專利名稱：一種新型防御素pdBD及其基因、和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地，本發(fā)明涉及一種防御素PdBD及其基因和應用。
背景技術：
自然界中各類生物都具有其內在的防御系統(tǒng)，當機體受到外界微生物侵染時，該系統(tǒng)便會產生一類防御性的肽類活性物質，被稱為抗菌肽(antimicrobial peptides)。而防御素(defensin)屬于一類含有30_45個氨基酸殘基的抗菌肽,主要分布于皮膚和黏 膜上皮，阻止病原微生物的定植并通過結合于病原微生物的胞膜上而將其殺滅(TaylorK, et al. Biopolymers 90:1-7,2008)。防御素是一種小的陽離子肽，是天然宿主識別微生物的基礎。截止目前研究發(fā)現防御素的種類有哺乳動物防御素、昆蟲防御素和植物防御素，而在哺乳動物體內又發(fā)現3種防御素亞家族，S卩α-防御素、防御素和Θ-防御素，而θ -防御素僅存在于靈長動物中(Guani-Guerra E, et al. Clinical Immunology135:1-11，2010)。防御素是一類分子量為3_4KDa的非糖基兩親(親水、親脂)低分子短肽，由30-45個氨基酸組成，一般富含精氨酸，帶正電荷。分子中有6個半胱氨酸殘基，形成3對二硫鍵，含有3個相應對稱的β折疊片結構，缺少α螺旋結構域(Schneider JJ, et al. Journalof Molecular Medicine 83:587-95，2005;Dhople V，et al. Biochimica et BiophysicaActa(BBA)-Biomembranes 1758:1499-512，2006)。借助于細胞這個媒介，無論在細胞內或細胞外，防御素都可以直接殺死細菌、真菌、病毒等病原微生物。在細胞內環(huán)境中，它們通過吞噬微生物而促成厭氧菌的死亡。當被釋放到細胞外環(huán)境中，它們通過攻擊微生物外膜發(fā)揮抗菌活性。除此之外，防御素還作為機體內外免疫系統(tǒng)的“仲裁者”進行免疫調節(jié)以及創(chuàng)傷和神經損傷的修復。防御素在宿主的嗜中性粒細胞、粘膜表面、皮膚和其他上皮細胞免疫中起重要作用，其定位和調控是通過抵抗病原的侵襲和內生細菌的生長兩種途徑來實現(De Yang, et al. Trends inImmunology 23:291-296, 2002;Zasloff. Nature415:389-395, 2002;Lai Y, et al. Trendsin Immunology 30:131-41,2009)。魚類防御素相對于哺乳動物防御素研究起步相對較晚，且都集中于海水魚類的研究，泥鰍作為一種鯉形目的淡水魚是一種新型且具有代表性的研究對象，為開發(fā)一種具有廣譜抗菌活性的防御素且投入于水產飼料、漁藥等行業(yè)的應用提供了一些理論基礎。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種防御素pdBD。本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述防御素的基因pdBD。本發(fā)明的再一目的是提供包含上述防御素基因的重組載體。本發(fā)明的再一目的是提供包含上述防御素基因的重組細胞系。
本發(fā)明的再一目的是提供一種制備防御素的方法。本發(fā)明首先所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種性質優(yōu)良的新防御素。本發(fā)明的發(fā)明人人從泥鰍(Paramisgurnus dabryanus)中得到一個新的具有抗革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌活性的防御素。適合于水產飼料、漁藥等行業(yè)中使用。從泥鰍中獲得了一種防御素pdBD，該蛋白含有67個氨基酸和一個終止密碼子，預測的信號肽序列為前端24個氨基酸殘基。理論分子量為7. 28kDa。其氨基酸序列如SEQ IDNO. I所示MKPQCILLLALVVILVLHSKVNEAVSFPWGCASISGVCRQGTCLPSELYFGPLGCGKGFQ60CCVSHFL67·本發(fā)明還提供了編碼上述防御素的基因組序列，全長627bp，包括三個外顯子及兩個內含子。其中l(wèi)-60bp為第一個外顯子，61_334bp為第一個內含子，335_454bp為第二個外顯子，455-603bp為第二個內含子，604-627bp為第三個外顯子。全基因組序列如SEQ IDNO. 2所示atgaaacctc aatgtatact tctactggct ctcgtggtca tcttggtatt gcacagtaag 60ttttatattc ttgcttttgg taaaagatta gtagctttgt gtaaacctga aattatgatt 120cttatcacat ttttaagcca aaaaacagca ataataaaac ttgctttatt gtgatgtatt 180ggaagtgaca ttactcatgg atggcaaagg acaaagcagc aaatgccagc tgtattcctc 240tagatcacat ttggctgatt ctgtatgtag attgttttca tctgtctgtg ttgatctgtg 300tggagccaaa acatttattt ttgtctaagg caaggtgaat gaggctgtgt cgtttccctg 360gggctgtgcg agcatcagtg gagtttgcag acaaggaacg tgtctacctt ctgaactcta 420ctttggaccg ttaggctgtg gcaagggatt ccagtaagtt ccaatattta tacattccag 480ataaacacac acacgcatat atcatatgca catataaatg acatattgtg tgatattctt 540tacacatcaa gtaaatgatt acaaatctat ttgtttttga tttcttcctt gtttttttcc 600agatgctgtg tatcacattt tctttga627本發(fā)明還提供了編碼上述防御素的基因。本發(fā)明通過PCR的方法分離克隆了這一防御素基因的cDNA序列如SEQ ID NO. 3所示atgaaacctc aatgtatact tctactggct ctcgtggtca tcttggtatt gcacagcaag 60gtgaatgagg ctgtgtcgtt tccctggggc tgtgcaagca tcagtggagt ttgcagacaa 120ggaacgtgtc taccttctga actctacttt ggaccgttag gctgtggcaa gggattccag 180tgctgtgtat cacattttct ttga204去除前端24個氨基酸后的pdBD序列如SEQ ID NO. 4所示VSFPffGCASISGVCRQGTCLPSELYFGPLGCGKGFQCCVSHFL43其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示gtgtcgtttc cctggggctg tgcaagcatc agtggagttt gcagacaagg aacgtgtcta 60ccttctgaac tctactttgg accgttaggc tgtggcaagg gattccagtg ctgtgtatca 120cattttcttt ga132通過將防御素基因pdBD的DNA序列及推導出的氨基酸序列在GenBank中進行BLAST比對，確定pdBD是一種新的防御素，為防御素基因pdBD的改造并在各種外源基因表達系統(tǒng)中高效表達提供優(yōu)良的基因材料。本發(fā)明還提供了包含上述防御素基因pdBD的重組載體，優(yōu)選為pcDNA3. I (+) -pdBD.將本發(fā)明的基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達調控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案，優(yōu)選為將防御素基因插入到質粒pcDNA3. I (+)上的EcoRI和BamHI限制性酶切位點之間，得到重組真核細胞表達質粒 pcDNA3. I (+) -pdB 和 pcDNA3. I (+) -pdBD-s。本發(fā)明還提供了包含上述防御素基因pdBD的表達細胞系，優(yōu)選為HEK293T細胞
系O本發(fā)明還提供了一種制備上述防御素pdBD的方法，包括以下步驟
I)用上述的重組載體轉化宿主細胞，得重組質粒；2)轉染質粒，通過HEK293T細胞表達得到防御素pdBD ；3)檢測所得防御素pdBD的抗菌活性。本發(fā)明的防御素對革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、嗜水氣單胞菌)及革蘭氏陽性菌(枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌)均具有抗菌活性。作為一種新型的防御素，在水產飼料添加劑和漁藥等行業(yè)都有應用價值。


圖I防御素基因pdBD在HEK293T細胞中表達的防御素的western blot分析，I細胞表達得到的PdBD ；2去除信號肽的成熟蛋白編碼基因pdBD-s在細胞中的表達；3對照空載體pcDNA3. I (+)在細胞中的表達。
具體實施例方式試驗材料和試劑I、載體及細胞載體pcDNA3. I (+)購自于Invitrogen公司，細胞系HEK293T購自于 ATCC。2、酶類及其它生化試劑內切酶、連接酶購自Takara公司，反轉錄試劑盒購自Τ0Υ0Β0公司，脂質體Lipofetmiane2_購自Invitrogen公司，細胞培養(yǎng)相關試劑購自Invitrogen和Nuck公司。其它都為國產試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。3、培養(yǎng)基大腸桿菌培養(yǎng)基LB (1%蛋白胨、O. 5%酵母提取物、l%NaCl，pH7. O)。說明以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J-薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行。實施例I泥鰍防御素編碼基因pdBD的克隆利用TRIZON法提取泥鰍鰓部組織RNA并反轉為第一鏈cDNA。根據發(fā)表的魚類防御素的序列比對結果找到兩個保守氨基酸序列ENEAASFP和GCGKGFLCC，并設計合成了簡并引物DP-BDl-F和DP-BD1-R(引物序列見表1)，以泥鰍的cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應參數為95°C 5min ；94°C 30sec, 55-50V 30sec (其中每個循環(huán)后復性溫度下降O. 5°C )，72°C 30s，10個循環(huán)，然后進入第二個循環(huán)程序94°C 30sec,50°C 30sec,72°C 30s, 28個循環(huán)后；72°C lOmin，瓊脂糖電泳檢測，得到約IOObp的片段，回收后pGEM_T Easy載體相連并轉化大腸桿菌JM109，經檢測為陽性后送測序。
根據測定序列結果，得到長125bp片段，在NCBI的GenBank中利用BLASTX(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)進行序列比對,初步判斷該基因片段是防御素片段。根據測序得到的核甘酸序列，上游和下游分別設計三條TAIL-PCR特異性引物和兩條RACE-PCR特異性引物并將它們分別命名為Dl，D2, D3 (上游特異性引物)和Ul，U2 (下游特異性引物)見表I。通過TAIL-PCR和RACE-PCR分別得到已知基因片段序列的5’端側翼序列和3’端UTR序列，擴增得到產物回收后測序。將簡并引物得到的核心片段與經TAIL-PCR得到的側翼序列和經RACE-PCR得到的3’端UTR序列進行拼接得到pdBD全長基因。結果表明，該基編碼區(qū)全長204bp (SEQ IDNO. 2)，編碼67個氨基酸(SEQ ID NO. I)和一個終止密碼子。信號肽序列為前端24個氨基酸殘基，無序列相同的基因，該編碼基因為一個新基因。表I.防御素pdBD特異性引物
親物名稱列(5' >3*)大小(bp>
DP-BDl-FGAGAACGAGGrTGCTWCNTTYCC23
DP-BDl-RACAGCACAAGAATCCYTTNCCRCANCC27
DIC Λ Γ ATG ATACi A AT (TiTTAGG AAICG (..TCiC29
D2TX,TXiCATATGCTATGTCTGTGTGTGTG27
D3ACACACTCCTTGTCTGCAAACTCCACTG28
UlTGGAGCTGTGCAAGTCTCAGT21
U2TCCTT AGGCTGCGGTAAGGGATTCTTGTGCTGT33
pcDNA-FTGGATCCACCATGAAACCTCAATGTATACTTCTAC35
TGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGAAGAAAATGTGAT pcDNA-R50
Λ( ( (ι('.Λ(aY=C/T, K=T/G，R=A/G，N=A/T/G/C;劃線部分為酶切位點。實施例3泥鰍防御素基因pdBD的表達防御素基因pdBD與pcDNA3. 1(+)連接并在HEK293T細胞中進行了表達。根據測序及序列分析的結果設計引物pcDNA-F和pcDNA-R (引物序列見表1)，以cDNA為模板進行PCR擴增。質粒pcDNA3. 1(+)和基因(包括帶信號肽編碼序列的基因和去除信號肽編碼成熟蛋白的基因)進行雙酶切(EcoRI和BamHI)后連接形成載體pcDNA3. I (+)-pdBD和pcDNA3. I (+) -pdBD-s ο制備TransI感受態(tài)細胞，將重組載體pcDNA3. I (+) -pdBD或pcDNA3. I (+)-pdBD-s熱擊轉化宿主菌。鑒定陽性重組子，提取重組質粒并轉染細胞。將重組質粒與空載體pcDNA3. I (+)同時轉染HEK293T細胞，采用Lipofetmiane2·脂質體轉染法，待細胞長到鋪板率約90%時，按照質量體積比為I比2的比例轉染質粒和脂質體，轉染6小時后，吸去脂質體和質粒，加入培養(yǎng)液再培養(yǎng)72小時。瞬時轉染72小時后，收集細胞，用于做RT-PCR以及western blot檢測其表達情況。提取細胞總RNA，反轉為第一鏈cDNA，以此為模版用特異性引物能擴增出目的條帶，而相同條件下對照組PcDNA空載體不能擴增出相應條帶。Western blot檢測是通過收集細胞后，用HANKS buffer重懸，超聲破碎后12000rpm離心5min,取上清進行Tricine-SDS-PAGE,隨后100V轉膜Ih,經過一抗二抗孵育后，顯色可看出重組蛋白pcDNA3. I (+) -pdBD在7KDa附近有一條明顯條帶，而對照組pcDNA空載體(圖I)。實施例4防御素抗菌活性檢測實施例3獲得的重組蛋白抗菌活性檢測抗菌活性檢測的目標菌種為革蘭氏陰
性菌的大腸桿菌、嗜水氣單胞菌及革蘭氏陽性菌的枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌。具體檢測方法為取兩種菌進行劃線37°C過夜培養(yǎng)，待長出約2mm的單克隆后，挑取到20ml的LB培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)至其對數期，OD值約為O. 6，再以1%接種量接于低鹽LB培養(yǎng)基中(NaCl濃度為O. 22mM),混勻后取50ul于96孔板中，同時加入等量的實施例3獲得的重組蛋白(pcDNA3. l(+)-pdBD、去除信號肽的基因片段。及對照pcDNA3. I (+))，蛋白的處理方法為收集細胞后，用不含NaCl的PB緩沖液重懸細胞，超聲破碎后離心取上清進行蛋白定量，確保重組蛋白與對照組空載體的蛋白總量一樣，隨后取上清進行活性檢測，待其同菌一起孵育約14h后檢測OD6tltl的讀數，對于革蘭氏陰性菌的大腸桿菌，緩沖溶液PB與其孵育后平均OD值為O. 762，空載體與其孵育后平均OD值為O. 735，pdBD與其孵育后的平均OD值為O. 351 ;對于嗜水氣單胞菌，緩沖溶液PB與其孵育后平均OD值為O. 495，空載體與其孵育后平均OD值為O. 463，pdBD與其孵育后的平均OD值為O. 140 ;同樣的對于枯草芽孢桿菌三個數值分別為O. 623,0. 595,0. 102，對于金黃色葡萄球菌三個數值分別為O. 670,0. 625、O. 319，數據經過spass軟件統(tǒng)計后，pdBD孵育后的細菌OD值顯著低于PB及空載體對照(P〈0. 01)，數據經過spass軟件統(tǒng)計后，可以看出實施例3獲得的重組蛋白相對于對照組pcDNA3. I (+)來說對革蘭氏陰性菌的大腸桿菌、嗜水氣單胞菌及革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌嗜水氣單胞菌有顯著抑制作用，對枯草芽孢桿菌有極顯著抑制作用。
權利要求
1.一種防御素pdBD，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I或SEQ ID NO. 4所示。
2.一種防御素基因pdBD，其特征在于，編碼權利要求I所述的防御素。
3.根據權利要求2所述防御素基因pdBD，其特征在于，其堿基序列如SEQID NO. 2、SEQID NO. 3 或 SEQ ID NO. 5 所示。
4.包含權利要求2或3所述防御素基因pdBD的重組載體。
5.根據權利要求4所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體為pcDNA3.I (+)-pdBD。
6.包含權利要求2或3所述防御素基因pdBD的重組質粒。
7.根據權利要求6所述的重組質粒，其特征在于，所述重組質粒的表達宿主為HEK293T細胞系。
8.一種制備防御素基因PdBD的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)用權利要求4的重組載體轉化宿主細胞，得重組質粒； 2)轉染質粒，通過HEK293T細胞表達得到防御素pdBD。
9.權利要求I所述防御素pdBD用于制備革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌抑制劑的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，革蘭氏陰性菌為大腸桿菌和/或嗜水氣單胞菌，所述革蘭氏陽性菌為枯草芽孢桿菌和/或金黃色葡萄球菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地，本發(fā)明涉及一種防御素pdBD及其基因和應用。根據本發(fā)明的防御素pdBD其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。本發(fā)明的防御素對革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、嗜水氣單胞菌)及革蘭氏陽性菌(枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌)均具有抗菌活性。作為一種新型的防御素,在水產飼料添加劑和漁藥等行業(yè)都有應用價值。
文檔編號A23K1/17GK102952185SQ20121041855
公開日2013年3月6日 申請日期2012年10月29日 優(yōu)先權日2012年10月29日
發(fā)明者郭慶文, 王興吉, 王忠連, 李芳芳, 劉文龍, 孫碩, 錢娟娟 申請人:山東隆科特酶制劑有限公司