋為限于本文提出的示例實施方案。而且,這些示例實施方案被提供以使該公開是充分和完全的,并將本發(fā)明范圍完全傳達(dá)給本領(lǐng)域技術(shù)人員。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將根據(jù)下述詳細(xì)描述和權(quán)利要求而明顯。使用的首字母縮略和縮寫aadA-氨基糖苷3,腺苷轉(zhuǎn)移酶APS-過硫酸銨BAP-芐基氨基嘌呤BME-β-巰基乙醇BSA-牛血清白蛋白CSP-環(huán)子孢子蛋白CT-霍亂毒素CTB-霍亂毒素B亞基CTAB-鯨蠟基三甲基溴化銨DABC0-1,4-二氮雜雙環(huán)[2,2,2]辛烷EDTA-乙二胺四乙酸ELISA-酶聯(lián)免疫吸附分析FC-弗林蛋白切割位點GFP-綠色熒光蛋白GPI-糖基磷脂?;〈糏FA-免疫熒光分析LSA-肝階段抗原NaBH4-硼氫化鈉NaCl-氯化鈉NAA-α-萘乙酸PBS-磷酸緩沖鹽水pBSK+-pBlueScriptSK+PBS-T-磷酸緩沖鹽水_吐溫PCR-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PEI-聚乙烯亞胺Pf-惡性瘧原蟲PfAMAl-惡性瘧原蟲頂膜抗原1PfMSPl19-惡性瘧原蟲裂殖子表面抗原I19psbA-光系統(tǒng)b/APTM-磷酸緩沖鹽水_吐溫_乳RBC-紅細(xì)胞RESA-環(huán)感染紅細(xì)胞表面抗原RT-PCR-逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)SDS-十二烷基硫酸鈉SDS-PAGE-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳TEMED-N,N,N,N,-四-甲基-乙二胺TRAP-血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)的匿名蛋白TSP-總可溶性蛋白UTR-未翻譯區(qū)UV-紫外線理論和方法該方案主要目的是通過葉綠體基因組表達(dá)和表征瘧疾抗原CTB-AMA-I和CTB-MSP-1,并評價葉綠體衍生抗原的免疫原性。為了實現(xiàn)這些目的,瘧疾基因產(chǎn)物被確認(rèn)并克隆進(jìn)稱為pLD-UTR的質(zhì)體載體(根據(jù)美國專利第7,129,391號,其通過引用整體并入本文)。使用粒子轟擊,獲得轉(zhuǎn)基因系以表達(dá)葉綠體衍生的瘧疾抗原。瘧疾蛋白的表達(dá)和定量的確認(rèn)允許轉(zhuǎn)基因植物通過口服灌注而口服遞送至嚙齒類動物。富集瘧疾抗原以比較皮下注射與口服遞送。純化的抗原的免疫原性通過酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)測定小鼠抗體滴度來評價。如果抗原是免疫原性的,則它們被測試以確定它們抑制寄生蟲侵入RBC的能力。材料和方法AMA-I和MSP-I在無性階段和克隆中的擴(kuò)增基于AMA-I和MSP-I的C端核苷酸序列,正向和反向引物被設(shè)計為擴(kuò)增基因。分別制備AMA-I和MSP-I的正向引物(5,-CCGCTCGAGCATATGGCTTTGTCCCATCCCAT-3,;SEQIDNO1)(具有Xhol位點)和(5,-CCGAATTCGGACCAGGACCAATTTCACAACACCAATGA-3‘;SEQIDNO2)(具有EcoRI位點)。AMA-I和MSP-I的反向引物分別是(5,-CGGAATTCTTTCATGTTATCATAAGTTG-3‘;SEQIDNO3)(設(shè)計具有EcoRI位點)和(5,-ATAAGAATGCGGCCGCTTAGTTAGAGGAACTGCAGAAAATAC-3,;SEQIDNO4)(設(shè)計具有Notl位點)。用于RT-PCR的總RNA事先通過0.05%皂苷溶解收獲非同步的3D7P惡性瘧原蟲培養(yǎng)物并使用RNAgents總RNA分離系統(tǒng)(Promega)從寄生蟲沉淀分離總RNA來分離(貯存于_80°C)。使用帶有Easy-ATMHigh-FidelityPCR克隆酶的StrataScipt單管RT-PCR系統(tǒng)(Stratagene)來逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增基因,使用200ng總RNA和基因特異性引物。RTPCR循環(huán)條件如下1個逆轉(zhuǎn)錄循環(huán)(42°C,30分鐘),隨后在95°C、30秒鐘滅活轉(zhuǎn)錄酶;5個循環(huán)的變性(95°C、30秒)、退火(50°C、30秒)和延伸(68°C、6分鐘);35個循環(huán)的95°C、30秒,58°C、30秒,和65°C、6分鐘;以及一個循環(huán)的65°C、10分鐘。5μ1的RT-PCR產(chǎn)物通過在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳來分析并通過GelDoc2000(BioRad)顯示。RT-PCR產(chǎn)物的剩余物用QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen)純化并通過0.8%瓊脂糖凝膠確認(rèn)。基因被克隆進(jìn)pGEMTEasy載體(Promega)并通過EcoRI消化和凝膠電泳確認(rèn)。DNA被送至弗羅里達(dá)大學(xué)DNA測序(ICBR=TheBiotechnologyProgram)并使用DNASTARSeqMan程序確認(rèn)序列。通過使用模板DNA和含有下述限制位點的新引物帶有Smal的5’引物和帶有Notl的3’引物,AMA-1(還含有弗林蛋白酶切割位點=Arg-Lys-Lys-Arg在5’端)和MSP-I基因通過PCR擴(kuò)增并通過0.8%瓊脂糖凝膠確認(rèn)。FCAMA-I和MSP-I基因被亞克隆進(jìn)pBSK+(Stratagene)載體。CTB的擴(kuò)增和克隆含有CTB基因的模板DNA由Dr.Daniell實驗室提供。CTB基因使用帶有Xhol和Ndel位點的5’引物和帶有Smal限制位點的3’引物通過PCR擴(kuò)增。CTB基因被克隆進(jìn)pGEMTEasy載體(Promega)并確認(rèn)序列。CTB使用Xhol和Smal位點被亞克隆進(jìn)pBSK+載體。pBSK+CTB、pBSK+FCAMA-I和pBSK+MSP-1用Smal和Notl限制酶消化,并且FCAMA-I和MSP-I基因被連接入pBSK+CTB質(zhì)粒以融合基因完整CTBFCAMA-I和CTBMSP-1。葉綠體質(zhì)粒構(gòu)建pBSK+載體中的CTBFCAMA-1和CTBMSP-1轉(zhuǎn)基因用Ndel和Notl限制酶切割并用T4連接酶(NewEnglandBioLabs)連接入pLD_UTR載體并轉(zhuǎn)化進(jìn)超級感受態(tài)大腸桿菌XL-IO冷細(xì)胞。圖1,提述葉綠體pLD-UTRCTB-瘧疾抗原,說明了提出的轉(zhuǎn)基因進(jìn)入葉綠體載體的方向。轉(zhuǎn)化后,克隆被選擇并在5mlLB肉湯和5μ1氨芐西林(100mg/mL)中培養(yǎng)過夜。DNA通過使用QIApr印旋轉(zhuǎn)小量制備試劑盒(Qiagen)分離,用Ndel和Notl限制酶消化,并通過0.8%瓊脂糖凝膠分析。從含有陽性克隆的甘油貯液,LBlOOmg/mL氨芐西林平板被劃痕并培養(yǎng)克隆過夜。葉綠體質(zhì)粒DNA用Qiagen質(zhì)粒大試劑盒純化并通過0.8%瓊脂糖凝膠上凝膠電泳分析DNA。轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)化和再生制備金顆粒并用DNA涂布50mg金顆粒和Iml100%乙醇的混合物渦旋震蕩2分鐘并在1.5mlEppendorf管中10,000Xg離心三次。棄掉上清液,金顆粒重懸于ImL70%乙醇中1分鐘。然后將懸浮液置于室溫15分鐘,伴隨間歇攪拌。金顆粒通過在5,000xg離心2分鐘而沉淀,棄掉上清液。金顆粒用ImL無菌蒸餾水渦旋震蕩并在室溫孵育1分鐘并在5,OOOxg離心2分鐘。用無菌水洗滌金顆粒的步驟重復(fù)三次(Kumar和Daniell2004)。金顆粒懸浮于ImL無菌50%甘油中并在冰上貯存直至使用。50μL金顆粒從貯料移出并連同10μg質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移至1.5mL微量離心管。為保證DNA適當(dāng)結(jié)合至金顆粒,加入50μL2.5ΜCaC12和20yL0.IM無亞精胺的堿。混合物在4°C渦旋震蕩20分鐘,DNA涂布的金顆粒在10,OOOxg離心1分鐘。上清液被移除,沉淀在200μL無水乙醇中洗滌4次。DNA涂布的金顆粒重懸于50μL100%乙醇。將一小份10μL經(jīng)渦旋震蕩的DNA涂布的金顆粒載至無菌大載體上,并允許在空氣層流罩中風(fēng)干。葉組織的轟擊轟擊在無菌條件下進(jìn)行,包括基因槍(Bio-RadPDS-1000/He)在內(nèi)的所有設(shè)備用95%乙醇滅菌。體外煙草植物普通煙草品種PeWHavana的綠色健康葉從年輕植物切割并置于近軸側(cè),面向固化RMOP培養(yǎng)基上高壓滅菌的Whatman濾紙。所述槍裝載DNA-金涂布的顆粒,并且轟擊在1,IOOpsi和28Hg下進(jìn)行。轟擊后,潛在轉(zhuǎn)化的葉用鋁箔覆蓋并保持在室溫下黑暗中48小時(Kumar和Daniell2004)。葉綠體轉(zhuǎn)基因芽的再生和選擇48小時后,轟擊的葉被切割成大約5x5mm2塊,并轉(zhuǎn)移至RMOP培養(yǎng)基(一包MS基本鹽混合物,30g蔗糖,IOOmg肌醇,Iml的lmg/mLBAP,100μ1的lmg/mLNAA,Iml的鹽酸硫胺,至IL無菌蒸餾水并使用INKOH調(diào)節(jié)至pH5.8;向培養(yǎng)基中加入6g植物瓊脂(phytagar)以固化;在傾入陪替培養(yǎng)皿之前高壓滅菌并冷卻),含有500μg/mL奇霉素,轟擊側(cè)與培養(yǎng)基接觸。陪替培養(yǎng)皿用石蠟?zāi)っ芊獠⒈3衷谂囵B(yǎng)室中直至出現(xiàn)推定的轉(zhuǎn)基因芽。通過PCR分析確認(rèn)的陽性轉(zhuǎn)基因系經(jīng)受第二輪篩選以實現(xiàn)同質(zhì)性。在4周的第二篩選后,將芽轉(zhuǎn)移至MSO培養(yǎng)基(一包MS基本鹽混合物和30g蔗糖,至IL無菌蒸餾水;使用INKOH處理至PH;6g植物瓊脂),含有500μg/mL奇霉素。這負(fù)責(zé)第三輪篩選和生根。轉(zhuǎn)基因整合的植物DNA確認(rèn)的分離在進(jìn)行至下一輪篩選之前,從推定的葉綠體轉(zhuǎn)基因芽收獲IOOmg葉材料。使用QiagenDNeasy植物迷你試劑盒根據(jù)生產(chǎn)商方案分離植物基因組DNA。該過程產(chǎn)生大約20-30μgDNA,并且分離的DNA用于PCR分析。使用PCR確認(rèn)轉(zhuǎn)基因盒整合入葉綠體基因組,引物對3P(5,AAAACCCGTCCTCAGTTCGGATTGC-3,;SEQIDNO5)和3M(5,CCGCGTTGTTTCATCAAGCCTTACG-3';SEQIDNO:6)(Daniell,Ruiz等.2005)。感興趣基因的整合通過使用引物對5P(5’-CTGTAGAAGTCACCATTGTTGTGC-3,;SEQIDNO7)和2M(5’-TGACTGCCCACCTGAGAGCGGACA-3,;SEQIDNO8)的PCR確認(rèn)(Daniell,Ruiz等·2005)。從野生型PetitHavana分離的DNA用作陰性對照,從已知轉(zhuǎn)基因植物材料分離的DNA用作陽性對照。對于PCR分析,在0.2mlPCR管中準(zhǔn)備50μ1反應(yīng)體積1μ1的IOOng/μL基因組DNA,5μ1的IOXPCR反應(yīng)緩沖液,4μ1的2.5mMdNTP,1μ1的3P禾口3M引物(或5P和2M引物),1μ1的TaqDNA聚合酶,以及無菌蒸餾水以構(gòu)成總體積。最初變性設(shè)在94°、5分鐘,擴(kuò)增進(jìn)行三個循環(huán)的下述程序94°C、1分鐘(變性),60°C、1分鐘(退火)和72°C、2分鐘(延伸)。72°C下10分鐘的最后延伸在PCR結(jié)束時進(jìn)行。為了通過瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物,將5μ1產(chǎn)物連同對照載入0.8%瓊脂糖凝膠并通過凝膠成像系統(tǒng)(geldoc)顯示。Southern印跡分析植物基因組DNA的分離轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植物的葉材料使用無菌技術(shù)從體外溫室移出并用液氮研磨成IOOmg細(xì)粉。之前制備并貯存在65°C的ImlDNA提取緩沖液(Tris-HClpH8,EDTA,NaCl,CTAB,BME,達(dá)IOml水)添加至葉材料并在65°C下孵育30分鐘,每5至8分鐘溫和混合一次。一小份667μ1(482)氯仿異戊醇添加至勻漿,溫和翻轉(zhuǎn)1分鐘,然后10,OOOrpm離心10分鐘。收集上清液并放入新管,加入667μ1冰冷異戊醇,溫和混合以沉淀核酸。發(fā)現(xiàn)可見的稠密凝塊并在10,OOOrpm下離心10分鐘。核酸用70%乙醇洗滌并允許在室溫下風(fēng)干,隨后用DNA110speedvac(SavantInstruments,Inc.)進(jìn)一步干燥5分鐘。沉淀溶解于500μ1含有0.Iyg/μLRNA酶的0.1XTE(ImMTris-HCI(pH8)+0.ImMEDTA(ρΗ8))并在37°C孵育30分鐘。添加500μ1的(24251)氯仿苯酚異戊醇,并完全混合而顯示3層,在12,OOOrpm離心15分鐘。移出含有DNA的上層并放入新管,添加相同體積的氯仿以去除苯酚。該管被完全混合并在14,OOOrpm離心15分鐘。顯示2層,將含有DNA的上層轉(zhuǎn)移至新管。加入Iml體積的100%冷乙醇和33μL(1/10體積的DNA)3Μ乙酸鈉(ρΗ5.2)以使DNA沉淀。反應(yīng)在_20°C保持1小時并在14,OOOrpm離心10分鐘。非常緩慢地傾掉上清液,保留可見的白色沉淀。沉淀用70%乙醇洗滌并在14,OOOrpm離心10分鐘。沉淀用DNA110speedvac(SavantInstruments,Inc.)干燥5分鐘以除去剩余乙醇并溶解于100或200μL0.IXTEdmMTris-HCI(ρΗ8)+0.ImMEDTA(ρΗ8)),取決于沉淀大小。將基因組樣品載至0.8%瓊脂糖凝膠以顯示條帶。DNA濃度由分光光度計測定?;蚪MDNA的限制性消化含有等量DNA的轉(zhuǎn)基因和未轉(zhuǎn)化樣品在含有下述的反應(yīng)中用Apal消化1.5μgDNA,4μL的IOXBSA,4μL的IOX緩沖液4(NewEnglandBiolabs)、2μL的Apal(NewEnglandBiolabs)和無菌蒸餾水以構(gòu)成40μ1的體積。該反應(yīng)在37°C孵育過夜。瓊脂糖電泳和DNA轉(zhuǎn)移每份40μ1反應(yīng)體積樣品載至0.8%瓊脂糖凝膠,以100伏特運行電泳3小時。凝膠用熒光尺顯示并用140稀釋的12NHCl脫嘌呤10分鐘(直到染料顏色變成黃色)并去除。這之后將凝膠浸入雜交變性溶液(5PRIME-3PRIME)30分鐘,然后用無菌蒸餾水洗滌。然后將凝膠用雜交中和溶液(5PRIME-3raiME)浸泡30分鐘,然后在轉(zhuǎn)移緩沖液(2XSSC,Eppendorf)中洗滌5分鐘。將膜(S&SNytranSupercharge,Schleicher&Schuell)浸入無菌蒸餾水15分鐘并留在轉(zhuǎn)移緩沖液中直至使用。DNA從瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移至膜采用Turboblotter(快速向下轉(zhuǎn)移系統(tǒng)/緩沖液盤,Schleicher&Schuell)方案。托盤中放入20層干GB004紙,然后是4層干GB002和1層在轉(zhuǎn)移緩沖液中預(yù)濕的GB002。預(yù)濕的轉(zhuǎn)移膜放在托上,然后頂端是瓊脂糖凝膠。使用滾棍(rollingpin)除去存在的任何氣泡。凝膠頂端應(yīng)用轉(zhuǎn)移緩沖液濕潤,將三層預(yù)濕的GB002紙放在頂端。緩沖液盤與托盤相連并裝有125ml轉(zhuǎn)移緩沖液。將芯置于托頂端以使末端懸入緩沖液盤。芯蓋置于頂端以防止蒸發(fā),轉(zhuǎn)移在室溫下持續(xù)過夜。第二天,將膜用鉛筆標(biāo)記并用轉(zhuǎn)移緩沖液沖洗5分鐘。將膜置于色譜紙上并允許風(fēng)干。膜使用UVStratalinker2400(Stratagene)在設(shè)定的autocrosslink交聯(lián)并在干燥地方保存直至進(jìn)一步使用。探針的產(chǎn)生設(shè)置下述PCR反應(yīng)以構(gòu)建2P/2M側(cè)翼探針I(yè)yLDNA,5μ1的IOX緩沖液,2.5μ1的MgC12,ly1的dNTP,lyL的2Pn引物,IyL的2M引物,IyLTaq聚合酶,和37.5μL無菌Η20。初始變性設(shè)為94°、5分鐘,擴(kuò)增進(jìn)行下述程序的29個循環(huán)94°C、30秒鐘(變性),61°C、30秒鐘(退火),和72°C、1分30秒(延伸)。72°C、7分鐘的最后延伸在PCR末端進(jìn)行。50μLPCR反應(yīng)載入0.8%瓊脂糖凝膠,并用BioRadGelDoc2000顯示。條帶被切除并用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)提取,通過下述生產(chǎn)商方案并使用35μL緩沖液EB洗脫。膜的預(yù)雜交將膜置于雜交瓶中,側(cè)面暴露于朝內(nèi)的DNA,加入20mL預(yù)雜交溶液(36.5mL無菌蒸餾水,IOmL20XSSC,2.5mLIOOXDenhardt,s(6%聚蔗糖,6%聚乙烯吡咯烷酮,6%BSA),500μL10%NaPPi和500μL10%SDS)并在65°C下用HybridiserHB-ID(Techne)孵育。聲處理的鮭魚精子DNA(10mg/mL)(Stratagene)煮沸數(shù)分鐘并將500μL加入雜交瓶。預(yù)雜交的膜在65°C下孵育4小時。探針標(biāo)記和純化按照I3RIME-It隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒(Stratagene)方案標(biāo)記放射性探針。在干凈的微量離心管中加入20ng側(cè)翼探針,10μL隨機(jī)寡核苷酸引物和達(dá)23μ1的無菌水并煮沸5分鐘。混合物在室溫下快速離心。依次加入以下10yL5XATP緩沖液,5μ1Redivue(α-32Ρ)DATP和1μLExo(-)Klenow(5U/μL)并通過攪拌混合。該混合物在37°C下加熱15分鐘,隨后加入2μL終止混合物。NucTrap探針純化柱(Stratagene)置于推柱裝置,并將含有100μL鮭魚精子DNA的干凈的微量離心管置于下面。80yLIXSTE用注射器注入柱,并收集入微量離心管。將放射標(biāo)記探針加入柱并用注射器推注,隨后是80μLIXSTE0將注射器再次應(yīng)用至柱,加入300μLIXSTE至純化的探針。膜的雜交和洗滌將純化的探針煮沸5分鐘并用無菌轉(zhuǎn)移移液管添加至雜交瓶,并允許與膜在65°C雜交過夜。第二天,將膜用洗滌緩沖液#1(2XSSC、0.SDS和0.NaPPi)洗滌兩次,每次5分鐘,隨后用洗滌緩沖液#2(0.2XSSC、0.1%SDS和0.1%NaPPi)洗滌四次,每次15分鐘。將洗滌緩沖液棄入P32廢液并使膜在塑料護(hù)罩后面風(fēng)干。放射性膜用保鮮膜包裹,并將梯(Stratagene)放在前面。放射自顯影將膜盒連同雜交印跡帶到暗室并置于安全紅燈下,將印跡朝下放在鑒定屏幕上,并將X射線膜置于屏幕之間。帶有雜交印跡的盒以及膜在-80°C黑暗中孵育過夜。第二天,將盒從-80°C冷卻器取出融化,并將膜用X射線膜處理器顯示。表達(dá)的葉綠體衍生蛋白的鑒定從轉(zhuǎn)化的煙草葉提取蛋白在每天早上4至5點鐘收獲成熟的葉材料。將葉在實驗室洗滌并允許風(fēng)干并在-80°C下保存直至進(jìn)一步使用。來自轉(zhuǎn)基因系的葉綠體衍生的CTB瘧疾蛋白通過用研缽和杵在液氮中研磨IOOmg植物組織而提取,并將細(xì)粉葉材料通過頂端的開孔放入1.5mL微量離心管。微量離心管立即置于液氮中直至進(jìn)一步使用。向葉材料加入200μ1植物提取緩沖液(IOOmMNaCl,IOmMEDTA,200mMTris-HClpH8,0.05%吐溫20,0.1%SDS,14mMBME,200mM蔗糖,3.18mL無菌水,和1片Roche完全迷你無EDTA蛋白酶抑制劑混合物)。該樣品置于冰上并使用機(jī)械杵混合2分鐘并在14,000rpm、4°C下離心15分鐘以獲得上清液(可溶性級分)。用等體積蛋白提取緩沖液重選沉淀(不溶性級分)并超聲30秒。使上清液和沉淀經(jīng)受Bradford分析來確定總蛋白濃度并貯存于-20°C直至進(jìn)一步使用。SDS-Page和免疫印跡分析設(shè)置干凈的BioRad玻璃板和澆注室用于SDSPage分析。12.5%分離凝膠(4.15mL30%BioRad丙烯酰胺/Bis溶液,2.5mL4X分離緩沖液5MTris_HCl,pH8.8,3.2mLH20,0.ImL10%SDS,0.ImL10%APS,和10μLTEMED)在50mL燒杯中混合,并通過注射器將其加在兩個玻璃板之間,留下約1.5cm空余用于積層凝膠。立即將水加之分離凝膠頂端并允許聚合30分鐘。將水用組織去除并制備4%積層凝膠(665UL30%BioRad丙烯酰胺/Bis溶液,1.25mL4X積層緩沖液0.5MTris-HCI,pH6.8,3.OmLΗ20,50μ110%SDS,50μ110%APS,和5μ1TEMED)。4%積層凝膠混合物鋪層在分離凝膠的頂端,將梳插入以形成孔。聚合30分鐘后,將凝膠垂直放入含有IX蛋白緩沖液(10X蛋白緩沖液0.25MTris堿,1.92M甘氨酸,和SDS)的PAGE裝置。將蛋白樣品(野生型植物、轉(zhuǎn)基因植物和大腸桿菌衍生的CTBMSP-1)通過下述制備12μL蛋白提取液和12μL2Χ凝膠加樣緩沖液(2.5ml4X積層緩沖液,4ml10%SDS,2ml甘油,40μL5%溴酚藍(lán),0.31gDTT,于總計IOml蒸餾水中)。蛋白樣品煮沸5分鐘并連同7yLBioRad精密+蛋白標(biāo)準(zhǔn)品載入孔中。凝膠在85伏下運行直至蛋白樣品進(jìn)入分離緩沖液,增加電壓至150伏直至染料前端達(dá)到凝膠底端。SDS-PAGE蛋白在4°C下通過BioRad轉(zhuǎn)移盒過夜轉(zhuǎn)移至HyBond硝酸纖維素膜,使用轉(zhuǎn)移緩沖液(200mL甲醇,IOOmLIOX蛋白緩沖液,和700mLH20)和20伏。為了免疫印跡分析,將膜用PBS-T洗滌三次,每次5分鐘,并在室溫下于5%PTM中阻斷1小時。兔中產(chǎn)生的第一抗體Sigma抗霍亂毒素在5%PTM中稀釋14,000,并在室溫下孵育2小時。將膜用5%PTM洗滌三次,每次10分鐘。山羊抗兔辣根過氧化物酶軛合穩(wěn)定的第二抗體在5%PTM中稀釋15,000,并在室溫下孵育1小時。將印跡用PBS-T洗滌兩次,每次10分鐘,最后PBS洗滌10分鐘。將膜在黑暗中使用PIERCESuperSignalWestFemto最大靈敏度基質(zhì)孵育5分鐘。將膜在暗室中暴露于MIDSCI經(jīng)典藍(lán)放射自顯影膜,該膜通過膜處理器顯色以顯示條帶。表達(dá)的蛋白的定量進(jìn)行ELISA來定量植物粗提取物中的CTB-FC-AMA1和CTB-MSP-1。成熟階段的轉(zhuǎn)基因葉樣品以及野生型被定量。使用章節(jié)從轉(zhuǎn)化的煙草葉提取蛋白(P.).的方案提取總可溶性蛋白。使用CTB(SigmaC9903)作為標(biāo)準(zhǔn)品并在范圍750_25pg的涂布緩沖液(1.59gNa2C03、2.93gNaHC03和0.2gNaN3,于IL水中;使用HCl調(diào)節(jié)至pH9.6)中稀釋。從野生型非轉(zhuǎn)基因植物CTB-FC-AMA-I植物和CTB-MSP-I植物提取的總可溶性蛋白在涂布緩沖液中分別被稀釋110、150,000-1200,000和125,000-1150,000。96-孔板(CoStarEIA/RIA板,平底、無蓋ELISA板)用100μL的CTB標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣品涂布,并在4°C孵育過夜。第二天,將板用PBS-T洗滌三次,用水洗滌三次。將板用300UL3%PTM阻斷并在37°C孵育1小時。將板洗滌,將100μL在兔中產(chǎn)生的第一抗體Sigma抗霍亂毒素在3%PTM中稀釋14,000并在371孵育1小時。第一抗體之后,將板洗滌,將辣根過氧化物酶軛合的猴抗兔第二抗體(BioMedia)在3%PTM中稀釋112,500并在37°C孵育1小時。將板洗滌并添加100μL基質(zhì)TMB(AmericanQualexAntibodies),并在室溫下孵育5分鐘。將反應(yīng)用50μL2N硫酸終止,使用BioRad微量板讀數(shù)器型號680在450nm讀板。使用Bradford試劑(Bio-RadProteinAssay)Bradford分析,使用范圍0-8μg/μL的BSA標(biāo)準(zhǔn)品、595nm吸光度和Bio-RadSmartSpecPlus分光計測定從野生型和轉(zhuǎn)基因植物提取的總可溶性蛋白。為了確定葉綠體衍生的CTB-FC-AMA1和CTBMSP1的量,使用下述方程。從ELISA得到的濃度(Pg)乘以稀釋因子再乘以100,000,得到μg計的轉(zhuǎn)基因蛋白濃度。然后轉(zhuǎn)基因蛋白濃度除以ELISA板孔中放的樣品體積(100μ1)。然后,除以鋪板體積后得到的數(shù)除以總可溶性蛋白(由Bradford分析提供)的濃度,并乘以100。計算的百分比提供植物表達(dá)的所有蛋白中葉綠體衍生蛋白聚集的估計。葉綠體衍生蛋白的富集Talon純化來自轉(zhuǎn)基因系的葉綠體衍生的CTB瘧疾蛋白通過將IOg植物組織用研缽和杵在液氮中研磨而提取,細(xì)粉葉材料通過放入頂端開孔的50mL錐形管。錐形管立即放入液氮直至進(jìn)一步使用。20mL植物提取緩沖液(IOOmMNaCl,200mMTris-HClpH8,0.05%吐溫20,0.1%SDS,200mM蔗糖,12mL無菌水,和一片Roche完全迷你無EDTA蛋白酶抑制劑混合物)添加至葉材料。將樣品置于冰上,用OMNIInternational(GLH-2596)探頭同質(zhì)化5分鐘并在4°C、14,OOOrpm下離心15分鐘而獲得上清液(可溶性級分)。使上清液(裂解液)經(jīng)受TALON超流金屬親和樹脂(Clontech)來富集葉綠體衍生的CTB瘧疾蛋白。精確按照生產(chǎn)商方案BATCH/重力流柱純化。TALON樹脂完全重懸,將4mL放入無菌的50mL錐形管并在700xg離心2分鐘以沉淀樹脂。將沉淀用10床體積的IX洗滌緩沖液(2.5mL4X洗滌緩沖液0.12M二堿基Na2HP04、0.08M一堿基NaH2P04、1.2MNaCl、4%吐溫-20,補(bǔ)至IOOmL無菌水,pH8;20mM咪唑,加入無菌水構(gòu)成IOmL體積,和1片Roche完全迷你無EDTA蛋白酶抑制劑混合物)預(yù)平衡兩次。將植物提取物添加至樹脂并在4°C攪拌2小時。混合物在700xg離心5分鐘,小心除去上清液(流過)而不攪動樹脂。混合物用10床體積的IX洗滌緩沖液洗滌兩次,棄掉上清液。2mlIX洗滌緩沖液加至樹脂并轉(zhuǎn)移至端帽就位的2ml重力流柱。移除端帽,使緩沖液排掉。柱用5床體積的IX洗滌緩沖液洗滌一次。為了洗脫葉綠體衍生的CTB瘧疾蛋白,加入5床體積的洗脫緩沖液(2.5ml4X洗滌緩沖液,20mM咪唑,IOOmMEDTA,體積達(dá)IOml無菌水,和1片Roche完全迷你無EDTA蛋白酶抑制劑混合物,PH8),收集洗脫液。收集的洗脫的級分連同野生型材料、裂解液、流過物和洗液用Bradford和Bio-RadRC-DC蛋白分析進(jìn)行分析以確定蛋白濃度。洗脫的級分用IX無菌PBS和Slide-A-Lyzer透析盒10,OOOMW(PIERCE)透析。Talon純化的分析洗脫的野生型材料、裂解液、流過物和洗液級分經(jīng)受梯度凝膠和免疫印跡以確定富集效率。7yg的CTBFCAMA-I級分在還原和非還原條件下70°C加熱10分鐘并載入NuPAGENovexBisTrisGel(Invitrogen)并在200伏下電泳,直至染料前沿達(dá)到凝膠底部。凝膠在水中沖洗并用GelCode藍(lán)染料試劑(PIERCE)染色過夜。5μg的CTBFCAMA-I和CTBMSP-I級分樣品(洗脫的、野生型、裂解液、流過物、洗液)被電泳并通過免疫印跡分析。兔中產(chǎn)生的第一抗體Sigma抗霍亂毒素在5%PTM中稀釋14,000,在室溫下孵育2小時。PIERCE穩(wěn)定的山羊抗兔辣根過氧化物酶軛合的第二抗體在5%PTM中稀釋15,000,在室溫孵育1小時。在與基質(zhì)孵育之后,使膜暴露于X射線膜并經(jīng)膜處理器顯色而顯示條市ο光密度法洗脫的葉綠體衍生的CTB瘧疾蛋白和已知量的CTB蛋白的免疫印跡通過使用斑點光密度分析來分析。1000、500、250、125ng的CTB蛋白(Sigma,C9903)和1·5、0·75、0·375、0.1875μg洗脫的CTBFCΑΜΑ-Ι和1.5、0·75,0.375μg洗脫的CTBMSP-1被電泳并通過免疫印跡分析。添加的第一抗體是兔抗CTB,第二抗體是山羊抗兔。在暴露于膜之后,已知CTB濃度的斑點和洗脫的級分通過使用Alphalmager和AlphaEaseFC軟件(AlphaInnotech)分析。程序計算的富集級分的濃度除以載入的富集級分的已知濃度并乘以100以確定talon富集的效率。小鼠中的免疫研究蛋白對佐劑的吸附衍生自轉(zhuǎn)基因煙草粗提取物的葉綠體富集蛋白(_2.5mg)與14稀釋在PBS中的鋁膠(氫氧化鋁凝膠,Sigma)混合,并在4°C伴隨溫和搖動下孵育過夜。樣品在4°C以2,OOOxg離心5分鐘。使用Bio-RadRC-DC蛋白分析確定吸附效率,通過比較加入佐劑的蛋白和結(jié)合至佐劑后上清液中剩余的蛋白的總量。蛋白吸附沉淀重懸于無菌PBS中至終濃度1μg/μL0免疫對于皮下注射,100μ1鋁膠或吸附于鋁膠的葉綠體衍生蛋白使用安裝有27G針頭的結(jié)核菌素注射器注入頸背。口服遞送劑量的葉材料之前在液氮中用研缽和杵研磨并在-80°C保存直到免疫那天。野生型或轉(zhuǎn)基因葉材料的口服劑量(各500mg)重懸于200μ1無菌PBS并在冰上用OMNIInternational(GLH2596)探頭同質(zhì)化5分鐘。植物細(xì)胞懸液在冰上保存直至口服遞送。200μ1小份的植物細(xì)胞懸液經(jīng)口服管飼法遞送,通過使用結(jié)核菌素注射器和20-G球狀末端胃管飼針頭。90只雌性BALB/c小鼠在7周購自CharlesRiverLaboratories,并通過下列表1中的方案免疫(下一頁)。血漿樣品的抗體滴度測定血樣收集血樣在免疫后第21、35、63、163和197天獲得。小鼠被控制并通過將goldenrod動物柳葉刀4mm、5mm或5.5mm(取決于小鼠年齡和大小)插入頌下靜脈中而收集血液。血液收集在微量采血管血漿分離管(Becton-Dickinson)中并允許在室溫下凝集最少30分鐘。血樣在15,OOOrpm離心5分鐘,將血漿轉(zhuǎn)移至新的微量離心管并貯存于_80°C。ELISA測定抗體滴度幾個96孔板(CoStarEIA/RIA板,平底無蓋ELISA板)每孔用50ng的在涂布緩沖液中(1.59gNa2CO3,>2.93gNaHCO3和0.2gNaN3,在IL水中,使用HCl調(diào)節(jié)至pH9.6)的MRA-56P/MSP119蛋白涂布。將板在4°C孵育過夜。第二天,將板用PBS-T和水洗滌三次,并用含有0.吐溫和3%脫脂奶粉的PBS在37°C封閉1小時。組5、6和9(未免疫的)的血漿樣品以下述稀釋在PTM中稀釋范圍從1100到11000的放血#1和#2;從1100到110,000的放血#3;從1500到175,000的放血#4;和從11000到1100,000的放血#5。將板洗滌并用100μ1稀釋血漿樣品孵育(雙份)并在37°C孵育1小時。將板洗滌并用100μ115,000稀釋的與辣根過氧化物酶軛合的山羊抗小鼠IgGl(AmericanQualex)在PTM中37°C孵育1小時。將板洗滌并添加100μLTMB基質(zhì)(AmericanQualexAntibodies),并在37°C孵育30分鐘。將反應(yīng)用50μL2Ν硫酸終止,將板用板讀數(shù)器(BioRad微量板讀數(shù)器,型號680)在450nm讀數(shù)讀數(shù)。使用陰性對照(未免疫的小鼠,組9)的O.D.(光密度)+0.1來確定滴度值。血漿樣品中抗瘧疾抗體的免疫印跡檢測隨后方案在上文葉綠體野生蛋白的鑒定中(p.)提到。載入SDSPAGE凝膠的蛋白樣品事先分離并保存在-80°冰箱中。36.Syg環(huán)營養(yǎng)子和裂殖體階段蛋白的樣品被電泳并通過免疫印跡分析。使用的第一抗體,從組3和5的免疫小鼠收集的血漿在5%PTM中稀釋1100。第二抗體,PIERCE穩(wěn)定的辣根過氧化物酶軛合的山羊抗小鼠在5%PTM中稀釋15,000。在與基質(zhì)孵育后,將膜暴露于X射線膜并通過膜處理器顯色來顯示條帶。血漿樣品中抗瘧疾抗體的IFA檢測3D7惡性瘧原蟲培養(yǎng)物被重懸并離心收集沉淀以檢驗含有寄生蟲的RBC。按照Tonkin等.修改的方案準(zhǔn)備和固定細(xì)胞(Tonkin,vanDooren等.2004)。細(xì)胞用PBS洗滌一次并在PBS中4%多聚甲醛和0.0075%戊二醛中室溫固定30分鐘。固定后,細(xì)胞用PBS洗滌一次并用0.1%TritonX-IOO(Sigma)透性化10分鐘,并且細(xì)胞在室溫下用0.lmg/mLNaBH4/PBS處理10分鐘以還原游離醛。細(xì)胞用PBS洗滌一次并最后用3%BSA/PBS在室溫下阻斷1小時。細(xì)胞用在3%BSA/PBS中稀釋1500的抗體(從組3和5中免疫小鼠獲得的血漿)在室溫下探針標(biāo)記2小時,隨后用PBS洗滌三次。第二抗體是在含有BSA的3%PBS中稀釋11000并在室溫下黑暗中翻轉(zhuǎn)1小時的AlexaFluor555山羊抗小鼠。細(xì)胞用PBS洗滌三次并允許在預(yù)先用PEI涂布的蓋玻片上室溫下固定30分鐘。將固定溶液含有0.lmg/mLDABCO(Sigma)的50%甘油添加至蓋玻片,然后翻轉(zhuǎn)在載玻片上。使用LSM510共聚焦激光掃描顯微鏡(CarlZeiss)觀察并捕獲熒光圖像。20體外寄生蟲抑制分析3D7惡性瘧原蟲培養(yǎng)物與環(huán)階段寄生蟲和山梨醇溶解同步。寄生蟲完成一個周期并允許成熟為營養(yǎng)子-裂殖體階段。血細(xì)胞比容和血液寄生蟲被調(diào)節(jié)至2%。9組的小鼠血漿和MRA-35PfMSPI19(陽性對照)在56°C熱滅活30分鐘并在4°C用人RBC吸收。將小鼠血漿添加至96孔板中的寄生蟲培養(yǎng)物,終濃度為20%。作為陰性對照,不向孔中加入血漿而用培養(yǎng)基替代。培養(yǎng)物孵育48小時以允許裂殖子破裂和裂殖子入侵。這些分析重復(fù)進(jìn)行。為了使用100X油浸鏡頭的顯微鏡分析,制作血涂片并用Giemsa染色,確定每個孔的每900至1,100RBC的環(huán)階段寄生蟲數(shù)目。使用下式計算血液寄生蟲(感染的RBC/感染+未感染的RBC)xl00。拍攝玻片的光學(xué)顯微照片來顯示光學(xué)顯微鏡下的血液寄生蟲和抑制的程度。結(jié)果CTB、AMA-I和MSP-1擴(kuò)增的PCR分析為了證實3D7惡性瘧原蟲中AMAl和MSP-I的表達(dá),通過使用混合階段寄生蟲的總RNA和基因特異性引物的RT-PCR檢測轉(zhuǎn)錄子(數(shù)據(jù)未顯示)。通過使用基因特異性引物、模板DNA和PCR:FCAMA-I、MSP-I和CTB以圖2:CTB、FCAMA-I和MSP-1的PCR分析所述的預(yù)期大小擴(kuò)增。如在"材料和方法"下所討論的,使用單管PCR方法和基因特異性引物擴(kuò)增DNA,結(jié)果泳道2(CTB,332bp),泳道4(FCAMA-I,383bp),和泳道6(MSP-1,289bp)。分子大小標(biāo)準(zhǔn)品在泳道1、5:lkb+梯和泳道3=Ikb梯中指示。進(jìn)入葉綠體載體的克隆分析基因FCAMA-UMSP-I和CTB被成功克隆入pGMETeasy和pBSK+載體(數(shù)據(jù)未顯示)。DNA序列在成功連接入pGEMTeasy載體后被確認(rèn)。一旦轉(zhuǎn)基因融合,CTBFCAMA-I和CTBMSP-I在pBSK+載體中構(gòu)建,它們被切除并以預(yù)期大小連接入葉綠體pLD-UTR載體,如圖3所示。然后將構(gòu)建體轟擊進(jìn)入煙草植物,普通煙草品種PetitHavana,通過"材料和方法"章節(jié)中所列方案。圖3顯示CTBFCAMA-1和CTBMSP-1克隆入pLD-UTR葉綠體載體的分析。用Qiagen質(zhì)粒大量提取試劑盒純化質(zhì)粒DNA后,DNA通過凝膠電泳分析。CTBFCAMA-I描繪于泳道3未消化和泳道6用Notl和Ndel消化得到715bp片段。CTBMSP-I描繪于通道7用Notl和Ndel消化后(621bp片段)。在泳道2、4、5中基因被插入pLD-UTR載體但未進(jìn)一步研究。分子大小標(biāo)準(zhǔn)品在泳道1,8=Ikb梯中指示。轉(zhuǎn)基因的葉綠體整合的確認(rèn)將基因盒(aadA和CTBFCAMA-I/CTBMSP-1)通過pLD-UTR載體(trnl和trnA)的側(cè)翼序列與天然質(zhì)體基因組的同源重組而導(dǎo)入煙草葉綠體基因組。trnl基因的Prrn下游用于轉(zhuǎn)錄賦予奇霉素和鏈霉素抗性的aada和編碼CTB瘧疾基因的轉(zhuǎn)基因。trnA基因的3’UTR上游提供轉(zhuǎn)錄子穩(wěn)定性并且可以參與核糖體募集??剐匝砍霈F(xiàn)在含有奇霉素的再生培養(yǎng)基(RMOP)上。使用特異性引物和PCR分析,突變和核整合的芽從轉(zhuǎn)基因整合入葉綠體基因組的芽分化。通過使用3P/3M引物,確認(rèn)了基因盒的位點特異性整合。為了消除所有核轉(zhuǎn)化子,使用了3P引物,因為其與天然葉綠體基因組退火。使用3M引物,因為其登錄aadA基因并消除了所有突變的轉(zhuǎn)化子。3P/3M引物、抗性芽和PCR分析產(chǎn)生了圖4所示1.65kb條帶(左圖)。使用另一組引物5P/2M確認(rèn)了aadA基因和CTB-瘧疾基因的整合。5P引物與aadA基因退火,2M引物與trnA基因退火。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物大小CTBFCAMA-I是2.3kb和CTBMSP-I是2.2kb,如圖4所示(右圖)。5P/2MPCR分析消除了所有突變體并僅顯示了具有轉(zhuǎn)基因整合的陽性轉(zhuǎn)化子。使陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)過第二輪和第三輪篩選以確認(rèn)同質(zhì)性。圖4描繪了野生型和陽性轉(zhuǎn)化子的PCR分析。使用登錄天然葉綠體基因組和aadA基因(3P3M)的特異性引物的PCR產(chǎn)生1.65kb產(chǎn)物泳道2,14陽性對照,泳道3,15野生型,泳道4-6轉(zhuǎn)基因系pLD-UTRCTBFCΑΜΑ-Ι,和泳道16,17轉(zhuǎn)基因系pLD-UTRCTB-MSP-I。使用登錄aadA基因和trnA基因的特異性5P/2M引物分別產(chǎn)生2.3kb和2.2kb產(chǎn)物泳道8,19陽性對照,泳道9,20野生型,泳道10,11陰性轉(zhuǎn)化子pLD-UTRCTBFCAMA-1,泳道12轉(zhuǎn)基因系pLDUTRCTBFCAMA-1,和泳道21,22轉(zhuǎn)基因系pLD-UTRCTB-MSP-I。分子大小標(biāo)準(zhǔn)品指示于泳道1,7,13,18Ikb+梯。轉(zhuǎn)基因植物的southern分析為了確認(rèn)位點特異性整合和同質(zhì)性植物,轉(zhuǎn)基因植物基因組DNA用大小為1.3kb的2P/2M側(cè)翼序列探針探測。轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因基因組DNA用限制酶Apal消化。消化后,未轉(zhuǎn)化的葉綠體基因組產(chǎn)生4.5kb片段,轉(zhuǎn)化的葉綠體基因組產(chǎn)生CTBMSP-I和CTBFCAMA-I的分別為6.5和6.6kb的片段,如圖5所示。圖5描繪了通過southern印跡評價轉(zhuǎn)基因整合入同質(zhì)植物的葉綠體基因組。用2P/2M側(cè)翼序列探針探測的Southern印跡確定同質(zhì)泳道1野生型,泳道2同質(zhì)CTBMSP-I(6.5kb),和泳道3同質(zhì)CTBFCAMA-I(6.6kb)。轉(zhuǎn)基因植物的選擇和產(chǎn)生通過使用RMOP培養(yǎng)基和奇霉素選擇和產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物(圖6A)。陽性轉(zhuǎn)化子通過PCR分析確定后,保持轉(zhuǎn)基因芽的進(jìn)一步選擇和產(chǎn)生(圖6B)。含有奇霉素的MSO選擇培養(yǎng)基用于出芽。一旦體外植物通過southern印跡分析確認(rèn),植物被轉(zhuǎn)移至溫室以最佳生長和最大蛋白表達(dá)(圖6C)。圖6題目為轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生。(A)4至5周的粒子轟擊后,葉綠體轉(zhuǎn)基因芽出現(xiàn)在RMOP選擇培養(yǎng)基上。為了第二輪選擇,來自PCR陽性轉(zhuǎn)化子的葉被轉(zhuǎn)移至RMOP選擇培養(yǎng)基。(B)幾種芽出現(xiàn)在2至3周內(nèi)。為了第三輪選擇,再生的芽被轉(zhuǎn)移至MSO選擇培養(yǎng)基,并且芽在約10天內(nèi)出現(xiàn)。(C)在通過southern印跡分析確認(rèn)同質(zhì)植物后,植物被轉(zhuǎn)移至溫室ο免疫印跡分析大約50μg野生型和轉(zhuǎn)基因植物的粗提取物連同大腸桿菌表達(dá)的CTBMSP-I提取物載入SDS-PAGE凝膠的孔中。印跡用多克隆抗CTB第一抗體探測,CTBFCAMA-I的單聚形式顯示27.5kDa蛋白,并且CTBMSP-I描繪了不溶性(沉淀)和可溶性(上清液)級分中23kDa蛋白(圖7)。免疫印跡展現(xiàn)了CTB瘧疾蛋白的其他形式,例如二聚體、三聚體、四聚體和五聚體(圖7)。圖7顯示免疫印跡分析證實CTB瘧疾抗原在普通煙草粗提取物中的表達(dá),具有抗CTB多克隆抗體的免疫印跡顯示全長蛋白。泳道1,5野生型,泳道2,6陽性對照CTBMSP-I大腸桿菌表達(dá)的,泳道3=CTBFCAMA-I沉淀,泳道4=CTBFCAMA-I上清液,泳道7CTBMSP-I沉淀,和泳道8=CTBMSPl上清液。使用ELISA的蛋白定量為了定量葉綠體衍生CTB瘧疾蛋白的蛋白質(zhì)水平,已知濃度的CTB蛋白如圖8所示被優(yōu)化(上圖)。成熟葉的CTBFCAMA-I和CTBMSP-I蛋白表達(dá)水平分別達(dá)到6.3-9.5%和1.4-2%,如圖8所示(下圖)。高水平表達(dá)的CTB瘧疾蛋白的聚集是由于高數(shù)目的葉綠體和葉綠體基因組的存在(每細(xì)胞達(dá)10,000拷貝)。圖8顯示葉綠體衍生的CTB瘧疾表達(dá)的定量。具有下述表達(dá)水平的ELISA測定定量成熟葉的總可溶性蛋白的6.3-9.5%的CTBFCAMA-I和1.4_2%的CTBMSP-I。葉綠體衍生CTB瘧疾蛋白的富集富集蛋白的拆分葉綠體衍生蛋白的粗提取物經(jīng)受talon純化和隨后分析。使用梯度凝膠增加富集的CTBFCAMA-I蛋白的拆分。在還原和非還原條件下運行凝膠。核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的大亞基(55kDa)在還原和非還原條件下的野生型、裂解物和流過級分中是明顯的(圖9)。在洗滌級分中存在最小的條帶。在洗脫的CTBFCAMA-I級分中,大小為27.5kDa的單體在還原條件下存在并且五聚體形式在還原和非還原條件下存在(圖9)。圖9顯示葉綠體衍生的CTBFC-AMA-I蛋白在Talon純化后增加的拆分。CTBFC-AMA-I蛋白從轉(zhuǎn)化的葉提取,并且粗提取物經(jīng)受Talon超流金屬親和樹脂并分析。使用梯度凝膠(4-12%)和凝膠電泳觀察到CTBFC-AMA-I蛋白富集的泳道2_6還原條件和泳道8-12非還原條件。顯示了下述片段泳道2,8野生型,泳道3,9裂解物,泳道4,10流過物,泳道5,11洗液,和泳道6,12富集的蛋白。分子大小標(biāo)準(zhǔn)品在泳道1,7:lkb梯中指7J\ο富集蛋白的免疫印跡分析進(jìn)行用抗CTB抗體探測的免疫印跡來確認(rèn)在talon富集后CTB瘧疾蛋白的存在。來自野生型、裂解物、流過物、洗液和富集的等量蛋白載入凝膠并通過免疫印跡顯示。在含有從野生型葉收獲的蛋白的級分中,導(dǎo)致免疫印跡分析中無明顯條帶(圖10)。與裂解物相比,在流過級分和洗滌級分中發(fā)現(xiàn)較低水平的CTB瘧疾蛋白,并且在富集級分中發(fā)現(xiàn)顯著的蛋白表達(dá),證實CTB瘧疾蛋白的富集。圖10來自普通煙草提取物的瘧疾抗原的富集的免疫印跡分析。瘧疾蛋白從轉(zhuǎn)化的葉提取并且粗提取物經(jīng)受Talon超流金屬親和樹脂,下述級分被收集并使用多克隆抗CTB抗體的免疫印跡分析泳道1,6野生型,泳道2,7裂解物,泳道3,8流過物,泳道4,9洗液,和泳道5,10分別是洗脫的CTBFCAMA-I和CTBMSP-I。光密度分析已知濃度的CTB蛋白和不同濃度的富集級分的免疫印跡用抗CTB抗體探測。免疫印跡上富集CTB瘧疾蛋白的定量通過斑點光密度法分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性通過使用1000、500、250和125ngCTB來獲得(數(shù)據(jù)未顯示)輔以相同印跡中富集樣品的評估(圖11)。標(biāo)準(zhǔn)曲線提供了富集級分的濃度,talon富集的效率被確定為在CTBFCAMA-I和CTBMSP-I中分別為90%和73%。圖11分析了洗脫蛋白級分的免疫印跡并與已知量的CTB蛋白相比較。泳道1-4和10-13:CTB蛋白(分別為1000、500、250、125叫)、泳道6-9洗脫的CTBFCAMA-I(分別為1.5,0.75,0.375,0.1875g)和泳道14-16洗脫的CTBMSP-I(分別為1.5,0.75,0.375μg)的免疫印跡分析。洗脫的蛋白和CTB經(jīng)受光密度法以確定待皮下注射施用于小鼠的CTBFCAMA-I和CTBMSP-I的富集。小鼠的免疫免疫后5次放血收集的血漿分別在免疫后第21、35、63、163和197天。通過MRA-56PfMSPI19蛋白的捕獲ELISA測試每個血漿的抗PfMSPI19抗體。從放血#1和#2檢測最小的小鼠滴度,放血#3、#4和#5中存在范圍1100-150,000的滴度(表2)。發(fā)現(xiàn)組5(皮下注射)中抗PfMSPI19的滴度高于組6(口服遞送)(表2)。組5中的一只小鼠(5B3)和組6中的三只小鼠(6A1,6A3,6B4)表現(xiàn)了MRA_56PfMSPI19蛋白不可檢測的滴度(表2;下一頁)??汞懠部贵w對天然寄生蟲蛋白的識別免疫印跡證實免疫小鼠的抗瘧疾抗體識別惡性瘧原蟲寄生蟲培養(yǎng)物的天然寄生蟲蛋白???AMAl抗體識別了裂殖體階段,存在83kDa條帶和其他酶解片段。組5的免疫小鼠的血漿含有抗MSP-I抗體,其識別具有明顯190kDa條帶的環(huán)和裂殖體階段(圖12)。圖12抗AMA-I和抗MSPl抗體識別天然寄生蟲蛋白。顯示從免疫小鼠收集的泳道1-3抗AMA-I的免疫印跡識別天然83kDaAMA-I蛋白和酶解片段,泳道4_6抗MSP-I識別190kDaMSP-I蛋白。從3D7惡性瘧原蟲培養(yǎng)物分析的寄生蟲階段包括泳道1,4環(huán),泳道2,5:營養(yǎng)子,和泳道3,6:裂殖體。抗瘧疾抗體識別天然寄生蟲從葉綠體衍生CTB瘧疾抗原免疫的小鼠收集的血漿導(dǎo)致天然寄生蟲的識別。抗AMA-I抗體存在于免疫的血清中,因為天然寄生蟲在寄生蟲頂端染色(圖13B,C)。葉綠體衍生的CTB-MSP-I抗原免疫的小鼠產(chǎn)生染色的裂殖體,表明抗MSP-I抗體的存在(圖13E,F(xiàn))。圖13抗AMA-I和抗MSP-I抗體識別天然寄生蟲。用小鼠中產(chǎn)生的顯示寄生蟲頂端的識別的(A,B,C)抗AMA-I和從免疫小鼠血漿收集的識別裂殖體寄生蟲MSP-I的(D,E,F(xiàn))抗MSP-I免疫染色的3D7惡性瘧原蟲的視覺和免疫熒光(IFA)圖像。體外寄生蟲抑制分析進(jìn)行體外寄生蟲抑制分析以測試抗AMA-I和MSP-I抗體抑制寄生蟲進(jìn)入紅細(xì)胞的能力。同步的營養(yǎng)子-裂殖體階段寄生蟲(2%血液寄生蟲和2%血細(xì)胞比容,圖14A)與對照孵育并測試血漿48小時,制作血涂片。載玻片用Giemsa染色,計數(shù)寄生蟲數(shù)目和RBC總數(shù)目。測定血液寄生蟲,計算百分比抑制。在顯微檢查下發(fā)現(xiàn)的主要階段是環(huán)階段??瞻讓φ?不添加血漿)的平均血液寄生蟲測定為6.6%(圖14B),而發(fā)現(xiàn)的最低血液寄生蟲來自組5(2.5%,圖14D),代表具有最高百分比的寄生蟲入侵抑制的組(表3)。陽性對照血漿(抗純化的重組酵母分泌的PfMSPI19,3D7的MRA-35兔抗血清,圖14C)產(chǎn)生僅53%抑制(表3)。對照組(組1,2,9)產(chǎn)生7.6-13.6%抑制,其余實驗組(組3,4,6,7,8)產(chǎn)生45.5-56.1%抑制(表3;下一頁)。血液寄生蟲和抑制的顯微分析圖14體外寄生蟲抑制分析的顯微檢查。同步的3D7惡性瘧原蟲營養(yǎng)子-裂殖體階段培養(yǎng)物(2%血液寄生蟲和血細(xì)胞比容,圖14A)以及無血漿(圖14B)、MRA-35PfMSPI1924血漿(圖14C)和來自組5的免疫小鼠血漿(圖14D)被孵育48小時;血液寄生蟲通過計數(shù)感染和未感染RBC來評估。食用植物的擴(kuò)增研究CTB-AMAl和CTB-MSP1在萵苣葉綠體中的表達(dá)葉綠體轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建使用萵苣的內(nèi)源性調(diào)節(jié)元件構(gòu)建萵苣葉綠體轉(zhuǎn)化載體pLsDVCTB-AMA1和PLsDVCTB-MSP1。Prrn:aadA:rbcL選擇性標(biāo)記基因盒含有從萵苣葉綠體基因組擴(kuò)增的rrn啟動子和rbcL3,未翻譯區(qū)(UTR)并克隆入pLsDV。psbA:CTB_AMAl:psbA和psbA:CTB-AMAl:psbA表達(dá)盒含有萵苣的天然psbA5’和3’UTR。選擇性標(biāo)記基因盒和CTB-AMAl和CTB-MSPl融合基因表達(dá)盒隨機(jī)克隆并插入基于pUC的萵苣靶向載體(pLsDV;圖15,C)在trnl和trnA之間的獨特puvII限制位點(位置103002),導(dǎo)致最終的萵苣葉綠體載體pLsDVCTB-AMA-1和pLsDVCTB-MSP-1,如Verma和Daniell(2007);Verma等.,(2008)所述。材料和方法萵(Lactucasativa)變種的植物轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植物種子選擇。Simpsonelite(NewEnglandSeedCo.,Hartford,CT,USA)在30%ChlorOX商業(yè)漂白劑和0.01%吐溫-20中表面消毒5分鐘,在無菌水中洗滌五次,并在用6gL-IPhytablend(Caisson,NorthLogan,UT,USA)固化的半強(qiáng)度Murashige和Skoog(MS)培養(yǎng)基上涂布。21天的幼小完全擴(kuò)增的葉(4cm2)近軸側(cè)向上放在無抗生素的萵苣再生(LR)培養(yǎng)基上,所述培養(yǎng)基含有MS基本鹽、硫胺-HClIOmgL-I、肌醇IOOmgL—1、甘氨酸2mgL—1萘乙酸(NAA)0.ImgΓ1和6-芐基氨基嘌呤(BAP)0.2mgΓ1。將葉用涂布了質(zhì)粒pLsDV-CTB-AMA1.DV;pLsDVCTB-MSPl[圖15(a)和(b)]的0.6-μm金顆粒轟擊,使用顆粒遞送系統(tǒng)PDS-1000/He(Bio-Rad,Hercules,CA,USA),采用900psi破裂片和6cm的靶距離,如Verma等.(2008)描述。轟擊的葉在25°C下黑暗中孵育2天,然后取0.5-cm2塊狀外植體。外植體近軸側(cè)向下放在含有50mgΓ1二鹽酸奇霉素的LR培養(yǎng)基上。通過PCR篩選主要再生子的葉綠體轉(zhuǎn)基因事件,將陽性芽在LR培養(yǎng)基上經(jīng)受額外的再生循環(huán)。第二再生之后,將芽植入含有半強(qiáng)度MS基本鹽、硫胺-HClIOmgL-1JjWIlOOmgL—1和奇霉素lOOmgL—1的萵苣發(fā)育(LDS)。將小植株植入Jiffy泥炭鍋并在轉(zhuǎn)移至溫室進(jìn)行產(chǎn)種之前適應(yīng)生態(tài)環(huán)境。TO種子在種子變黑并且軟毛可見時收獲。種子在萌發(fā)之前在室溫下風(fēng)干。無菌種子(20-40)放在含有IOOmgΓ1奇霉素的MS培養(yǎng)基上以確認(rèn)胞質(zhì)母體遺傳性。PCR分析證實轉(zhuǎn)基因整合入萵苣,使用QiagenDNeasy植物迷你試劑盒(Qiagen,Valencia,CA)從轉(zhuǎn)基因和野生型植物提取葉綠體基因組DNA。使用peltier熱循環(huán)儀PTC-100(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)進(jìn)行PCR。aadA基因整合入葉綠體基因組使用16s正向引物(5,CAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGA3;SEQIDNO9)(與天然葉綠體基因組退火)和aadA基因特異性引物(5,CCGCGTTGTTTCATCAAGCCTTACG3,)(與aadA基因退火)評價。PCR反應(yīng)含有IXTaq緩沖液、0.5mMdNTP、0.2mM16s正向引物、0.2mM3M反向引物、0.05單位μI-ITaq聚合酶、0.5mMMgCl2和模板DNA。樣品如下進(jìn)行30個循環(huán)94°C、1分鐘,55°C、1分鐘和72°C、3分鐘,在PCR循環(huán)開始時95°C下5分鐘上升,并在30個循環(huán)結(jié)束時72°C保持10分鐘。PCR產(chǎn)物在0.7%瓊脂糖凝膠上分離。轉(zhuǎn)基因整合和同質(zhì)性的確認(rèn)總的植物DNA用HindIII在37°C下消化lh,然后在0.7%凝膠上65V下運行5_6h。在轉(zhuǎn)移之前,凝膠脫嘌呤(0.25NHCl,15min)并變性(0.4NNaOH,20min),轉(zhuǎn)移DNA至硝酸纖維素膜過夜。含有轉(zhuǎn)移的DNA的膜在2xSSC(0.3MNaCl,0.03M乙酸鈉)中簡單沖洗,濾紙上干燥并使用GSGeneLinker(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)將DNA交聯(lián)至膜上。通過用BamHI消化僅含有trnl和trnA側(cè)翼序列的pLsDV基本靶向載體產(chǎn)生1.Ikb片段(使用Qiaquick凝膠提取試劑盒(QiagenInc.Valencia,CA,USA)凝膠純化)來制備側(cè)翼序列。探針通過與Q32P(-dCTP)和Ready-To-GoDNA標(biāo)記珠(GEHealthcare,ElPaso,TX)孵育1小時而標(biāo)記。過量的32P使用ProbeQuantG—50微量柱(Amersham,ArlingtonHeights,IL)去除。然后,標(biāo)記的探針使用StratageneQUICK-HYB雜交溶液和方案(Stratagene,LaJoIIa,CA,USA)用硝酸纖維素膜雜交。放射標(biāo)記膜-80°C暴露于藍(lán)色敏感性放射自免疫膜BX(MIDSCI,St.Louis,Missouri)16h。蛋白提取確認(rèn)的同質(zhì)植物的新鮮健康葉用于提取蛋白。葉組織用研缽和杵在液氮中研磨,大約IOOmg粉末葉放入300μ1植物提取緩沖液(PEB)[IOOmMNaCl、20mMEDTA、200mMTris-HCl.O.1%SDS、0.5%吐溫-20、14mM2-巰基乙醇、0.ImM苯甲烷磺酰氟、一片完全蛋白酶抑制劑混合物(RocheDiagnostics,UK)和IOOmM二硫蘇糖醇]。離心之前,100μ1勻漿放入預(yù)冷的微量離心管。然后將剩余植物提取物在10,OOOxg離心5分鐘來沉淀不溶性植物材料。上清液被分成三份并貯存在-80°C。將沉淀重懸于300μ1PEB以檢查沉積蛋白的存在。總可溶性蛋白的評估葉樣品勻漿的總可溶性蛋白(TSP)使用Bio-RadBradford蛋白分析(BBPA)來評估。牛血清白蛋白(BSA)用作蛋白標(biāo)準(zhǔn)品來構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。范圍從0.05至l.OygμΓ1的BSA水稀釋液以及110和120植物稀釋液在水中制成。10μ1不同濃度的BSA標(biāo)準(zhǔn)品和植物樣品載入96孔微量滴定板中的兩個孔。一份濃縮的BBPA染料添加到四份蒸餾水并過濾除菌。含有標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和提取緩沖液(作為空白)的孔載入200μ1稀釋的BBPA染料。將板在室溫下孵育5分鐘,使用微量板讀數(shù)器(Model680,Bio-Rad,Hercules,CA,USA)測量吸光度。免疫印跡分析檢查TSP后,10μg樣品通過12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜以免疫印跡,根據(jù)Kumar和Daniell(2004)。通過SDS-PAGE凝膠分離的蛋白通過電印跡被轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,膜用3%非脂肪干乳阻斷過夜。為了檢測CTB-AMAl和CTB-MSPl融合蛋白,將印跡與13000兔抗CTB第一多克隆抗體(Sigma,St.Louis,M0,USA)、隨后1:5000HRP-軛合的驢抗兔第二抗體(Southernbiotech,Birmingham,AL,USA)孵育。SuperSignalWestPico化學(xué)發(fā)光基質(zhì)試劑盒(Pierce,Rockford,IL,USA)用于放射自顯影檢測。萵苣的CTB-AMAl和CTB-MSPl融合蛋白的評估在用純化的CTB標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma,St.Louis,MO,USA)和葉提取物勻漿涂布的96孔平底微量滴定板(Costar96-孔EIA/RIA(Costar,CorningInc.NY,USA)中雙份進(jìn)行ELISA。標(biāo)準(zhǔn)品在涂布緩沖液(15mMNa2CO3,35mMNaHCO3,3mMNaN3,pH9.6)中稀釋。100μ1范圍從6.25至200ngml—1的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品稀釋液110,000,120,000用于涂布96孔微量滴定板,在4°C下孵育過夜。背景用磷酸緩沖鹽水中3%脫脂乳和0.05%吐溫-20(PBST)阻斷,在37°C孵育1小時,并用PBST和水交替洗滌三次。100μ1在含有3%乳的PBST中稀釋的抗CTB多克隆抗體(Sigma,St.Louis,MO,USA)被載入孔,在37°C孵育1小時。然后孔用PBST和水洗滌三次并載入100μ1稀釋的(15000)HRP軛合的小鼠抗兔(Southernbiotech,Birmingham,AL,USA),在37°C孵育1小時,用PBST和水洗滌孔。100μ1的3.3’,5.5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)基質(zhì)加入孔,在室溫孵育10-15min。反應(yīng)通過添加50μ12ΝH2S04而終止。微量滴定板使用板讀數(shù)器(Model680,Bio-Rad,Hercules,CA,USA)在45nm讀取。結(jié)果萵苣載體pLsDVCTB-AMA-I和pLsDVCTB-MSP-IpLsDVCTB-AMA-I(8.6kb)禾口pLsDVCTB-MSPl(8.6kb)如Verma和Daniell(2007);Verma等.(2008)所述被克隆以轉(zhuǎn)化萵苣葉綠體。表達(dá)盒包括葉綠體操縱子啟動子、核糖體結(jié)合序列(GGAGG;SEQIDNO10)、選擇性標(biāo)記基因(aadA)、3,UTR、5,UTR(PpsbA)、CTB_amal或CTB-mspl及其3’UTR(TpsbA)??捎少|(zhì)體和核編碼RNA聚合酶識別的組成型16s核糖體操縱子啟動子用于驅(qū)使aadA和CTB融合的AMAl和MSPl基因的轉(zhuǎn)錄。賦予奇霉素抗性的aadA基因用于檢測轉(zhuǎn)基因芽。編碼端膜抗原-1和裂殖子表面蛋白-1的CTB-AMA-I和CTB-MSP-I基因由psbA5’和3’元件調(diào)節(jié)。psbA的5’UTR,包括其啟動子,用于轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)CTB-AMA-I和CTB-MSP-1,并且其也用于翻譯增強(qiáng),因為其具有核糖體結(jié)合位點的幾個序列。其用作蛋白質(zhì)合成的光調(diào)節(jié)增強(qiáng)翻譯的支架。3’psbA-UTR賦予了轉(zhuǎn)錄子穩(wěn)定性。載體使用靶向葉綠體基因組的trnl和trnA基因間間隔區(qū)的生物導(dǎo)彈方法被遞送入葉綠體。選擇性標(biāo)記基因aadA和融合基因CTB-amal和CTB-mspl通過同源重組整合入葉綠體基因組。轉(zhuǎn)基因整合入原質(zhì)體系PCR分析轟擊之后,離體葉片在補(bǔ)充有50μgπιΓ1用于選擇的奇霉素的LR培養(yǎng)基上培養(yǎng)。當(dāng)10個萵苣葉被轟擊時,三周選擇之后,觀察到5至6個奇霉素抗性芽。這些奇霉素抗性芽通過PCR篩選葉綠體轉(zhuǎn)化,具有兩個特異性引物,16s正向引物和3M反向引物。來自pLsDVCTB-ΑΜΑ-Ι的所有六個抗性芽和來自pLsDVCTB-MSP-I的五個顯示葉綠體轉(zhuǎn)基因系的PCR陽性(圖16)。Southern分析證實葉綠體整合和同質(zhì)性PCR陽性植物進(jìn)一步通過southern分析來檢驗以證實位點特異性整合并確定它們是同質(zhì)性還是異質(zhì)性。當(dāng)葉綠體內(nèi)所有基因組拷貝穩(wěn)定整合轉(zhuǎn)基因時實現(xiàn)同質(zhì)性。轉(zhuǎn)化的和野生型植物的總植物DNA被提取,每個樣品的0.5μgDNA用HindIII消化,產(chǎn)生9.Ikb(野生型)、11.6kb(pLsDVCTB-AMA-1)和11.5kb(pLsDVCTB-MSP-l)轉(zhuǎn)基因系,此時與pLsDV-側(cè)翼基本載體制備的1.13kbtrnl-trnA側(cè)翼探針雜交(圖15C)。來自第三輪選擇的所有PLsDVCTB-AMA-I和pLsDVCTB-MSP-I轉(zhuǎn)基因植物顯示同質(zhì)性(圖17)。萵苣葉綠體中CTB-AMAl和CTB-MSP1表達(dá)IOOmg葉組織的植物提取緩沖液中提取總蛋白,對含有CTB-AMA-l和CTB-MSP-l轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行免疫印跡。用CTB多克隆抗體的免疫檢測顯示CTBAMA-I印跡上27.5kDa的CTB融合多肽(圖18和19))和CTBMSP-I印跡上23kDa的CTB融合多肽(圖20)。觀察到了CTB-AMAl和CTB-MSPl融合蛋白的二聚體、三聚體、四聚體和五聚體的形成。大量蛋白可以在沉淀中檢測(圖19)。因此,CTB-AMA-I和CTB-MSP-I的定量使用勻漿進(jìn)行。葉綠體表達(dá)的CTB-AMAl和CTB-MSP1的定量進(jìn)行ELISA來定量萵苣和煙草勻漿中葉綠體衍生的CTB_AMA_1和CTB_MSP_1抗原。使用純化的細(xì)菌CTB獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。萵苣植物用pLsDVCTB-AMA-I轉(zhuǎn)化,pLsDVCTB-MSP-I構(gòu)建體表達(dá)CTB-AMA-I和CTB-MSP-1。煙草成熟葉的CTB-AMA-I和CTB-MSP-I蛋白表達(dá)水平分別達(dá)到TSP的12.3%和8%。然而,在萵苣中,CTB-AMA-I和CTB-MSP-I蛋白表達(dá)水平在溫室生長條件下分別達(dá)到TSP的9.4%和4.8%(圖21);(表4)。煙草和萵苣的IOOmg成熟葉分別產(chǎn)生3.33mg和1.56mgCTB-AMA-I融合蛋白。分別在轉(zhuǎn)化的煙草和萵苣中產(chǎn)生IOOmg成熟葉產(chǎn)生2.16mg和0.66mgCTB-MSP-l抗原。討論目前,盡管有許多瘧疾寄生蟲的基因組和蛋白質(zhì)組的了解,還沒有用于預(yù)防瘧疾疾病的批準(zhǔn)的疫苗(Sharma和Pathak2008)。對瘧疾疫苗的需要是必須的,因為疾病的全球負(fù)擔(dān)由于藥物抗性、蚊子對殺蟲劑的抗性、無效的控制措施、疾病重新出現(xiàn)和增加的旅游而增加。瘧疾疫苗研究考察了臨床實驗中的幾種疫苗候選物,但是結(jié)果令人失望,低的滴度和差的效力。研究導(dǎo)致了AMA-I和MSP-I的發(fā)現(xiàn),AMA-I和MSP-I是主要的無性血液階段瘧疾疫苗候選抗原的兩種。在本工作中,AMA-I和MSP-I的瘧疾基因通過PCR連同跨粘膜載體CTB成功擴(kuò)增。CTB包括在本研究中,因為其對免疫系統(tǒng)的潛在輔助活性以及作為口服免疫原起作用的可能性(Li和Fox1996)。融合CTB瘧疾基因盒在pBSK+載體中構(gòu)建。瘧疾抗原已經(jīng)在幾種系統(tǒng)中表達(dá),例如在大腸桿菌(Sachdeva,Mohmmed等.2006)、酵母(Gozalo,Lucas等.1998)和哺乳動物細(xì)胞(Burghaus,Gerald等.1999)中;然而,諸如不正確折疊、低收率和昂貴的生產(chǎn)和純化程序等缺點依然存在。植物可以視為疫苗開發(fā)中的替代產(chǎn)品,因為它們可以減少由于純化、加工、冷藏和遞送的花費的成本。在本工作中,在葉綠體系統(tǒng)中表達(dá)CTB瘧疾抗原的主要目的是開發(fā)更安全和更有效的瘧疾疫苗。通過使用側(cè)翼序列trnl和trnA,具有CTB瘧疾盒的葉綠體pLD_UTR載體通過同源重組被整合入葉綠體基因組。PLD-UTR載體含有編碼氨基糖苷3’腺苷酸轉(zhuǎn)移酶的aadA,轉(zhuǎn)基因芽由于其對奇霉素的抗性而被選擇(Svab和Maliga1993)(Verma和Daniell2007)。3P/3M和5P/2M引物和PCR證實了基因盒整合入葉綠體基因組。陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)受第二和第三輪選擇而出去任何剩余的野生型細(xì)胞。通過使用側(cè)翼序列探針的southern印跡分析,轉(zhuǎn)基因植物被證實為同質(zhì)的(僅存在轉(zhuǎn)化的基因組)。CTBFCAMA-I和CTBMSP-I的表達(dá)在轉(zhuǎn)基因系中由psbA5,UTR驅(qū)動并通過免疫印跡確認(rèn)。發(fā)現(xiàn)蛋白在不溶性(沉淀)和可溶性(上清液)級分中為27.5kDa(在CTBFCAMA-I中)和23kDa(在CTBMSP-I中),如圖7所示。連同CTB瘧疾單體的表達(dá),免疫印跡表現(xiàn)出其他形式,例如二聚體、三聚體、四聚體和五聚體。成熟葉中CTBFCAMA-I和CTBMSP-I28蛋白的表達(dá)水平分別達(dá)到6.3-9.5%和1.4-2%,如圖8所示。CTBFCAMA-I和CTBMSP-I的表達(dá)水平與萵苣中的CTB-Pins相當(dāng),1.8%TSP(Ruhlman,Ahangari等.2007),但在煙草中觀察到更高水平,14.8%的Fl-V聚集(Arlen,Singleton等.2008),14%炭疽保護(hù)性抗原(Koya,Moayeri等.2005),和16%CTB-Pins(Ruhlman,Ahangari等.2007)。盡管在煙草中觀察到葉綠體野生的CTB瘧疾蛋白更低水平的表達(dá),但是依然提供足以進(jìn)行動物或臨床前研究的表達(dá)水平(Ruhlman,Ahangari等.2007)。通過皮下注射施用給小鼠的抗原被富集而非純化,因為CTB瘧疾蛋白不含有促進(jìn)純化的表位標(biāo)簽。已知CTB結(jié)合固定化的鎳離子(Dertzbaugh和Cox1998),這導(dǎo)致使用鎳珠富集植物提取物中的CTB瘧疾抗原。CTB瘧疾抗原使用鎳珠成功富集,為了保證足以進(jìn)行免疫研究的量,使用了talon富集??煽诜f送的植物材料通過口服管飼法施用至小鼠。按照表1所示免疫方案來比較葉綠體衍生的皮下注射與口服遞送。免疫后,從五只不同的血液收集血漿并通過MRA-56PfMSPl19蛋白的捕獲ELISA測試抗PfMSPl19抗體。免疫研究證實,葉綠體衍生的瘧疾抗原在組5和6中是免疫原性的。組3和4的滴度未完成,因為缺乏AMA-I蛋白。而且,組7和8的滴度未完成,因為缺乏足量的MSP-I蛋白。小鼠滴度范圍從0-150,000,在放血#3、#4和#5中具有較高滴度,與組6(口服遞送)相比在組5CTBMSP-I(皮下注射)具有較高滴度。四只小鼠顯示了ELISA和MRA-56PfMSPl19蛋白不可檢測的滴度(組5中的一只小鼠和組6中三只小鼠)(表2)。與組6相比,可以在組5中觀察到更高的滴度,因為在每只小鼠口服管飼法中遞送精確量的抗原是困難的。IFA和免疫印跡證實免疫小鼠的血漿分別識別天然寄生蟲和天然寄生蟲抗原。為了考察小鼠是否在免疫后引發(fā)AMA-I和MSP-I抗體以及它們是否防止寄生蟲侵入RBCS,進(jìn)行了體外寄生蟲抑制分析。如果抗瘧疾抗體出現(xiàn)在從免疫小鼠收集的血漿中,則侵入分析后血液寄生蟲減少。在對照組,空白孔(未添加血漿);血漿來自用非轉(zhuǎn)基因植物材料或單獨的鋁膠免疫的小鼠,并且小鼠未接受免疫,觀察到相同水平的血液寄生蟲。從用可注射CTB瘧疾抗原免疫的小鼠收集的血漿觀察到抑制,具有最高抑制百分比的口服遞送在接受皮下注射CTBMSP-I的小鼠中發(fā)現(xiàn)。從用酵母分泌的PfMSPl19免疫的小鼠收集的未純化抗體(MRA-35PfMSPl19)導(dǎo)致53%抑制,這與用葉綠體衍生CTB瘧疾抗原免疫的小鼠相當(dāng)。結(jié)論瘧疾是全球主要的媒介傳播寄生蟲病和嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題,并且特別在貧窮的發(fā)展中國家流行。非常需要產(chǎn)生低成本人瘧疾疫苗,消除繁雜的純化技術(shù)和技術(shù)技能。本工作公開了兩個主要血液階段瘧疾疫苗候選物AMA-1和MSP-1在具有CTB的融合盒中構(gòu)建。CTB瘧疾抗原通過質(zhì)體轉(zhuǎn)化在煙草植物中表達(dá)并且CTBFCAMA-I和CTB-MSP-I從中等水平到高等水平聚集,分別為總可溶性蛋白的約9.5%和2%。葉綠體衍生的CTB瘧疾蛋白通過兩種途徑之一施用至小鼠,通過皮下注射或通過口服管飼法??乖拿庖咴员淮_定為1100-150,000的范圍內(nèi),與組6相比,組5小鼠中發(fā)現(xiàn)更高的滴度。為了最大化組6小鼠的滴度,需要開發(fā)改進(jìn)的方法用于將等量抗原遞送給每個小鼠。發(fā)現(xiàn)從CTBFCAMA-I和CTBMSP-I免疫的小鼠收集的血漿識別IFA和免疫印跡分析中天然寄生蟲和天然寄生蟲蛋白,表明抗AMA-I和抗MSP-I在免疫小鼠中引發(fā)。發(fā)現(xiàn)抗瘧疾抗體抑制具有最高抑制百分比的紅細(xì)胞的寄生蟲入侵,發(fā)生在通過皮下注射CTBMSP-I免疫小鼠中。在可以考察體內(nèi)激發(fā)和保護(hù)之前,需要建立適當(dāng)?shù)膭游锬P汀_@些考察結(jié)果可以導(dǎo)致使用其他瘧疾抗原和特別是使用轉(zhuǎn)化的食用植物的進(jìn)一步瘧疾疫苗開發(fā)實驗??紤]到上述的具體描述、發(fā)明概述和,本發(fā)明公開了下述有用的新穎的和非顯而易見的特征。本發(fā)明提供產(chǎn)生植物瘧疾抗原的方法,該方法包括通過將編碼并可操作以表達(dá)選自AMA-1、MSP-1或兩者的瘧疾抗原多肽的核酸序列插入其質(zhì)體基因組而轉(zhuǎn)化植物。本發(fā)明方法包括其中核酸序列進(jìn)一步包括編碼主要由霍亂毒素B亞基和瘧疾抗原多肽組成的實施方案。在本發(fā)明方法中,植物可以是食用植物,例如萵苣。然而,植物還可以是煙草屬,特別是多種普通煙草。本發(fā)明包括根據(jù)本發(fā)明方法穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物及其切割物、種子和后代。優(yōu)選的植物和方法包括其中可操作表達(dá)是組成型的。本發(fā)明進(jìn)一步包括治療瘧疾易感宿主的方法,該方法包括通過有效引發(fā)抗體反應(yīng)的途徑將根據(jù)權(quán)利要求1產(chǎn)生的瘧疾抗原多肽施用至宿主。該方法中,穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物優(yōu)選是食用的,施用途徑是通過攝入植物或其部分。公開的本發(fā)明還包括有效穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物質(zhì)體基因組以表達(dá)一種或多種瘧疾抗原多肽的表達(dá)盒,所述盒包括核酸序列,包括兩個與質(zhì)體基因組部分同源并有效用于插入質(zhì)體基因組的未翻譯側(cè)翼區(qū),以及在所述側(cè)翼區(qū)之間的編碼選自AMA-1、MSP-I及其組合的瘧疾抗原多肽的區(qū)、編碼賦予對選擇劑抗性的標(biāo)志物的區(qū)和有效用于組成型表達(dá)至少瘧疾抗原多肽和抗性標(biāo)志物的啟動子區(qū)。表達(dá)盒優(yōu)選在側(cè)翼區(qū)之間包括編碼霍亂毒素B亞基的區(qū),以便表達(dá)的瘧疾抗原多肽是與其融合的多肽。本發(fā)明范圍還包括由從轉(zhuǎn)化的植物純化形式的盒表達(dá)的融合多肽,以及含有用所述盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的質(zhì)體基因組的植物及其切割物、種子和后代。本發(fā)明發(fā)明的一部分是有效增加易感宿主中瘧疾抗體的口服疫苗,所述疫苗包括來自食用植物的葉材料,所述植物包含被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化以組成型表達(dá)主要由霍亂毒素B亞基和選自AMA-1、MSP-1或兩者的瘧疾抗原多肽組成的融合多肽的質(zhì)體。治療瘧疾易感宿主的方法包括口服施用上述疫苗。另外公開并要求保護(hù)制備瘧疾疫苗的方法,該方法包括通過將編碼并可操作以組成型表達(dá)選自AMA-1、MSP-I或兩者的瘧疾抗原多肽的核酸序列插入其質(zhì)體基因組而穩(wěn)定轉(zhuǎn)化食用植物;完整或部分收獲穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的食用植物;從收獲的植物純化表達(dá)的瘧疾抗原多肽;和在無菌條件下以預(yù)定劑量的量包裝純化的抗原多肽。而且在該方法中,植物優(yōu)選是煙草屬的種,最優(yōu)選是多種普通煙草種。而本發(fā)明的另一方面包括制備口服瘧疾疫苗的方法,該方法包括通過將編碼并可操作以組成型表達(dá)選自AMA-1、MSP-I或兩者的瘧疾抗原多肽的核酸序列插入其質(zhì)體基因組而穩(wěn)定轉(zhuǎn)化食用植物;收獲穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的食用植物或其部分;和包裝收獲物以口服食用。在該方法中,收獲物可以干燥的形式包裝。相應(yīng)地,在附圖和說明書中,已經(jīng)公開了本發(fā)明的典型優(yōu)選實施方案,盡管采用了特定術(shù)語,但這些術(shù)語以描述含義使用并不是限制目的。具體參考示例的實施方案,非常詳細(xì)地描述了本發(fā)明。然而,對于技術(shù)人員明顯的是,可以在本發(fā)明精神和范圍內(nèi)作出各種調(diào)整和變化,如在前述說明書中描述和在所附權(quán)利要求中定義的。權(quán)利要求一種在植物中產(chǎn)生瘧疾抗原的方法,該方法包括通過將編碼并可操作以組成型表達(dá)選自AMA1、MSP1或兩者的瘧疾抗原多肽的核酸序列插入植物質(zhì)體基因組而穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物。2.權(quán)利要求1所述的方法,其中所述核酸序列還包括編碼主要由霍亂毒素B和瘧疾抗原多肽組成的融合蛋白。3.權(quán)利要求1所述的方法,其中所述植物是食用植物。4.權(quán)利要求1所述的方法,其中所述植物是煙草屬的種。5.權(quán)利要求1所述的方法,其中所述植物是多種普通煙草。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物及其切割物、種子和后代。7.權(quán)利要求1所述的方法,其中可操作的表達(dá)是組成型的。8.一種治療易感瘧疾的宿主的方法,該方法包括通過有效引發(fā)抗體反應(yīng)的途徑向宿主施用根據(jù)權(quán)利要求1產(chǎn)生的瘧疾抗原多肽。9.權(quán)利要求8所述的方法,其中穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物是可食用的,并且施用途徑是攝入植物或其部分。10.一種有效用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物質(zhì)體基因組以表達(dá)一種或多種瘧疾抗原多肽的表達(dá)盒,所述表達(dá)盒包括核酸序列,該核酸序列包括兩個與質(zhì)體基因組部分同源并有效用于插入質(zhì)體基因組的未翻譯側(cè)翼區(qū)、以及在所述側(cè)翼區(qū)之間的編碼選自AMA-1、MSP-I及其組合的瘧疾抗原多肽的區(qū)、編碼賦予選擇劑抗性的標(biāo)志物的區(qū)和有效用于組成型表達(dá)至少瘧疾抗原多肽和抗性標(biāo)志物的啟動子區(qū)。11.權(quán)利要求10所述表達(dá)盒,其進(jìn)一步包括在所述側(cè)翼區(qū)之間的編碼霍亂毒素B亞基的區(qū),以使表達(dá)的瘧疾抗原多肽是與其融合的多肽。12.由權(quán)利要求11所述的盒表達(dá)的融合多肽,其為從轉(zhuǎn)化的植物純化的形式。13.含有用權(quán)利要求10所述的盒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的質(zhì)體基因組的植物及其切割物、種子和后代。14.一種有效增加易感宿主中瘧疾抗體的口服疫苗,所述疫苗包括含有穩(wěn)定轉(zhuǎn)化以組成型表達(dá)主要由霍亂毒素B亞基和選自AMA-1、MSP-1或兩者的瘧疾抗原多肽組成的融合蛋白的質(zhì)體的食用植物的葉材料。15.一種治療易感瘧疾宿主的方法,該方法包括口服施用權(quán)利要求14所述的疫苗。16.一種制備瘧疾疫苗的方法,該方法包括通過將編碼并可操作以組成型表達(dá)選自AMA-1、MSP-I或兩者的瘧疾抗原多肽的核酸序列插入植物質(zhì)體基因組而穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物;全部或部分收獲穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物;從收獲的植物中純化表達(dá)的瘧疾抗原多肽;和在無菌條件下以預(yù)定劑量的量包裝純化的抗原多肽。17.權(quán)利要求16所述的方法,其中所述植物是煙草屬的種。18.權(quán)利要求16所述的方法,其中所述植物是多種普通煙草。19.一種制備口服瘧疾疫苗的方法,所述方法包括通過將編碼并可操作以組成型表達(dá)選自AMA-1、MSP-I或兩者的瘧疾抗原多肽的核酸序列插入植物質(zhì)體基因組而穩(wěn)定轉(zhuǎn)化食用植物;收獲穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的食用植物或其部分;和包裝收獲物以口服食用。20.權(quán)利要求19所述的方法,其中所述收獲物以干的形式包裝。全文摘要本發(fā)明公開了制備瘧疾疫苗的方法,該方法包括通過將編碼并可操作以組成型表達(dá)選自AMA-1、MSP-1或兩者的瘧疾抗原多肽的核酸序列插入其質(zhì)體基因組而穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物;收獲全部或部分穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物;從收獲的植物純化表達(dá)的瘧疾抗原多肽;并在無菌條件下以預(yù)定劑量的量包裝純化的抗原多肽。還公開了有效增加易感宿主中瘧疾抗體的口服疫苗,所述疫苗包含可食用植物的葉材料,所述可食用植物含有被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化而組成型表達(dá)主要由霍亂毒素B亞基和選自AMA-1、MSP-1或兩者的瘧疾抗原多肽組成的融合多肽的質(zhì)體。文檔編號A61K39/15GK101951951SQ200880123585公開日2011年1月19日申請日期2008年10月31日優(yōu)先權(quán)日2007年10月31日發(fā)明者D·亨利,D·查克拉巴蒂申請人:中佛羅里達(dá)大學(xué)研究基金有限公司
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