專利名稱：一種檢測(cè)烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)，具體地說(shuō)，涉及一種檢測(cè)烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的方法。
背景技術(shù)：
隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，外貌特征在雞的育種和保種中占據(jù)重要地位，分子標(biāo)記也在育種和保種中起到了重要作用。但是對(duì)于控制外貌特征的分子標(biāo)記的研究仍然較少，僅有少量的外貌特征能夠通過(guò)分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇育種。烏骨雞作為中國(guó)特有雞種，具有烏皮、烏骨、烏肉等“十全”特征。其中烏骨雞的黑色特征主要受到纖維黑色素基因(Fm+/fm_)的影響。烏骨雞的結(jié)締組織呈黑色(Kuklenski， 1915)，雞冠、肉髯呈深紫色，耳朵、腳脛及喙呈藍(lán)色。攜帶Fm基因的雞種中，黑色素出現(xiàn)的部位包括肌膜、神經(jīng)、肌腱、血管、性腺、腸系膜、骨膜與皮膚真皮層等。出于對(duì)烏骨雞“烏色”的重視，中國(guó)利用烏骨雞的骨頭與肌肉作為傳統(tǒng)中藥的引藥，一些攜帶Fm基因的改良雞種，飼養(yǎng)至12-14周齡作為傳統(tǒng)料理的食材。Fm基因控制的黑色表型相對(duì)于fm基因控制的非黑色表型是一種單位點(diǎn)控制的顯性性狀，因而在保種和育種的過(guò)程中，根據(jù)表型無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分顯性純合子和雜合子個(gè)體，造成選育效率低下。隨著分子數(shù)量遺傳理論的發(fā)展，需找到影響真皮層黑色性狀的分子標(biāo)記， 通過(guò)標(biāo)記輔助選擇，可以迅速準(zhǔn)確地鑒定候選個(gè)體的基因型，從根本上解決這一保種和育種問(wèn)題。DNA分子標(biāo)記是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)中的核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是 DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映。在雞基因組中分布有大量的分子標(biāo)記，攜帶巨大的遺傳信息量，目前已經(jīng)有多個(gè)重要性狀得到了定位，可以利用相關(guān)的分子標(biāo)記進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇育種，對(duì)育種起到了巨大的促進(jìn)作用。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，是一種十分理想、有效的分子標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種檢測(cè)烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的方法，其是對(duì)烏骨雞第20號(hào)染色體位于10739109bp位點(diǎn)(基于雞基因組序列信息版本號(hào) WUGSC 2. l/gaK}a13，2006年5月)的核苷酸進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判定烏骨雞的纖維黑色素基因?yàn)榧兒匣螂s合。單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)優(yōu)選采用的方法為焦磷酸測(cè)序。本發(fā)明還檢測(cè)烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的引物，包括F 5' -GCCCCTTCCTGAAGCAATA-3‘和 R:5' -CATGCAGGATCTCTATGAAGAAAA-3‘。本發(fā)明還提供檢測(cè)烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的探針，其核苷酸序列為CN 102534006 A5' -GTATTCTAGAAGCCATTCC-3‘。本發(fā)明還提供含有上述引物及探針的檢測(cè)烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的試齊U盒。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種檢測(cè)烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的方法，其是以烏骨雞的基因組DNA為模板，采用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用上述探針對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判定烏骨雞的纖維黑色素基因?yàn)榧兒匣螂s合；其中，單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)是針對(duì)第20號(hào)染色體位于10739109bp位點(diǎn)的核苷酸。PCR反應(yīng)體系為基因組DNA 30ng，Ix擴(kuò)增緩沖液，Mg2+50mM，dNTPs 5mM，引物F 10 μ M，引物R 10 μ Μ, Taq DNA聚合酶1U，加水補(bǔ)至25 μ 1。PCR 反應(yīng)條件為95°C 變性 5min ；95°C 變性 15sec，57°C 退火 30sec，72°C 延伸 30sec，共 45 循環(huán)；72°C延伸 7min ；20°C保存。檢測(cè)待測(cè)雞第20號(hào)染色體位于10739109bp位點(diǎn)的基因型是AG還是GG (A為腺嘌呤核苷酸，G為鳥嘧啶核苷酸)；當(dāng)基因型是AG時(shí)，A G= 1 1，則表示該位點(diǎn)在兩條染色體上都存在CNV (基因拷貝數(shù)變異)，每條染色體上都有一個(gè)拷貝的基因型是AA，一個(gè)拷貝的基因型是GG，待測(cè)雞為Fm黑色顯性純合；A G= 1 2時(shí)，則表示該位點(diǎn)只在一條染色體上存在CNV，一個(gè)拷貝的基因型是AA，一個(gè)拷貝的基因型是GG，另一條染色體上不存在 CNV,只有一個(gè)拷貝，基因型是GG，待測(cè)雞為Fm黑色顯性雜合；如果待測(cè)雞的基因型為GG，則表示該位點(diǎn)在兩條染色體上都不存在CNV，每條染色體上都只有一個(gè)拷貝，基因型是GG，待測(cè)雞為fm非黑色隱性純合。其中，單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)采用的檢測(cè)方法為PyroMark ID定量遺傳分析系統(tǒng) (Biotage公司)的Pyrosequencing焦磷酸測(cè)序技術(shù)。上述方法、引物對(duì)和探針、試劑盒可應(yīng)用于雞的育種。本發(fā)明所提供的方法和產(chǎn)品(引物、探針、試劑盒)，對(duì)烏骨雞的Fm黑色性狀純合 /雜合進(jìn)行選擇，可以直接將Fm黑色性狀純合子個(gè)體保留下來(lái)，從而大大地提高育種和保種效率。本發(fā)明為雞育種的分子標(biāo)記輔助選擇提供了一個(gè)高效準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便快速的分子遺傳標(biāo)記，為雞的Fm黑色性狀的選種和保種提供了一種有效的分子標(biāo)記育種手段。用該遺傳標(biāo)記對(duì)雞的Fm黑色性狀進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，可有效地緩解實(shí)際育種和保種中的無(wú)法區(qū)分Fm 黑色純合子和雜合子的問(wèn)題，提供選種保種效率，并為利用該性狀進(jìn)行分子聚合育種奠定基礎(chǔ)，將加快育種進(jìn)程。本發(fā)明的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用低廉，準(zhǔn)確度高，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明的方法開發(fā)出相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒，可用于選擇攜帶有利基因型(AG，A G =1 1)的個(gè)體，為雞的育種保種工作提供便利。


圖1為本發(fā)明Pyrosequencing焦磷酸測(cè)序方法檢測(cè)純合子個(gè)體的烏骨雞第20號(hào)染色體位于10739109bp位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性(基因型AG，A G = 1 1)。圖2為本發(fā)明Pyrosequencing焦磷酸測(cè)序方法檢測(cè)雜合子個(gè)體的烏骨雞第20號(hào)染色體位于10739109bp位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性(基因型AG，A G = 1 2)。圖3為本發(fā)明Pyrosequencing焦磷酸測(cè)序方法檢測(cè)非黑色性狀雞第20號(hào)染色體位于10739109bp位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性(基因型GG)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用試驗(yàn)材料及試劑均為市售商品。實(shí)施例中涉及的“ ％ ”，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。實(shí)施例1 Pyrosequencing焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法的建立及多態(tài)位點(diǎn)的確定1基因型分析1. 1家系構(gòu)建構(gòu)建專門用于研究定位影響雞結(jié)締組織黑色素沉積的纖維黑色素基因(Fm)的實(shí)驗(yàn)群體，構(gòu)建方法為F0代親本為絲羽烏骨雞公雞1只和尤溪麻雞母雞3只， 采用人工受精的方法，待收集到30枚蛋后同時(shí)入孵；Fl代出雛后，所有雛雞在同一飼養(yǎng)條件下按常規(guī)方法飼養(yǎng)，待性成熟后，從中挑選3只皮膚黑色程度深，且黑度相近的公雞，每只公雞與10只尤溪麻雞母雞組成家系，共組成3個(gè)家系，采用人工受精的方法，每收集到 120枚蛋后入孵，共入孵兩批；F2代出雛后，所有雛雞在同一飼養(yǎng)條件下按常規(guī)方法飼養(yǎng)至 12周齡。1. 2實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)選取了 Fm家系的3個(gè)家系的F0、F1和F2代個(gè)體，共計(jì)M5 個(gè)。在Fm家系中記錄了 F0、Fl和F2代個(gè)體的雞冠、腳脛、各種結(jié)締組織及真皮層皮膚顏色。1. 3基因組DNA的提取雞12周齡時(shí)翅靜脈采血，抗凝處理后裂解，經(jīng)蛋白酶K消化后，用酚仿抽提，TE溶解-20°C保存。1.4 PCR 擴(kuò)增以提取的基因組DNA為模板，用引物對(duì)跨第20號(hào)染色體10739109bp位點(diǎn)(基于雞基因組序列信息版本號(hào)WUGSC 2. l/g￡dGal3，2006年5月)的片段(Seq ID No. 4)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。 F 5' -GCCCCTTCCTGAAGCAATA-3‘R 5' -biotin-CATGCAGGATCTCTATGAAGAAAA-3‘PCR反應(yīng)體系05 μ 1)終濃度為基因組DNA 30ng，Ix擴(kuò)增緩沖液，Mg2+50mM, dNTPs 5mM, F 10 μ Μ, R 10 μ Μ，Taq Gold DNA 聚合酶 1U，加滅菌水補(bǔ)至 25 μ 1。PCR 反應(yīng)條件95°C變性 5min ；95°C變性 I5Sec, 57O退火 30sec, 72°C延伸 3Osec, 共45循環(huán)；72°C延伸7min ；20°C保存。1.5 PCR產(chǎn)物檢測(cè)取5 μ 1 PCR產(chǎn)物進(jìn)行2 %瓊脂糖凝膠檢測(cè)。1. 6焦磷酸測(cè)序應(yīng)用PyroMark ID定量遺傳分析系統(tǒng)，以PCR產(chǎn)物為模板，用引物對(duì)10739109bp 位點(diǎn)進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。使用的探針為S 5' -GTATTCTAGAAGCCATTCC-3‘1. 6. 1試樣預(yù)處理，單鏈分離純化操作1)在使用前，保證所有溶液都達(dá)到室溫；2)在PSQ 96板中預(yù)先加入45 μ 1含有0.3 μ M測(cè)序引物的退火引物，一般情況下加入IOpM引物2μ 1 ；3)使用 Vertex 混勻 Sepharose beads ；4)將需要使用的s印haroe beads總量(每樣本3 μ 1)轉(zhuǎn)移到一個(gè)Eppendorf管中；5)在s印harose beads中加入結(jié)合緩沖液，使得平均每個(gè)樣品約有50 μ 1的體積， 將混合物混勻；6)將以上混合物加入PCR產(chǎn)物(50 μ 1反應(yīng)體積)中，每樣本50 μ 1 ；7)將PCR產(chǎn)物在常溫下混勻10分鐘，使得beads與生物素結(jié)合，對(duì)于較長(zhǎng)片段，可適當(dāng)延長(zhǎng)混勻時(shí)間；8)在Vacuum prep workstation中，四個(gè)樣品板中依次加入180ml高純水、70%乙醇、洗滌緩沖液和120ml變性緩沖液；9)打開 vacuum prep workstation 的泵，將 vacuum prep tool 在高純水中清洗 30 秒；然后將 vacuum prep tool 移至Ij PCR 板中，抓取 s印harose beads (請(qǐng)?jiān)?beads 與 PCR 產(chǎn)物結(jié)合后三分鐘內(nèi)完成此操作，不要讓Beads又沉到管底)；拿起PCR板，檢查是否大部 ,Jf beads 者vacuum prep tool _t ；10)將 vacuum prep tool 放入 70% 乙醇中 5 秒；11)然后移到變性緩沖液中5秒；12)再移到洗滌緩沖液中清洗5-10秒；13)把吸頭放在相應(yīng)含有測(cè)序引物的板孔的上方，不要接觸液面，關(guān)掉泵；14)將vacuum prep tool放入含有測(cè)序引物的板中，搖動(dòng)，釋放s印harose beads (測(cè)序引物也可最后加入)15)使用高純水清洗 vacuum prep tool ；16)將放有樣品的PSQ 96板放在ThermoPlate上加熱到80°C 2分鐘，再冷卻到室溫，艮阿進(jìn)行Pyrosequencing反應(yīng)。1.6.2試樣上機(jī)1)打開 PyroMark ID 主機(jī)；2)打開電腦和相應(yīng)操控軟件；3)選擇 SNP，SNP Runs 和 New SNP Run (或選擇 SQA)；4)填入 Run name,選擇 Instrument parameters ；5)選擇需要使用的樣品孔，并點(diǎn)擊Activate ；6)在 Entry 中填入 SNP entry (或 SQA)；7)準(zhǔn)備好樣品，并加入樣品板中；8)準(zhǔn)備酶和底物，并將所有試劑在使用前在室溫下放置10分鐘；9)將酶、底物和dNIPs加入試劑艙中；10)將放有試樣的經(jīng)過(guò)試樣預(yù)處理的PSQ 96 Plate Low放置在儀器上；11)核實(shí)儀器參數(shù)選擇；12)點(diǎn)擊Run按鈕，運(yùn)行；13)分析結(jié)果產(chǎn)生三種基因型
第一種基因型AG，A G = 1 1，待測(cè)雞為Rn黑色純合；第二種基因型AG，A G = 1 2，待測(cè)雞為Rn黑色雜合；第三種基因型GG，待測(cè)雞為fm非黑色純合。2相關(guān)性分析結(jié)果如表1所示，該結(jié)果表明，在所檢測(cè)的245個(gè)個(gè)體中，AG(A G = 1 1)基因型有2個(gè)，AG(A G=I 2)基因型有106個(gè)，GG基因型有137個(gè)，AG (A G=I 1) 基因型個(gè)體和AG(A G= 1 2)基因型個(gè)體均為Fm黑色性狀表型，GG基因型個(gè)體均為 fm非黑色性狀表型。其中AG(A G= 1 1)基因型個(gè)體均為顯性純合子，AG(A G = 1 2)基因型個(gè)體均為顯性雜合子，而GG基因型個(gè)體均為隱性純合子。表1第20號(hào)染色體10739109bp位點(diǎn)不同基因型與Fm黑色性狀的相關(guān)性分析統(tǒng)計(jì)
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的方法，其特征在于，對(duì)烏骨雞第20號(hào)染色體位于10739109bp位點(diǎn)的核苷酸進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判定烏骨雞的纖維黑色素基因?yàn)榧兒匣螂s合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)所采用的方法為焦磷酸測(cè)序。
3.檢測(cè)烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的引物，包括F 5' -GCCCCTTCCTGAAGCAATA-3‘；和R 5' -CATGCAGGATCTCTATGAAGAAAA-3‘。
4.檢測(cè)烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的探針，其核苷酸序列為 5' -GTATTCTAGAAGCCATTCC-3‘。
5.檢測(cè)烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的試劑盒，其含有權(quán)利要求3所述的引物及權(quán)利要求4所述的探針。
6.一種檢測(cè)烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的方法，其特征在于，以烏骨雞的基因組DNA為模板，采用權(quán)利要求3所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用權(quán)利要求4所述的探針對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判定烏骨雞的纖維黑色素基因?yàn)榧兒匣螂s合；其中，單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)是針對(duì)第20號(hào)染色體位于10739109bp位點(diǎn)的核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)所采用的方法為焦磷酸測(cè)序。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系為基因組DNA30ng, Ix擴(kuò)增緩沖液，Mg2+50mM，dNTPs 5mM，引物F 10 μ M，引物R 10 μ Μ, Taq DNA聚合酶1U，加水補(bǔ)至25μ 1。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)條件為95°C變性5min;95°C 變性 15sec，57°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，共 45 循環(huán)；72°C延伸 7min ；20°C保存。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)烏骨雞纖維黑色素基因純合/雜合的方法，其是對(duì)烏骨雞第20號(hào)染色體位于10739109bp位點(diǎn)(基于雞基因組序列信息版本號(hào)WUGSC 2.1/galGal3，2006年5月)的核苷酸進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判定烏骨雞的纖維黑色素基因?yàn)榧兒匣螂s合。通過(guò)對(duì)烏骨雞的Fm黑色性狀純合/雜合進(jìn)行選擇，可以直接將Fm黑色性狀純合子個(gè)體保留下來(lái)，從而大大地提高育種和保種效率。本發(fā)明的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用低廉，準(zhǔn)確度高，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102534006SQ201210011338
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月13日
發(fā)明者李寧, 田明, 胡曉湘 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)