專利名稱：棉花pmc單染色體分離及其特異分子標(biāo)記建立的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子標(biāo)記領(lǐng)域，具體地，涉及棉花PMC單染色體分離及其特異分子標(biāo)記建立的方法。
背景技術(shù)：
棉花分子標(biāo)記廣泛用于遺傳多樣性、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、比較基因組學(xué)、起源進化等研究，同時廣泛應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇、品種設(shè)計、轉(zhuǎn)基因育種等分子育種中， 經(jīng)過第一代RFLP、第二代SSR、第三代SNP為代表的發(fā)展歷程，而其中第二代SSR分子標(biāo)記由于共顯性、重復(fù)性好、多態(tài)性高、操作相對簡單等優(yōu)點被廣泛利用。SSR有g(shù)SSR(來自基因組序列)和eSSR(來自EST序列)兩種。目前棉花遺傳圖譜(海陸種間)雖然說已經(jīng)比較飽和(< 2cM)，但實際上遠遠不能滿足實際要求，IcM可能要棉花覆蓋基因組400-600Kb，所以有必要不斷加密圖譜。通過各種基因組文庫或EST測序序列開發(fā)SSR標(biāo)記是一個方法， 但這只能覆蓋整個基因組，無法達到定向、特異開發(fā)某條染色體分子標(biāo)記的目的(例如1號染色體在比較飽和的圖譜上也只有66個標(biāo)記，而比它小的好多染色體上標(biāo)記多于此，所以有必要對1號染色體進行定向加密)。中國專利申請CN20091008330 公開了一種棉花單染色體的分離方法，然而該方法僅能分離棉花體細胞的單染色體。體細胞和花粉母細胞的切割方法操作方法差異如下，故不能通用。
權(quán)利要求
1.棉花花粉母細胞單染色體分離方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(1)取材、鑒定A.制作減數(shù)分裂中期染色體膜載片，切割與膜片內(nèi)框大小相近的玻璃載片，將膜載片粘貼在完整的玻璃載片適當(dāng)位置，再將膜載片反扣在支架上，所述膜片的材料為PET膜載片；B.取材，所用材料為棉花單體材料，取少許花藥于玻璃載片，滴加卡寶品紅染色，搗碎， 除余渣，加蓋片壓片，壓片完成后，鏡檢，在顯微鏡下直接觀察，識別出有單個細胞且整體呈紅色，外周有半透明狀邊圈的花蕾選用；C.預(yù)處理采用改良卡諾II，其配方為乙醇冰乙酸氯仿=5 3 2作為固定劑，室溫下處理4h，其中固定液為樣品的5倍以上，固定后用70%乙醇4°C保存，(2)顯微切割目標(biāo)染色體水洗預(yù)處理后的花蕾、低滲、酶解，將花藥點在半片蓋玻片上，加卡寶溶液并用鑷子夾碎染色，將半片蓋玻片反扣在墊有支架的膜載片上，輕輕按壓，-20°C存放，取出有凝結(jié)水時快速揭片，去掉支架，干燥，進行顯微切割，并收集目標(biāo)染色體。
2.建立棉花單染色體特異分子標(biāo)記的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(1)取材、鑒定A.制作減數(shù)分裂中期染色體膜載片，切割與膜片內(nèi)框大小相近的玻璃載片，將膜載片粘貼在完整的玻璃載片適當(dāng)位置，再將膜載片反扣在支架上，所述膜片的材料為PET膜載片；B.取材，所用材料為棉花單體材料，取少許花藥于玻璃載片，滴加卡寶品紅染色，搗碎， 除余渣，加蓋片壓片，壓片完成后，鏡檢，在顯微鏡下直接觀察，識別出有單個細胞且整體呈紅色，外周有半透明狀邊圈的花蕾選用；C.預(yù)處理采用改良卡諾II，其配方為乙醇冰乙酸氯仿=5 3 2作為固定劑，室溫下處理4h，其中固定液為樣品的5倍以上，固定后用70%乙醇4°C保存，(2)顯微切割體系構(gòu)建水洗預(yù)處理后的花蕾、低滲、酶解，將花藥點在半片蓋玻片上，加卡寶溶液并用鑷子夾碎染色，將半片蓋玻片反扣在墊有支架的膜載片上，輕輕按壓，-20°C存放，取出有凝結(jié)水時快速揭片，去掉支架，干燥，進行顯微切割，并收集目標(biāo)染色體，(3)以步驟(2)分離的單染色體為材料，構(gòu)建DNA文庫、克隆隨機測序后，利用標(biāo)記軟件開發(fā)分子標(biāo)記，并將其定位在棉花特定染色體上。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子標(biāo)記領(lǐng)域，具體地，涉及棉花PMC單染色體分離及其特異分子標(biāo)記建立的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法包括取材、鑒定、顯微切割目標(biāo)染色體等步驟，并以分離的單染色體為材料，構(gòu)建DNA文庫、克隆隨機測序后，利用標(biāo)記軟件開發(fā)分子標(biāo)記，并將其定位在棉花特定染色體上。本發(fā)明的PMC切割方法只要有對應(yīng)的單體材料即可，目前棉花26條染色體大部分都有；PMC切割更精確，假陽性低，但同時技術(shù)難度大，中期細胞少，目標(biāo)染色體數(shù)量少，一個細胞只有一條。
文檔編號C12N15/11GK102533733SQ20121002104
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月31日
發(fā)明者劉方, 張香娣, 彭仁海, 王為, 王坤波, 王春英, 王玉紅, 袁有祿, 黎紹惠 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所