專利名稱：：作為組蛋白脫乙?；敢种苿┑倪拎ず袜奏ぱ苌锏闹谱鞣椒ㄗ鳛榻M蛋白脫乙?；敢种苿┑倪拎ず袜奏ぱ苌锉景l(fā)明涉及具有組蛋白脫乙?；?HDAC)抑制酶活性的化合物。還涉及它們的制備、含有它們的組合物以及它們在體外和體內(nèi)抑制HDAC的用途和作為藥物的用途，例如用作抑制例如癌癥和牛皮痺的增殖病癥的藥物。已知細(xì)胞核組蛋白是負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和其它DNA模制過程(例如復(fù)制、修復(fù)、重組和染色體分離)的組織的整合和動力成分。其用于轉(zhuǎn)譯后的修飾，包括乙?；?、磷酸化、曱基化、遍在蛋白化和ADP-核糖基化。組蛋白脫乙?；冈诖朔Q為"HDAC",是催化除去蛋白質(zhì)賴氨酸殘基上的乙?；揎椀拿福ê诵暮诵◇w組蛋白H2A、H2B、H3和H4。HDAC與在此稱為"HAT"的組蛋白轉(zhuǎn)乙酰酶一起調(diào)節(jié)組蛋白乙?；乃健：诵◇w組蛋白乙?；钠胶庠谠S多基因的轉(zhuǎn)錄中起重要作用。組蛋白的低乙酰化與凝聚染色質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān)，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄的抑制，而乙?；慕M蛋白與更多開放的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄的活化有關(guān)。已知十一種結(jié)構(gòu)上相關(guān)的HDAC,并將其分為兩類。I類HDAC由HADC1、2、3、8和11組成，而II類HADC由HDAC4、5、6、7、9和10組成。第三類HDAC在結(jié)構(gòu)上與I類和II類HDAC不相關(guān)。I/II類HDAC按照鋅-依賴的機理起作用，而III類HDAC是NAD-依賴的。除組蛋白之外，其它的蛋白質(zhì)也是乙酰化的底物，特別是轉(zhuǎn)錄因子，例如p53、GATA-1和E2F;核受體，例如糖皮質(zhì)激素受體、甲狀腺受體、雌激素受體；和細(xì)胞-周期調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，例如pRb。乙酰化的蛋白質(zhì)已經(jīng)與蛋白質(zhì)穩(wěn)定相聯(lián)，如p53穩(wěn)定、輔因子的補充和增強的DNA結(jié)合。p53是腫瘤抑制基因，可根據(jù)許多應(yīng)力信號(例如DNA損傷)誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯或細(xì)胞程序死亡。對于p53誘導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯，主要的靶標(biāo)似乎是p21基因。除了被p53活化，已經(jīng)通過p21與細(xì)胞周期蛋白/依賴細(xì)胞周期蛋白的激酶配合物的結(jié)合證明其導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G1和G2相，在衰老期間向上調(diào)節(jié)，以及與增殖細(xì)胞核抗原相互作用。HDAC抑制劑的研究指出其在細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞分化、細(xì)胞程序死亡和轉(zhuǎn)化的顯型的反轉(zhuǎn)中起重要作用。例如，抑制劑TrichostatinA(TSA)導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在Gl和G2相、恢復(fù)不同細(xì)l包系的轉(zhuǎn)化的顯型和誘導(dǎo)Friend白血病細(xì)胞的分4b等。已經(jīng)報道了TSA(和辛二酰基苯胺異羥肟酸SAHA)抑制細(xì)胞生長、誘導(dǎo)終末分化和阻止小鼠體內(nèi)腫瘤的形成(Finninetal.,Nature,401:188-193，1999)。還報道了TrichostatinA用于纖維化的治療，例如肝臟纖維4^和肝硬:化(Geertsetal.,歐洲專利申請EP0827742,1998年3月11日7>開)。HDAC抑制劑的藥效基團(tuán)由與HDAC的含鋅活性位點相互作用的金屬結(jié)合區(qū)、連接區(qū)和與活性點邊緣上的殘基相互作用的表面識別區(qū)或封端區(qū)組成。還報道過HDAC的抑制劑誘導(dǎo)p21基因表達(dá)。通過染色質(zhì)重制，然后乙?；趐21啟動子區(qū)域中的組蛋白H3和H4，促進(jìn)了借助這些抑制劑的p21基因轉(zhuǎn)錄激活。這種p21的活化以不依賴p53的方式發(fā)生，因此HDAC抑制劑在具有突變的p53基因的細(xì)胞中起作用，突變的p53基因是許多腫瘤的^^險標(biāo)記。此外，HDAC抑制劑可以具有間接的活性，例如增加宿主的免疫應(yīng)答和抑制肺瘤的血管生成，因此可以抑制原發(fā)腫瘤的生長和阻礙轉(zhuǎn)移(Maietal.,MedicinalResearchReviews,25:261-309,2005)。鑒于如上所述，HDAC抑制劑在細(xì)胞增殖疾病或病癥(包4舌具有突變p53基因的腫瘤)的治療中可能具有巨大的潛能。2003年8月14日公開的專利申請EP1472216公開了作為組蛋白脫乙?；敢种苿┑碾p環(huán)異鞋月虧酸鹽(bicyclichydroxamate)。此外，在2003年9月18日公開的專利中請EP1485099、EP1485348、EP1485353、EP1485354、EP1485364、EP1485365、EP1485370、EP1485378中公開了作為組蛋白脫乙酰基酶抑制劑的取代的哌溱基嘧啶基異羥肟酸類，而EP1485365乂>開了R306465。在2003年10月9日公開的專利申請EP1492534公開了作為HDAC抑制劑的含有哌。秦連接基團(tuán)的氨基甲酸化合物。在2003年10月23日公開的專利申請EP1495002公開了作為組蛋白脫乙酰基酶抑制劑的取代的哌。秦基苯基苯曱酰胺化合物。2003年11月13日公開的專利申請EP1501508公開了作為組蛋白脫乙?；敢种苿┑谋锦０奉?。2004年1月29日公開的專利申請WO04/009536公開了作為組蛋白脫乙?；敢种苿┑难苌?，在芳基基團(tuán)和異羥肟酸之間含有烷基連接基。2004年2月12日公開的專利申請EP1525199公開了作為組蛋白脫乙?；敢种苿┑?雜)芳基烯基取代的雙環(huán)異羥肟酸類。2004年6月24日公開的專利申請EP1572626公開了作為藥理學(xué)試劑的亞芳基羧酸(2-氨基-苯基)-酰胺衍生物。2004年7月29日公開的專利申請EP1581484公開了具有抗炎和抗胂瘤活性的N-羥基-苯甲酰胺衍生物。2004年7月29日公開的專利申請EP1585735公開了作為組蛋白脫乙?；敢种苿┑娜〈蓟惲u肟酸鹽衍生物。2004年8月19日公開的專利申請EP1592667公開了作為藥理學(xué)試劑的單-酰化的O-苯乙胺衍生物。2004年8月19日公開的專利申請EP1590340公開了作為組蛋白脫乙?；敢种苿┑亩被伪交苌?。2004年8月26日公開的專利申請EP1592665公開了作為組蛋白脫乙?；敢种苿┑谋綍貂０费苌?。2004年8月26日公開的專利申請WO04/072047公開了作為組蛋白脫乙?；敢种苿┑倪艈B類、苯并咪唑類和萘并咪唑類。2004年9月30日公開的專利申請EP1608628公開了作為組蛋白脫乙?；敢种苿┑姆欠枷汶s環(huán)系統(tǒng)連接的異羥肟酸鹽。2004年10月14日/:開的專利申請EP1613622^A開了作為組蛋白脫乙酰基酶抑制劑的將衍生物。2004年10月28日/厶開的專利申請EP1611088^^開了作為組蛋白脫乙?；敢种苿┑漠愋瑢⑺猁}衍生物。脫乙?；敢种苿┑谋讲⑦溥蝾?。2005年4月7日公開的專利申請WO05/030704和W005/030705公開了作為組蛋白脫乙?；敢种苿┑谋郊柞０奉?。2005年5月6日公開了專利申請WO05/040101公開了作為組蛋白脫乙酰基酶抑制劑的?；暹B接的和磺酰脲連接的異羥將酸類。2005年5月6日公開的專利申請WO05/040161公開了作為組蛋白脫乙?；敢种苿┑穆?lián)芳基連接的異羥酸類。2005年8月18日公開的專利申請WO05/075469公開了作為組蛋白脫乙?；敢种苿┑膒塞唑基異羥肟酸類和噻二唑基異羥肟酸類。2005年9月22日公開的專利申請WO05/086898公開了作為組蛋白脫乙?；敢种苿┑碾s戊環(huán)異羥肟酸類。2005年10月6日公開的專利申請WO05/092899公開了作為組蛋白脫乙?；赶┗锦０奉?。本發(fā)明的化合物在結(jié)構(gòu)上、藥理學(xué)活性和/或藥理學(xué)效價方面與先有技術(shù)不同。要解決的問題是提供具有高酶催化活性和細(xì)胞活性的組蛋白脫乙?；敢种苿?，其具有提高的生物利用度和/或體內(nèi)效價。本發(fā)明的新化合物解決了上述問題。本發(fā)明的化合物顯示了優(yōu)良的抑制酶和細(xì)胞活性的組蛋白脫乙?；?。它們對活化p21基因具有很高的能力。它們具有所希望的藥物代謝動力學(xué)分布圖和對P450酶的低親合性，這降低了藥物-藥物相互作用的風(fēng)險，并具有較寬的安全界限。本發(fā)明化合物的有利性質(zhì)可以是代謝穩(wěn)定性、溶解性和/或p21誘導(dǎo)性能。本發(fā)明涉及式(I)化合物其N-氧化物形式、藥學(xué)可接受的加成鹽和立體化學(xué)異構(gòu)形式，其中n是O或l,并且當(dāng)n是0時，表示直接4建；p是O或l,條件是當(dāng)p是O時n是O,-(CH2)n-(NR3)p-是直接鍵并且Y是N;各X獨立地是N或CH;各Y獨立地是O、N、NH、CH或CH2，并且當(dāng)Y是N或CH時所述的取代基連接到所述環(huán)結(jié)構(gòu)的所述Y原子；R"是羥基或式(a-l)的基團(tuán)其中R"是羥基或-NH2;RS是氫、噻吩基、呋喃基或苯基，并且各噻吩基、呋喃基或苯基可任選被以下基團(tuán)取代卣代、氨基、硝基、氰基、羥基、苯基、Cw烷基、(二Cw烷基)氨基、Cw烷基氧基、苯基d-6烷基氧基、羥基Cw烷基、Cw烷基氧基羰基、羥基羰基、d-6烷基羰基、多卣代d-6烷基氧基、多鹵代Cw烷基、d-6烷基磺?；⒘u基羰基d-6烷基、Cw烷基羰基氨基、氨基磺?；?、氨基磺?；鵆w烷基、異"惡唑基、氨基羰基、苯基C2-6烯基、苯基C3-6炔基或吡啶基C3_6炔基；R6、R7和R8各自獨立地是氫、-NH2、硝基、呋喃基、卣代、d-6烷基、CL6烷基氧基、三氟曱基、噻吩基、苯基、d—6烷基羰基氨基、氨基羰基d-6烷基或-OC-CH2-R^其中W是氫、d—6烷基、羥基、氨基或d-6烷基氧基；R2是CH20H、CH2CH(OH)-CH20H、CH2OCH3或CH2OCH2CH3;W是氫、Cw烷基、Cw環(huán)烷基、Cw烷基羰基或CL6烷基磺?；?；和Z是下式的基團(tuán)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>(b-l)(b-2)(b-3)(b-4)(b-6)(b-7)其中R"是氬、d-6烷基、C3.7環(huán)烷基或苯基磺酰基；和R"是氫、羥基、氨基、鹵代、Cw烷基、多鹵代d-6烷基、Cw烷基羰基、羥基羰基、d-6烷基羰基氨基、氰基、d-6烷氧基或者單-或二(Ci-6烷基)氨基。從取代基畫到所述的二環(huán)環(huán)系統(tǒng)的線表示該鍵可以連接到該二環(huán)環(huán)系統(tǒng)的任何適宜的環(huán)原子。術(shù)語"組蛋白脫乙酰基酶抑制劑"或"組蛋白脫乙?；傅囊种苿?用來表示能夠與組蛋白脫乙?；赶嗷プ饔貌⒁种破浠钚?，更具體地講是抑制其酶活性的化合物。抑制組蛋白脫乙?；该富钚砸馕吨档徒M蛋白脫乙?；笍慕M蛋白除去乙?；哪芰?。優(yōu)選的，此抑制是特定的，即，所述組蛋白脫乙?；敢种苿┰谝欢舛认陆档徒M蛋白脫乙?；笍慕M蛋白除去乙酰基的能力，所述的濃度低于該抑制劑產(chǎn)生其它不相關(guān)生物步丈應(yīng)的濃度。在上述定義和在下文中所用的囟代是一般指氟代、氯代、溴代和碘代；CL6烷基是指直鏈或支鏈的飽和烴基團(tuán)，其具有1至6個碳原子，例如曱基、乙基、丙基、丁基、l-甲基乙基、2-甲基丙基、戊基、2-曱基-丁基、己基、2-曱基戊基等；(:2-6烯基表示含一個雙鍵的直鏈和支鏈的烴基團(tuán)并具有2到6個碳原子，例如例如乙烯基、2-丙烯基、3-丁烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、3-曱基-2-丁烯基等；C3-6炔基是指含一個三鍵的直鏈和支鏈烴基并具有3到6個碳原子，例如例如2-丙炔基、3-丁炔基、2-丁炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、3-己炔基等；多鹵代d-6烷基表示含有三個相同或不同卣代取代基，例如三氟甲基；以及(:3-7環(huán)烷基包括具有3到6個碳的環(huán)烴基，如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)戊烯基、環(huán)己基等。藥學(xué)可接受的加成鹽包括藥學(xué)可接受的酸加成鹽和藥學(xué)可4妻受的堿加成鹽。在上文提到的藥學(xué)可接受的酸加成鹽是指包括式(I)化合物能形成的治療活性的無毒的酸加成鹽形式。具有堿性的式(I)化合物可以通過將所述堿形式用合適的酸處理轉(zhuǎn)化為它們的藥學(xué)可接受的酸加成鹽。合適的酸包4舌例如無才幾酸，如氫卣酸，例如鹽酸或氫溴酸；；琉酸；硝酸；4,酸等酸；或有沖幾酸，例如乙酸、三氟醋酸、丙酸、羥乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸(即，丁二酸)、馬來酸、富馬酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、曱烷磺酸、乙烷磺酸、苯磺酸、對曱苯磺酸、環(huán)拉酸、水楊酸、對氨基水楊酸、樸酸等酸。具有酸性的式(I)化合物通過將所述酸形式用合適的有機或無機堿處理可轉(zhuǎn)化為它們藥學(xué)可接受的堿加成鹽。合適的堿鹽形式包括例如銨鹽、堿金屬鹽和堿土堿金屬鹽(例如鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽等)、與有機堿形成的鹽(例如千星青霉素鹽、N-曱基-D-葡萄糖胺鹽、海巴胺鹽(hydrabaminesalts))以及與例如精氨酸、賴氨酸等氨基酸形成的鹽。術(shù)語"酸或堿加成鹽"還包括式(I)化合物能形成的水合物和溶劑加成形式。這類形式的實例例如是水合物、醇化物等。這里使用的術(shù)語"式(I)化合物的立體化學(xué)異構(gòu)形式"定義為所有式(I)化合物可能具有的、由相同原子以相同鍵序組成但是具有不同的不可互換的三維結(jié)構(gòu)的可能的化合物。除非另作說明或指示，化合物的化學(xué)命名包括所述化合物可能具有的所有可能的立體化學(xué)異構(gòu)形式的混合物。所述混合物可能含所述化合物基本分子結(jié)構(gòu)的所有非對應(yīng)異構(gòu)體和/或?qū)τ钞悩?gòu)體。式(I)化合物的所有立體化學(xué)異構(gòu)形式的純凈形式或彼此混合形式均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。式(I)化合物的N-氧化物形式包括那些式(I)化合物，其中一個或多個氮原子被氧化成所謂的N-氧化物，特別是其中哌啶基、哌嗪基或噠。秦基的一個或多個氮被氧化的那些N-氧化物。一些式(I)化合物可能還以其互變異構(gòu)形式存在。盡管這類形式未在上式中明確指出，但是也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。在下文中無論何時使用，術(shù)語"式(I)化合物"還包括藥學(xué)可接受的加成鹽和所有的立體異構(gòu)形成。這里使用的術(shù)語"組蛋白脫乙?；?，，和"HDAC，，用于表示從在組蛋白N-末端的賴氨酸殘基的s-氨基除去乙?；囊幌盗忻傅娜魏我环N。除非上下文另有說明，術(shù)語"組蛋白"用于表示來自任何物種的任4可組蛋白蛋白質(zhì)，包4舌H1、H2A、H2B、H3、H4和H5。人HDAC蛋白質(zhì)或基因產(chǎn)品非限制性地包括HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、HDAC-5、HDAC畫6、HDAC-7、HDAC-8、HDAC-9、HDAC國10和HDAC國11。所述組蛋白脫乙?；高€可來自原生動物或真菌來源。第一組感興趣的化合物包括被下列一個或多個條件限定的那些式(I)化合物a)各X是N;b)各Y是N或CH;c)W是羥基;d)R2是CH2OH或CH2CH(OH)-CH2OH，e)113是氫或C^烷基；f)R"是氳或苯基磺酰基；和g)Rn是氫。第二組感興趣的化合物包括被下列條件限定的那些第一組化合物a)R^是苯基磺?；坏谌M感興趣的化合物包括被下列一個或多個條件限定的那些式(I)化合物或者上述組的那些化合物a)p是l;b)各Y獨立地是O、CH或CH2;b)W是羥基；和c)R3是d—6烷基羰基或d.6烷基磺酰基。第四組感興趣的化合物包括被下列一個或多個條件限定的那些式(I)化合物a)各X是N;b)各Y是N;c)R/是羥基;d)R2ACH2OH;e)R3是氳;f)A是式(b-3)或(b-6)的基團(tuán)；和g)R"是氫。優(yōu)選化合物的組包括那些式(I)化合物，其中，各X是N;各Y是N或CH;W是羥基；112是CH2OH、CH2CH(OH)-CH2OH;113是氬或Cw烷基；R"是氬或苯基磺?；缓蚏"是氳。更優(yōu)選化合物的組包括那些式(I)化合物，其中，各X是N;各Y是N;W是羥基；R2是CH20H;R3是氫；A式(b-3)或(b-6)的基團(tuán)；和RU是氫。更優(yōu)選化合物是化合物No.l和化合物No.2。0HO、人^&HU丄、人o丫、OH0HO、1^3^、OH,0,9C2HF30^1,14H20;化合物No,l0,86C2HF3O20.74H20;化合物No.2式(I)化合物、其藥學(xué)可接受的鹽以及其N-氧化物和立體化學(xué)異構(gòu)形式可以以常規(guī)方式制備。起始物質(zhì)和一些中間體是已知的化合物，并且是商業(yè)可得的，或者可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的常規(guī)反應(yīng)操作或發(fā)專利中請EP1485099、EP1485348、EP1485353、EP1485354、EP1485364、EP1485365、EP1485370和EP1485378中所述制備。一些制備方法將在下文更詳細(xì)描述。獲得最終式(I)化合物的其它方法描述于實施例。式(I)異羥肟酸(其中W是羥基，在此稱為式(I-a)化合物)可以通過將式(II)中間體與適宜的酸例如三氟乙酸反應(yīng)來制備。所述反應(yīng)是在適宜的溶劑例如曱醇或二氯甲烷中進(jìn)行的。(NR3)p(CMZ(n)CF3COOHHO、(I-a)式(I)化合物(其中W是式(a-1)的基團(tuán)并且R^是-NH2，在此稱為式(I-b)化合物)可以通過將式(III)中間體(其中M表示氫或鈉或鋰或堿金屬陽離子例如鈉)與式(XIV)中間體在適宜的試劑例如苯并三唑-l-基氧基三(吡咯烷并)磷鏃六氟磷酸酯(PyBOP)存在下反應(yīng)來制備。所述反應(yīng)可在石成例如三乙胺存在下在適宜的溶劑例如二氯曱烷和四氳呋喃的混合物中進(jìn)行。(III)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>(XIV)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>(I扁b)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>式(I-b)化合物也可通過將式(IV)中間體與適宜的酸例如三氟乙酸反應(yīng)來制備。所述反應(yīng)在適宜的溶劑例如甲醇或二氯曱烷中反應(yīng)。式(I)化合物(其中W是式(a-l)的基團(tuán)并且W是羥基，在此稱為式(I-c)化合物)可通過將式(V)中間體與氟化四丁基銨在適宜的溶劑例如四氬呋喃中反應(yīng)來制備。式(V)中間體中的TBDMS表示叔丁基(二曱基)曱硅烷基。式(II)中間體可通過將式(III)中間體與與式(VII)中間體在適<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>(V)宜的試劑例如N，-(乙基碳亞氨基)-N,N-二甲基-l，3-丙烷二胺一鹽酸鹽(EDC)和l-羥基-lH-苯并三唑(HOBT)存在下反應(yīng)來制備。該反應(yīng)可在堿例如三乙胺存在下在適宜的溶劑例如二氯甲烷和四氫^^喃的混合物中進(jìn)4亍。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>(III)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>(VII)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>(II)在另選的方法中，式(II)中間體(其中！^是-CH20H并且n和p均為0以及Y是N,在此稱為式(II-a)中間體)可以以單個的步驟通過將式(VIII)中間體與1,4-二喁烷-2,5-二醇和適宜的式(IX)的硼酸在適合的溶劑例如醇如乙醇中反應(yīng)來制備。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>(IX)式(II)中間體(其中RS是-CH20H-CH20H并且n和p均為0以及Y是N,在此稱為式(II-b)中間體)可以以單個的步驟通過將式(VIII)中間體與式(XI)中間體和適宜的式(IX)的硼酸在適合的溶劑例如醇如乙醇中反應(yīng)來制備。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>(IX)式(IV)中間體可以通過將式(VI)中間體與適宜的叔丁氧基羰基(Boc)保護(hù)的式(XV)的苯胺在苯并三唑-l-基氧基三(二甲基氨基)磷鏃六氟磷酸酯(BOP)和氫化鈉存在下反應(yīng)來制備。所述反應(yīng)可在適宜的溶劑例如p比咬中進(jìn)行。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>(VI)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>(xv)式(v)中間體可以通過將式(VI)中間體與適宜的叔丁基(二甲基)甲硅烷基(TBDMS)保護(hù)的式(XVI)的苯胺在苯并三唑-l-基氧基三(二曱基氨基)磷鏃六氟磷酸酯(BOP)和三乙胺存在下反應(yīng)來制備。所述反應(yīng)可在適宜的溶劑例如N,N-二甲基曱酰胺中進(jìn)行。(CH2)n/"飛式(VI)中間體可以通過將式(XVII)中間體與適宜的酸性溶液例如鹽酸或石咸性溶液例如氬氧化4里或氳氧^i鈉在適宜的溶劑例如醇如乙酸或丙醇或者二噹烷中反應(yīng)來制備。Ci々烷基、<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>(XVII)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>(VI)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>式(XVII)中間體(其中112是-012011并且p為1,在此稱為式(XVn-a)中間體)可以以單個的步驟通過將式(XII)中間體與1,4-二噹烷-2,5-二醇和適宜的式(IX)的硼酸在適合的溶劑例如醇如乙醇中反應(yīng)來制備。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>式(XVII)中間體(其中R2是-CH20H-CH20H并且p為1,在此稱為式(xvn-b)中間體)可以以單個的步驟通過將式(XII)中間體與式(XI)中間體和適宜的式(IX)的硼酸在適合的溶劑例如醇如乙醇中反應(yīng)來制備。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>(XVII-b)式(vin)中間體可以通過將式(xvin)中間體與p底p定在適宜的溶劑例如二氯曱烷在反應(yīng)來制備。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>式(XVIII)中間體可通過將式(X)中間體與式(VII)中間體在適宜的試劑例如N，-(乙基碳亞氨基)-N,N-二甲基-l,3-丙烷二胺一鹽酸鹽(EDC)和l-羥基-lH-苯并三唑(HOBT)存在下反應(yīng)來制備。該反應(yīng)可在石咸例如三乙胺存在下在適宜的溶劑例如二氯甲*克和四氬吹喃的混合物中進(jìn)4亍。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>式(X)中間體可以通過將式(XIX)中間體首先與氫氧化鈉在適宜的溶劑例如四氬呋喃中反應(yīng)，接著用鹽酸中和，然后將所得酸與式(XX)中間體和碳酸鈉反應(yīng)來制備。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>式(XII)中間體(其中p是1并且定義如上文^f旦氬除外)可以通過將相應(yīng)的式(XII)化合物(其中R"是氫)與適宜的用于引入所述適宜的R基團(tuán)的官能團(tuán)試劑反應(yīng)來制備。例如當(dāng)W是d—6烷基或Cw環(huán)烷基時，該試劑是適宜的烷基化試劑例如適宜的烷基卣化物如氯化物，該反應(yīng)在堿性條件下例如使用三乙胺在適宜的溶劑例如二甲基甲酰胺中完成。當(dāng)rs是CL6烷基磺?；鶗r，該試劑是適宜的磺?；噭├缁酋；栈锶缏然铮摲磻?yīng)在常規(guī)條件下完成。本發(fā)明還涉及式(II)、(Ha)、(II-b)、(VI)、(XVn)、(XVn曙a)和(XVII-b)的中間體(其涉及所有的這樣的式(A)化合物，即，其中Q是羥基羰基或四氫吡喃基氧基氨基羰基，并且n、p、X、Y、Z、R和rS如式(i)所定義)，以及其n-氧化物形式、藥學(xué)可接受的加成鹽和立體化學(xué)異構(gòu)形式。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>根據(jù)對式(I)化合物定義的組，對于以上中間體可以確定感興趣的、優(yōu)選的、更優(yōu)選的和最優(yōu)選的4匕合物的組。式(I)化合物和一些中間體可能在其結(jié)構(gòu)中具有至少一個立體中心。該立體中心可以R或S構(gòu)象存在。在上述方法中制備的式(I)化合物通常是對映異構(gòu)體的外消旋混合物，所述對映異構(gòu)體可用本領(lǐng)域已知的拆分方法彼此分離。式(I)的外隨后分離所述非對映體鹽形式，例如通過選擇結(jié)晶或分級結(jié)晶，然后用堿釋出對映異構(gòu)體。分離式(I)化合物對映異構(gòu)體形式的另一種方法涉及用手性固定相的液相色譜。所述純立體化學(xué)異構(gòu)形式還可從合適原料的相應(yīng)純立體化學(xué)異構(gòu)形式獲得，條件是反應(yīng)立體選擇性地發(fā)生。如果需要特定的立體異構(gòu)體，優(yōu)選通過立體有擇的制備方法合成所述化合物。這些方法使用對映異構(gòu)純的原料是有利的。式(I)化合物、其藥學(xué)可接受的酸加成鹽和立體異構(gòu)形式具有有價值的藥理學(xué)特性，因為它們具有組蛋白脫乙酰基酶(HDAC)抑制效果。本發(fā)明提供了一種通過給予有效量的本發(fā)明化合物抑制細(xì)胞(包括轉(zhuǎn)化的細(xì)胞)異常生長的方法。細(xì)胞的異常生長指的是不受正常調(diào)節(jié)機制(例如接觸抑制喪失)支配的細(xì)胞生長。這包括腫瘤生長的抑制，通過導(dǎo)致癌細(xì)胞生長停滯、終末分化和/或細(xì)胞程序死亡而直接抑制，以及抑制腫瘤的新血管形成而間接抑制。本發(fā)明還提供一種通過給受試者給予有效量的本發(fā)明化合物抑制肺瘤生長的方法，該受試者例如是需要這類治療的哺乳動物(特別是人)。特別是，本發(fā)明提供了一種通過給予有效量的本發(fā)明化合物抑制腫瘤生長的方法?？梢种频哪[瘤的實例包括但不限于肺癌(例如腺癌，并且包括非小細(xì)胞肺癌)、胰癌(例如，胰腺癌，例如外分泌胰腺的癌)、結(jié)腸癌(例如，結(jié)腸直腸癌，例如結(jié)腸腺癌和結(jié)腸&良瘤)、前列腺癌(包括前期病變)、淋巴系統(tǒng)的造血腫瘤(例如，急性淋巴細(xì)胞性白血病、B-細(xì)胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤)、骨髓性白血病(例如，急性髓性白血病(AML))、曱狀腺小嚢癌、脊髓發(fā)育不良綜合癥(MDS)、間質(zhì)源性肺瘤(例如，纖維內(nèi)瘤和一黃紋月幾肉瘤)、黑素瘤、畸胎癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、皮膚良性肺瘤(例如，角化l束皮瘤)、乳房癌(例如，前期乳腺癌)、腎癌、卵巢癌、膀胱癌和表皮癌。才艮據(jù)本發(fā)明的化合物可以用于其它的治療目的，例如a)在用于治療癌癥的對腫瘤放射照射之前、期間或之后通過給予本發(fā)明化合物促進(jìn)腫瘤對放射療法的敏感性；b)治療關(guān)節(jié)病和骨病理學(xué)病癥，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、幼年關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡；C)抑制平滑肌細(xì)胞增殖，包括血管增殖病癥、動脈粥樣硬化和再狹窄；d)治療炎癥和與皮膚病癥，如潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、過每文性鼻炎、移植物抗宿主疾病(graftvs.hostdisease)、結(jié)膜炎、哮喘、ARDS、貝切特氏病、移植排斥反應(yīng)、蕁麻疹、過^:性皮炎、斑禿、硬皮病、皮瘆、濕滲、皮肌炎、痤瘡、糖尿病、全身性紅斑狼癡、川崎病、多發(fā)性硬化、肺氣腫、嚢性纖維化和慢性支氣管炎；e)治療子宮內(nèi)膜異位、子宮平滑肌瘤、功能障礙性子宮出血和子宮內(nèi)膜增生；f)治療眼的血管化，包括侵襲視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜血管的血管病變；g)治療心臟功能紊亂；h)抑制免疫抑制癥狀，如治療HIV感染；i)治療腎功能紊亂；j)抑制內(nèi)分泌異常；k)抑制葡萄糖異生作用的功能紊亂；l)治療神經(jīng)病，如帕金森氏癥，或治療導(dǎo)致認(rèn)知異常的神經(jīng)病，例如阿爾茨海默氏病或與神經(jīng)元疾病相關(guān)的聚谷氨酰胺病(polyglutamine);m)治療精神錯亂，例如精神分裂癥、雙相型障礙、抑郁癥、焦慮和精神異常；n)抑制神經(jīng)肌肉的病變，例如肌萎縮性側(cè)索硬化；o)治療脊髓性肌萎縮；p)治療其它的受基因加強表達(dá)治療作用的病癥；q)加強基因療法；r)抑制脂肪生成；s)治療寄生蟲病，如瘧疾。因此，本發(fā)明公開了用作藥物的式(I)化合物，以及這些式(I)化合物在制備治療一種或多種上述病癥的藥物中的用途。式(I)化合物、其藥學(xué)可接受的酸加成鹽和其立體異構(gòu)形式具有有價值的診斷特性，因為它們可用于測定或確定生物樣品中的HDAC,包4舌;險測或測定在標(biāo)記4t;合物和HDAC之間配合物的形成。所述檢測或確定方法可以使用用標(biāo)記試劑標(biāo)記的化合物，標(biāo)記試劑例如是放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)等。放射性同位素的實例包括心1251、1311、3H和14。酶通常通過合適底物的結(jié)合，接著催化可檢測反應(yīng)來檢測酶。酶的實例包括例如P-半乳糖苷酶、p-葡萄糖苷酶、堿性磷酸酶、過氧化物酶和蘋果酸脫氫酶，優(yōu)選辣根過氧化酶。發(fā)光物質(zhì)包括例如魯米諾、魯米諾衍生物、螢光素、水母發(fā)光蛋白和螢光素酶。生物樣品可以定義為身體組織或體液。體液的例子是腦脊液、血液、血漿、血清、尿，痰液、唾液等?？紤]到本發(fā)明化合物有用的藥理學(xué)特性，其可配制到多種藥物形式中用于給藥。為了制備本發(fā)明的藥物組合物，有效量特定的化合物以堿或酸加成鹽的形式作為活性成分與藥學(xué)可接受的載體完全混合，載體可以采用多種形式，取決于希望給藥的制劑的形式。這些藥物組合物理想地是適合的單元劑型，優(yōu)選用于口服、直腸給藥、經(jīng)皮給藥或腸道外注射。例如，在口服劑型組合物的制備中，可使用任何常用的藥物介質(zhì)，例如，例如在口月l液體藥劑例如懸浮液、糖漿劑、酏劑和溶液的情況下，使用水、二醇、油、醇等；在粉末、丸、膠嚢和片的情況下使用固體載體如淀粉、糖、高嶺土、潤滑劑、粘合劑、崩解劑等。由于給藥容易，片劑和膠嚢是最有利的口服單位劑型，在這樣的情況下，顯然使用的是固體藥物載體。對于腸道外給藥的組合物，雖然可以包括其它成分，例如助溶成分，但是載體通常含有無菌水，至少占大部分。例如，可制備可注射的溶液，其中載體包括生理鹽水、葡萄糖溶液或生理鹽水和葡萄糖溶液的混合物。也可制備可注射的懸浮液，在這樣的情況下，可使用合適的液體載體、助懸劑等。在適用于經(jīng)皮給藥的組合物中，載體任選含有滲透增強劑和/或合適的潤濕劑，任選與比例較小的任何性質(zhì)的合適添加劑結(jié)合，添加劑對皮膚不產(chǎn)生顯著的有害影響。所述添加劑可促進(jìn)對皮膚的給藥和/或有助于制備所需組合物。這些組合物可以多種方式給藥，例如作為透過皮膚起作用的貼片、作為點滴劑(spot-on)或作為專欠膏。以劑量單元形式配制上述藥物組合物對于方便給藥和用量的一致性是特別有益的。在說明書和權(quán)利要求中所用的單位劑型指的是物理上地不連續(xù)的、合適作為單位劑量的單位，每個單位含有預(yù)定量的活性成分，適于產(chǎn)生所需的治療效果，并與需要的藥物載體結(jié)合。這樣的單位劑型的例子是片劑(包括劃痕片劑或包衣片劑)、膠嚢、丸劑、粉劑包、扁嚢劑(wafers)、可注射的溶液或懸浮液、茶匙劑、湯匙劑等，及其分隔開的多重劑量組合。從在下文中提供的測試結(jié)果，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定有效量。通常，治療有效量可以從0.005mg/kg體重到100mg/kg體重，特別是從0.005mg/kg體重到10mg/kg體重。在一天內(nèi)將需要的劑量分成兩個、三個、四個或更多個小劑量以合適的間隔給藥可能是適當(dāng)?shù)摹Ｋ鲂┝靠梢耘渲瞥蓡卧獎┝啃问?，例如每個單元劑量形式含有含0.5-500mg、特別是10mg-500mg的活性成分。作為本發(fā)明的另一個方面，提出了HDAC-抑制劑與另一抗癌劑組合，特別是用作藥物，更準(zhǔn)確地i兌是在癌癥或相關(guān)疾病的治療中。對于上述病癥的治療，本發(fā)明的化合物可有利地與一種或多種其它藥劑聯(lián)合使用，更具體地講是與其它的抗癌劑聯(lián)合使用?？拱﹦┑膶嵗?鉬配^f立化合物，例如順柏、卡鉑或奧沙利輛；-紫杉烷化合物，如紫杉醇(紫杉醇)或多西紫杉醇；-拓樸異構(gòu)酶I抑制劑，如喜樹堿化合物，例如伊立替康或托泊替康；-拓樸異構(gòu)酶n抑制劑，如抗腫瘤鬼臼毒素書f生物，例如依托泊苷或替尼泊苷；-抗胂瘤長春花生物堿，例如長春堿、長春新^咸或長春瑞濱；-抗肺瘤核苷衍生物，例如5—氟尿嘧啶、吉西他濱或卡培他濱；-烷基化劑，如氮芥或亞硝基脲，例如環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、卡莫司汀或洛莫司?。?抗腫瘤蒽環(huán)素(anthracycline)衍生物，例如柔紅霉素、多柔比星、伊達(dá)比星或米托蒽醌；畫HER2抗體，例如曲妥單抗(曲妥單抗)；-雌激素受體拮抗劑或選擇性的雌激素受體調(diào)節(jié)劑，例如他莫昔芬、托瑞米芬、屈洛昔芬、氟維司群(faslodex)或雷洛昔芬；-芳香酶(芳香酶)抑制劑，如依西美坦、阿那曲唑、來曲唑(letrazole)和伏氯唑；-分化劑，如類視黃醇、維生素D和維曱酸代謝作用阻滯劑(RAMBA),例如異維生素A酸(accutane);-DNA轉(zhuǎn)甲基酶抑制劑，例如氮胞苷；-激酶抑制劑，如flavoperidol、甲磺酸4尹馬替尼或吉非*#尼(gefitinib);-法尼基轉(zhuǎn)化酶(farnesyltransferase)抑制劑；-其它的HDAC抑制劑；國泛素國蛋白酶體途徑抑制劑，例如萬珂(Velcade);或-yondelis。在此所用的術(shù)語"柏配位化合物，，表示任何抑制腫瘤細(xì)胞生長的鉑配位化合物，其提供離子形式的鉑。術(shù)語"紫杉烷化合物"表示具有紫杉烷環(huán)系的一類化合物，其與紫杉屬(Taxus)某些樹種的萃取物相關(guān)或由所述萃取物衍生。術(shù)語"拓樸異構(gòu)酶抑制劑"用于表示能夠改變真核細(xì)胞內(nèi)DNA拓樸結(jié)構(gòu)的酶。它們對于重要的細(xì)胞功能和細(xì)胞增殖很關(guān)鍵。在真核細(xì)胞中有兩種類型的拓樸異構(gòu)酶，即I型和II型。拓樸異構(gòu)酶I是大約100,000分子量的單體酶。所述酶與DNA結(jié)合并引入一個暫時性單鏈缺口，解開雙螺旋(或使其解開)，然后經(jīng)缺口再次封閉，之后從DNA鏈上分離。拓樸異構(gòu)酶II具有類似的作用機理，包括引入DNA鏈的缺口或形成自由基。術(shù)語"喜樹堿化合物"用于表示與母體喜樹堿化合物相關(guān)或由其衍生的4^合物，母體喜4對石咸^i合物是/人中國樹種Camptothecinacuminata和印度樹種Nothapodytesfoetida獲得的不溶于水的生物石咸。術(shù)語"鬼臼霉素化合物"用于表示與母體鬼臼霉素有關(guān)或由其衍生的化合物，鬼臼霉素萃取自曼德拉草植物(mandrake)。術(shù)語"抗肺瘤長春花生物堿"用于表示與長春花植物(Vincarosea)的萃取物有關(guān)或由其衍生的化合物。術(shù)語"烷基化劑"包括不同類的化學(xué)試劑，其具有共同的特性，即，其具有在生理條件下給生物學(xué)生命大分子(例如DNA)提供烷基的能力。對于大多數(shù)更重要的試劑，例如氮芥類和亞硝基脲類，在復(fù)雜的降解反應(yīng)之后在體內(nèi)生成活性的烷基化片斷，其中一些降解反應(yīng)是酶催化的。烷基化劑最重要的藥理作用是干擾涉及細(xì)胞增殖基本進(jìn)程，特別是DNA合成和細(xì)胞分裂。烷基化劑能夠干擾迅速增殖的組織中DNA功能和完整性，這提供為其治療應(yīng)用和其許多的毒性提供了基礎(chǔ)。術(shù)語"抗月中瘤蒽環(huán)素衍生物，，包括從真菌Strep,peuticusvar.caesius獲得的抗生素及其衍生物，其特征在于具有四環(huán)素環(huán)結(jié)構(gòu)，通過糖苷鍵連接一個特殊的糖氨基糖柔胺(daunosamine)。已經(jīng)指出在原發(fā)性乳房癌中人表皮生長因子受體2蛋白質(zhì)(HER2)的擴(kuò)增與某些患者的不良臨床預(yù)后結(jié)果有關(guān)。曲妥單抗是一種高度純化重組DNA-衍生的人化單克隆IgGl-K抗體，其高親合性和高特異性地與HER2受體的胞外域結(jié)合。許多乳腺癌具有雌激素受體，雌激素可促進(jìn)這些腫瘤的生長。術(shù)語"雌激素受體拮抗劑"和"選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑"用來表示與雌激素受體(ER)結(jié)合的雌二醇的竟?fàn)幮砸种莆?。選擇性的雌激素受體調(diào)節(jié)劑與ER結(jié)合時，導(dǎo)致受體的三維形狀改變，調(diào)節(jié)其與雌激素效應(yīng)元件(ERE)在DNA上的結(jié)合。在絕經(jīng)后婦女中，循環(huán)的雌激素的主要來源是腎上腺和卵巢雄激素(雄烯二酮和睪丸激素)在周圍組織中通過芳香酶酶轉(zhuǎn)化為雌激素(雌甾酮和雌二醇)。通過芳香酶抑制或鈍化導(dǎo)致雌激素?fù)p失對于一些患有激素依賴性乳腺癌的絕經(jīng)后患者是有效的和選擇性的治療。在此使用的術(shù)語"抗雌激素劑"不但包括雌激素受體拮抗劑和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，而且包括如上所述的芳香酶抑制劑。術(shù)語"分化劑"包括可以多種方式抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)分化的化合物。已知在多種正常和惡性細(xì)胞類型的生長調(diào)節(jié)和分化中，維生素D和類視黃醇起了重要的作用。維甲酸代謝阻滯劑(RAMBA's)通過抑制維曱酸的細(xì)胞色素P450-介導(dǎo)的分解代謝提高內(nèi)源性維甲酸的水平。DNA甲基化變化屬于人類肺瘤形成中最常見的異常。在選擇的基因的啟動子中，高曱基化通常與所涉及基因的鈍化有關(guān)。術(shù)語"DNA曱基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，，用來表示通過DNA轉(zhuǎn)曱基酶的藥理學(xué)抑制和肺瘤抑制基因表達(dá)的再活化起作用的化合物。術(shù)語"激酶抑制劑"包括激酶的有效抑制劑，起涉及細(xì)胞周期發(fā)展和細(xì)力包程序死亡(編程性細(xì)力包死亡)。術(shù)語"法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑"用來表示被設(shè)計用于阻止Ras和其它細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的法尼基化的化合物。它們已經(jīng)顯示出對惡性細(xì)胞增殖和存活有效。術(shù)語"其它的HDAC抑制劑"包括但不限于-羧酸酯類，例如丁酸酯、肉桂酸、4-苯基丁酸酯或丙戊酸；-異羥肟酸類，例如辛二?；桨樊惲u肟酸(SAHA)、含哌。秦的SAHA類似物、聯(lián)芳基異羥肟酸A-161906及其咔哇基醚-、四氫吡"定-和四氳萘酮-類似物、雙環(huán)芳基-N-羥基羧酰胺類、pyroxamide、CG-1521、PXD-lOl、石黃酰胺異羥肟酸、LAQ-824、LBH-589、曲古抑菌素A(trichostatinA,TSA)、oxamflatin、scriptaid、與scriptaid相關(guān)的三環(huán)分子、間-羧基肉桂酸二異羥肟酸(CBHA)、CBHA樣異羥肟酸類、trapoxin-異羥肟酸類似物、CRA-024781、R306465和苯曱酰基-和雜芳基-相關(guān)的異羥肟酸類、氨基辛二酸酯和丙二酰基二酰胺；國環(huán);l大四月太類,"f列長口trapoxin、apidicin、纟宿盼酉臾月大(depsipeptide)、spiruchostatin-相關(guān)的化合物、RedFK-228、含巰基的環(huán)狀四肽類(SCOPs)、含異羥肝酸的環(huán)狀四肽類(CHAPs)、TAN-174s和-苯曱酰胺為，例如MS-275或CI-994,或-depudecin。術(shù)語"泛素-蛋白酶體通道抑制劑"用于表示抑制蛋白酶體內(nèi)細(xì)i包蛋白質(zhì)(包括細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白質(zhì))的靶向破壞的化合物。為了治療癌癥，根據(jù)本發(fā)明的化合物可如上所述與放射聯(lián)合給藥于患者。放射的意思是指電離輻射，并且特別是伽馬輻射，尤其是通過直線加速器或通過現(xiàn)在通用的放射性核素發(fā)射的射線。通過放射性核素對肺瘤輻照可以是外部的或內(nèi)部的。本發(fā)明還涉及抗癌劑和本發(fā)明的HDAC抑制劑的根據(jù)本發(fā)明的組合物。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的組合物，其用于醫(yī)藥治療，例如抑制腫瘤細(xì)力包的生長。本發(fā)明還涉及#4居本發(fā)明的組合物，其用于抑制腫瘤細(xì)胞的生長。本發(fā)明還涉及抑制人受試者內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長的方法，其包括給所述受試者給予有效量的本發(fā)明組合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種抑制細(xì)胞異常生長的方法，包括通過給予有效量本發(fā)明組合物轉(zhuǎn)化細(xì)胞。其它的藥劑和HDAC抑制劑可以同時(例如，以分離的或單一的組合物)或以任一順序相繼給藥。就后一種情況而言，兩種化合物可在一定周期內(nèi)以足夠保證實現(xiàn)有益效果或協(xié)同效應(yīng)的量和方式給藥。應(yīng)理解，優(yōu)選的給藥方法和順序以及該組合物中各個成分的各自劑量和給藥方案取決于所給予的特定的其它藥劑和HDAC抑制劑、它們的給藥途徑、所治療的特定腫瘤和,皮治療的特定宿主。最'除當(dāng)?shù)慕o藥方法和順序以及劑量和給藥方案可容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員用常^L方法并考慮在此所列出的信息確定。賴配位化合物有利地以每個療程每平方米體表面積1-500mg(mg/m2)的劑量給藥，例如50-400mg/m2,特別地，順氯氨鉑劑量為約75mg/m2，卡鉑劑量為約300mg/m2。紫杉烷化合物有利地以每個療程每平方米體表面積50-400mg(mg/m2)的劑量給藥，例如75-250mg/m2,特別地，紫杉醇劑量為約175-250mg/m2,多西紫杉醇劑量為約75-150mg/m2。(mg/m)的劑量給藥，例如1-300mg/m2,特別地，伊立替康劑量為約100-350mg/m2，托泊替康劑量為約1-2mg/m2?？闺狭龉砭识舅匮苌镉欣匾悦總€療程每平方米體表面積30-300mg(mg/m2)的劑量給藥，例如50-250mg/m2,特別地，依托泊苷劑量為約35-100mg/m2，替尼泊苷劑量為約50-250mg/m2。抗腫瘤長春花生物石咸有利地以每個療程每平方米體表面積2-30mg(mg/m2)的劑量給藥，特別地，長春堿劑量為約3-12mg/m2,長春新堿劑量為約l-2mg/m2，長春瑞濱劑量為約10-30mg/m2。mg(mg/m)的劑量癥合藥，例如700-1500mg/m2,特別地，5-氟尿嘧咬劑量為200-500mg/m2,吉西他濱劑量為約800-1200mg/m2,卡培他濱劑量為約1000-2500mg/m2。烷基化劑如氮芥或亞硝基脲有利地以每個療程每平方米體表面積100-500mg(mg/m2)的劑量給藥，例如120-200mg/m2,特別地，環(huán)磷酰胺劑量為約100-500mg/m2,苯丁酸氮齊劑量為約0.1-0.2mg/kg,卡莫司汀劑量為約150-200mg/m2,洛莫司汀劑量為約100-150mg/m2?？鼓[瘤蒽環(huán)素書卞生物有利地以每個療程每平方米體表面積10-75mg(mg/m2)的劑量給藥，例如15-60mg/m2,特別地，多柔比星劑量為40-75mg/m2，柔紅霉素劑量為約25-45mg/m2,伊達(dá)比星劑量為約10-15mg/m。曲妥單抗有利地以每個療程每平方米體表面積1-5mg(mg/m2)的劑量給藥，特別是2-4mg/m2。根據(jù)特定的藥劑和-故治療的癥狀，抗雌激素藥劑有利地以每天約l-100mg的劑量給藥。他莫昔芬有利地以5-50mg的劑量口服給藥，優(yōu)選10-20mg每天兩次，連續(xù)治療足夠的時間以實現(xiàn)和保持治療^:果。托瑞米芬有利地以約60mg的劑量一天一次經(jīng)口給藥，連續(xù)治療足夠的時間以實現(xiàn)和保持治療效果。阿那曲唑有利地以約1mg的劑量一天一次經(jīng)口給藥。屈洛昔芬有利地以約20-100mg的劑量一天一次經(jīng)口給藥。雷洛昔芬有利地以約60mg的劑量一天一次經(jīng)口給藥。依西美坦有利地以約25mg的劑量一天一次經(jīng)口給藥。這些劑量可以每療程例如一次、兩次或多次^會藥，其可例如每隔7天、14天、21天或28天重復(fù)。考慮到它們的有用的藥理學(xué)特性，本發(fā)明組合物的成分，即所述的其它藥劑和所述的HDAC抑制劑可以被配制成用于給藥目的的各種藥物形式。所述成分可分別地配制在單一的藥物組合物中，或配制在含有這兩種成分的整體藥物組合物中。本發(fā)明因此還涉及藥物組合物，其含有所述的其它藥劑和所述的HDAC抑制劑以及一種或多種藥物載體。本發(fā)明還涉及藥物組合物形式的根據(jù)本發(fā)明的組合物，其含有抗癌劑和才艮據(jù)本發(fā)明的HDAC抑制劑以及一種或多種藥物載體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及根據(jù)本發(fā)明的組合物在生產(chǎn)抑制腫瘤細(xì)胞生長的藥物組合物中的用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種產(chǎn)品，其含有作為第一活性成分的根據(jù)本發(fā)明的HDAC抑制劑和作為第二活性成分的抗癌劑，所述產(chǎn)品為組合的制劑，用于同時、單獨或相繼用于治療罹患癌癥的患者。實驗部分以下實施例說明本發(fā)明。在下文中，"EDC，，定義為N，-(乙基碳亞氨基)-^1,:^-二甲基-1,3-丙烷二胺一鹽酸鹽，"DCM"定義為二氯甲烷，"DIPE"定義為二異丙基醚，"EtOAc，，定義為乙酸乙酯，"EtOH"定義為乙醇，"HOBt"定義為l-羥基-lH-苯并三唑，"MeOH"定義為甲醇，"TFA，，定義為三氟乙酸以及"THF'定義為四氬吹喃。A、制備中間體化合物實施例Ala)制備中間體1將2-(l-哌。秦基)-5-嘧啶曱酸乙酯(0.059mol)在THF(300ml)和1N氬氧化鈉(300ml)中的混合物在室溫下靜置過夜，然后攪拌。加入IN鹽酸(300ml),再將該混合物攪拌10min。加入碳酸鈉(0.178mol),再將所得混合物在室溫下攪拌10min,然后以小份加入1-[[(9H-藥一9_基曱氧基)羰基]氧基]-2,5-吡咯烷二酮(0.059mol),再將該反應(yīng)混合物在室溫下攪拌15小時。將該混合物用濃鹽酸酸化，濾出沉淀物，干燥(真空)，得到22.5g(90。/。)的中間體l,熔點218.5-221.2°C。b)制備中間體2將三乙胺(0.069mol)、然后是EDC(0.0303mol)和HOBt(0.0303mol)、接著是O-(四氫-2H-吡喃-2-基)-羥胺(0.0303mol)加至中間體1(0.0233mol)在DCM/THF(500ml)中的混合物中，再將該反應(yīng)混合物在室溫下攪拌18小時。將該混合物用DCM稀釋，再用水洗滌。將有機層分離，再用10%碳酸鈉溶液洗滌。將分離的有機層干燥(MgS04),過濾，蒸發(fā)溶劑。將殘余物通過柱色譜法經(jīng)硅膠(洗脫液DCM/MeOH100/0至97.5/2.5，在100min內(nèi))純化。收集產(chǎn)物級分，再蒸發(fā)溶劑，得到8.4g(68%)的中間體2。c)制備中間體3<formula>formulaseeoriginaldocumentpage35</formula>將中間體2(0.016mol)在哌咬(0.040mol)和DCM(200ml)中的混合物在室溫下攪拌過夜，再將反應(yīng)混合物用水萃取，然后將水層濃縮，再與乙腈共蒸發(fā)。將殘余物(3.5g)通過柱色譜法經(jīng)硅膠(洗脫液DCM/(MeOH/NH3)95/5)純化。收集產(chǎn)物級分，再蒸發(fā)溶劑，得到2.5g(50。/o)的中間體3，熔點70.8-93.9°C。d)制備中間體4將中間體3(0.0016mol)、1-萘基-硼酸(0.0016mol)和1,4-二貸惡烷-2,5-二醇(0.0018mol)在EtOH(20ml)中的混合物在室溫下攪拌48小時，傾入到水中，再用DCM萃取。分離有機層，干燥(MgS04),過濾，再蒸發(fā)溶劑。將殘余物通過柱色譜法經(jīng)硅膠(5|nm)(洗脫液DCM/MeOH/NH4OH99/1/0.5至92/8/0.4)純化。收集純級分，蒸發(fā)溶劑，得到0.18g(23。/。)的中間體4。實施例A2制備中間體5將中間體3(0.0016mol)、苯并[b]噻吩-2-基-硼酸(0.0016mol)和1,4-二噹烷-2,5-二醇(0.0018mol)在EtOH(20ml)中的混合物在室溫下攪拌48小時，傾入到水中，再用DCM萃取。分離有機層，干燥(MgS04),過濾，再蒸發(fā)溶劑。將殘余物通過柱色譜法經(jīng)硅膠(5|Lim)(洗脫液DCM/MeOH/NH4OH99/1/0.5至92/8/0.4)純化。收集純級分，蒸發(fā)溶劑，得到0.195g(79%)的中間體5。實施例A3制備中間體6將1,4-二終惡烷-2,5-二醇(0.003mol)，然后將2-(l-哌。秦基)陽5-嘧咬曱酸乙酯(0.003mol)加至[l-(苯基磺酰基)-lH-吲哚-3-基]-硼酸(0.003mol)在EtOH(50ml)中的溶液中。將該混合物在室溫下攪拌48小時，然后過濾。蒸發(fā)濾液。將殘余物置于EtOAc中。將有機層用水洗滌，然后用飽和氯化鈉洗滌，干燥(MgS04),過濾，再蒸發(fā)溶劑。將殘余物(1.7g)通過柱色i普法經(jīng)硅月交(15-40)Lim)(洗脫液DCM/MeOH98/2)純化。收集純級分，蒸發(fā)溶劑，得到1.2g(71%)的中間體6。b)制備中間體7將中間體6(0.0015mol)在3N鹽酸(30ml)和二狩惡烷(10ml)中的混合物在100。C下攪拌24小時。蒸發(fā)二嚅烷。加入水(30ml)。將該混合物用DCM萃取。分離有機層，干燥(MgS04)，過濾，再蒸發(fā)溶劑，得到0.57g(67%)的中間體7。c)制備中間體8將EDC(0.0015mol)和HOBt(0.0015mol)在室溫下加至中間體7(0.001mol)、O-(四氬-2H-吡喃-2-基)-羥胺(0.0015mol)和三乙胺(0.0047mol)在DCM/THF50/50(60ml)中的溶液中。將該混合物在室溫下攪拌48小時，傾入到水中，再用DCM萃取。分離有才幾層，干燥(MgS04),過濾，再蒸發(fā)溶劑。將殘余物(0.82g)通過柱色譜法經(jīng)硅膠(5(am)(洗脫液DCM/MeOH/NH4OH98/2/0.2至92/8/0.8)純化。收集純級分，蒸發(fā)溶劑，得到0.19g(31%)的中間體8。實施例A4a)制備中間體9將2-[4誦(氨基甲基)-1-哌啶基]-5-嘧啶曱酸乙酯(0.0114mol)、乙醛(0.0227mol)和Pd/C(0.6g)在MeOH(300ml)中的混合物在室溫和3bar壓力下氫化48小時，然后經(jīng)硅藻土過濾。石圭藻土用Me〇H/DCM洗滌。蒸發(fā)濾液。將殘余物(3.6g)通過柱色譜法經(jīng)石圭月交(15-40)nm)(洗脫液DCM/MeOH/NH4OH90/10/0.5)純化。收集純級分，蒸發(fā)溶劑，得到0.75g(230/0)的中間體9。b)制備中間體10將中間體9(0.0022mol)、2-苯并吹喃基-硼酸(0.0022mol)和1,4-二哺烷-2,5-二醇(0.0024mol)在EtOH(30ml)中的混合物在室溫下攪拌48小時，傾入到水中，再用DCM萃取。分離有機層，干燥(MgS04)，過濾，再蒸發(fā)溶劑。將殘余物(lg)通過柱色譜法經(jīng)硅膠(15-40pm)(洗脫液DCM/MeOH/NH4OH98.5/1.5/0.1)純化。收集純級分，蒸發(fā)溶劑，得到0.22g(22%)的中間體10。c)制備中間體11將中間體10(0.0004mol)和氬氧化鈉(0.0009mol)在EtOH(40ml)中的混合物在60。C攪拌6小時，然后冷卻至室溫，再蒸發(fā)至干燥，得到0.22g(100%)的中間體ll。d)制備中間體12將EDC(0.0007mol)和HOBt(0.0007mol)在室溫和N2流下加至中間體11(0.0004mol)在DCM(30ml)和THF(30ml)中的溶液中。將該混合物在室溫下攪拌15分鐘。加入O-(四氫-2H-吡喃-2-基)-羥胺(0.0009mol)。將該混合物在室溫下攪拌96小時，傾入到水中，再用DCM萃取。分離有機層，干燥(MgSOj,過濾，再蒸發(fā)溶劑。將殘余物(0.7g)通過柱色^普法經(jīng)珪膠(5)iim)(洗脫液DCM/MeOH/NH4OH99/1/0.5至96/4/0.2)純化。收集純級分，蒸發(fā)溶劑，得到0.108g(42%)的中間體12。實施例A5a)制備中間體13<formula>formulaseeoriginaldocumentpage39</formula>、[4-(1,1-二甲基乙基)苯基]-硼酸(0.0016mol)和2，3-二羥基-丙醛(0.0032mol)在EtOH(60ml)中的混合物在60。C下反應(yīng)90小時，然后將該粗品通過柱色i普法經(jīng)硅膠(NP)(梯度洗脫液DCM/MeOH100/0至96.5/3.5,在100分鐘內(nèi))純化。收集產(chǎn)物級分，再蒸發(fā)溶劑。將殘余物從乙腈中結(jié)晶，然后將所得沉淀物濾出，干燥(真空)，得到0.14g(15%)的中間體13,熔點209。C。實施例A6a)制備中間體14<formula>formulaseeoriginaldocumentpage39</formula>將2-(l-哌。秦基)-5-嘧啶曱酸乙酯(0.018mol)、[4-(1,1-二曱基乙基)苯基]-硼酸(0.018mol)和2,3-二羥基-丙醛(0.036mol)在EtOH(150ml)中的混合物在60。C下反應(yīng)18小時。將所得沉淀物濾出，干燥，得到5,3g(66%)。將殘余物通過色譜法在ChimlcelOJ(10)iim)上(洗脫液MeOH100)純化。收集兩個產(chǎn)物級分，蒸發(fā)溶劑，獲得兩個對映體。將對映體A從乙腈中結(jié)晶，然后將所得沉淀物濾出，干燥(真空)，得到2,lg中間體14,熔點190。C。b)制備中間體15<formula>formulaseeoriginaldocumentpage39</formula>將中間體14(0.0015mol)在IN氬氧化鈉(40ml)和THF(40ml)中的混合物在室溫下攪拌24小時。加入lN鹽酸(40ml)。蒸發(fā)THF。將所得沉淀物濾出，干燥，得到1.9g(100%)的中間體15。c)制備中間體16<formula>formulaseeoriginaldocumentpage40</formula>將EDC(0.0065mol)和HOBt(0.065mol)在室溫下加至中間體15(0.0043mol)、O-(四氫-2H-他喃-2誦基)-羥胺(0.065mol)和三乙胺(0.013mol)在DCM/THF50/50(200ml)中的溶液中。將該混合物在室溫下攪拌48小時，傾入到水中，再用DCM萃取。分離有機層，干燥(MgS04),過濾，再蒸發(fā)溶劑，然后將該粗品通過柱色譜法經(jīng)硅膠(NP)(梯度洗脫液DCM/MeOH100/0至94/6)純化。收集產(chǎn)物級分，再蒸發(fā)溶劑，得到0,76g(34%)的中間體16，熔點173°C。B、制備最終化合物實施例Bl制備化合物1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage40</formula>將中間體4(0.0003mol)在TFA(1ml)和MeOH(20ml)中的混合物在室溫下攪拌48小時，然后蒸發(fā)。將殘余物從乙醚/乙腈中結(jié)晶。將沉淀物過濾，干燥，得到0.125g(64%)的化合物1,熔點136。C。實施例B2制備化合物20.86C2HF3O20.74H20將中間體5(0.0004mol)在TFA(1ml)和MeOH(20ml)中的混合物在室溫下攪拌48小時，然后蒸發(fā)。將殘余物從乙醚/乙腈中結(jié)晶。將沉淀物過濾，干燥，得到0.153g(75%)的化合物2，熔點165。C。實施例B3制備化合物3在5。C下將TFA(0.8ml)滴加至中間體8(0.0002mol)在MeOH(16ml)中的溶液中。將該混合物在室溫下攪拌48小時，然后蒸發(fā)至干燥。將殘余物從乙醚/MeOH中結(jié)晶。濾出沉淀物，用乙醚洗滌，干燥，得到0.135g(82%)的化合物3,熔點206°C。實施例B4制備化合物4將中間體12(0.0002mol)在TFA(0.5ml)和MeOH(10ml)中的混合物在室溫下攪拌30小時，然后蒸發(fā)至干燥。將殘余物從乙醚/乙腈中結(jié)晶。濾出沉淀物，干燥。將殘余物(0.058g)通過柱色譜法經(jīng)涂漬氨基的硅月交(洗脫液DCM/MeOH/水90/10/1)純化。收集純級分，.0.76C2HF3020.66H20蒸發(fā)溶劑，得到0.05g(56%)的化合物4，熔點9(TC。實施例B5制備化合物5.C2HF302將中間體13(0.000243mol)和TFA(1ml)在MeOH(20ml)中的混合物攪拌48小時，然后在<40"下蒸發(fā)溶劑。將殘余物混懸于DIPE中，再濾出需要的產(chǎn)物，干燥(真空)，得到0.096g(73%)的化合物5,熔點138-154°C。實施例B6制備化合物6將中間體16(0.0015mol)和TFA(5ml)在MeOH(100ml)中的混合物攪拌72小時，然后在〈4(TC下蒸發(fā)溶劑。將殘余物混懸于DIPE中，再濾出需要的產(chǎn)物，干燥(真空)，得到0.66g(76%)的化合物6，熔點163-171°C。表F-1列出了根據(jù)以上實施例之一制備的化合物。表F-1<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>C、藥理學(xué)實施例對于抑制組蛋白脫乙?；傅捏w外試驗(參見實施例C.l)測定了由式(I)化合物獲得的HDAC酶活性的抑制作用。式(I)化合物的細(xì)胞活性在A2780腫瘤細(xì)l包上用測定細(xì)胞毒性或存活率的比色試馬全確定(MosmannTim,JournalofImmunologicalMethods65:55-63,1983)(參見實施例C.2)。化合物的溶解度測定的是化合物保持在溶液中的能力。在首先的兩種方法中，測定化合物在稀釋時保留在水溶液中的能力(參見實施例C.3.a和C.3.b)。DMSO-儲備溶液在不同的連續(xù)步驟中用單一的含水緩沖劑溶劑稀釋。在第一方法(參見C.3.a)中，用濁度計測定的濁度。在第二方法(C.3.b)中，然后^"對出現(xiàn)的沉淀物在BDGentest溶解度掃描儀上掃描混合物。在第三方法中，用化學(xué)發(fā)光氮氣檢測器可測定化合物在不同pH值的溶解度(參見實施例C.3.c)。藥物滲透性表示其從一種介質(zhì)進(jìn)入或通過另一種介質(zhì)的能力。具體而言，是其穿過腸膜進(jìn)入和/或從血流進(jìn)入靶體的能力。滲透性(參見實施例C.4)可以通過形成濾過固定的人工膜磷脂雙層測定。在濾過固定的人工膜試驗中，用96孔微滴定板和96孔濾板形成"夾心，，，從而每個組成的孔^皮分成雙室，供體溶液在底部，受體溶液在上部，用涂J文了2%(wt/v)二油?；字；?膽堿的十二烷溶液的125|Lim微過濾片(孔徑0.45ium微米)分隔，當(dāng)該體系接觸含水緩沖溶液時，濾片通道內(nèi)部形成多層雙分子層?；衔锿ㄟ^該人工膜的滲透性按cm/s計量。目的在于尋找在4.0和7.4兩個不同的pH值通過平行人工膜的藥物的滲透性。用UV-分光光度法在250和500nm之間的最佳波長4企測化合物。藥物的代謝作用是指脂溶性的異生化合物或生物內(nèi)生的化合物經(jīng)酶催化轉(zhuǎn)化成極性、水溶性的和可排泄的代謝產(chǎn)物。藥物代謝的主要器官是肝臟。代謝產(chǎn)物往往比母體藥物活性小或是非活性的。但是，一些代謝產(chǎn)物可能具有增強的活性或毒性作用。因此，藥物代謝可包括"解毒"和"中毒，，兩種過程。確定生物處理藥物和化學(xué)試劑能力的主要酶系之一代表性的是細(xì)胞色素P450單氧化酶，其為NADPH依賴的酶?；衔锏拇x穩(wěn)定性可以在體外借助于亞細(xì)胞的人類組織(見實施例C.5.a)確定。此時，化合物的代謝穩(wěn)定性可以表示為這些化合物與微粒體培養(yǎng)15分鐘后代謝的藥物的百分比?；衔锏亩客ㄟ^LC-MS分析確定?；衔锏拇x穩(wěn)定性還可通過計算在大鼠肝細(xì)胞中的半衰期(halflive)來確(參見實施例C.5.b.)。已經(jīng)表明多種抗肺瘤劑活化p21蛋白質(zhì)，包括DNA損傷劑和組蛋白脫乙酰基酶抑制劑。DNA損傷劑通過胂瘤抑制基因p53活化p21基因，而組蛋白脫乙?；敢种苿┙?jīng)轉(zhuǎn)錄因子Spl轉(zhuǎn)錄性地活化p21基因。因此，DNA損傷劑通過p53效應(yīng)元件活化p21啟動子，而組蛋白脫乙酰基酶抑制劑通過spl位點(位于相對于TATAbox的-60bp至+40bp區(qū)域)活化p21啟動子，導(dǎo)致p21蛋白質(zhì)的表達(dá)提高。當(dāng)細(xì)胞中的p21啟動子由未含有p53效應(yīng)元件的p211300bp啟動子片l殳組成時，其相應(yīng)地對DNA損傷劑沒有響應(yīng)?？梢远喾N方式評價化合物i秀導(dǎo)p21的性能。第一種方法是用感興趣的化合物處理腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞溶胞后用p21酶標(biāo)記免疫分析法(WAF1ELISAofOncogene)測定p21的誘導(dǎo)作用。所述p21試驗是使用小鼠單克隆抗體和兔多克隆抗體的"夾心"酶免疫分析法。對于人p21蛋白質(zhì)特異性的兔多克隆抗體已經(jīng)固定到試劑盒提供的塑料孔板的表面上。分析樣品中存在的任何p21會與捕捉抗體結(jié)合。生物素化的檢測單克隆抗體還可識別人p21蛋白質(zhì)，并且與已經(jīng)一皮捕l足抗體保留的任何p21結(jié)合。所述檢測抗體接著通過辣根過氧化酶共軛的抗生蛋白鏈菌素結(jié)合。辣根過氧化酶催化顯色底物四曱基聯(lián)苯胺從無色溶液到藍(lán)色溶液的轉(zhuǎn)化(或加入停止試劑后轉(zhuǎn)為黃色)，顏色的強度與和板結(jié)合的p21蛋白質(zhì)的量成正比。用分光光度計測定顯色反應(yīng)產(chǎn)物。通過用已知濃度的p21(以冷凍干燥物提供)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。該試驗可以測定p21誘導(dǎo)作用是DNA損傷的結(jié)果或是組蛋白脫乙酰基酶抑制的結(jié)果(參見實施例C.6.a)。另一種方法測試化合物在細(xì)胞水平抑制HDAC的結(jié)果由此確定其應(yīng)元件的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染口，由其中與對照水^相比提高的報道基因表達(dá)確定化合物具有p21誘導(dǎo)性能。報道基因是熒光蛋白質(zhì)，報道基因的表達(dá)以發(fā)射的熒光的量測定(參見實施例C.6.b)。最后一種方法是體內(nèi)方法，其中使用小鼠篩選化合物的藥物活性。可以將上述穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞以足夠引起腫瘤產(chǎn)生的量施用給小鼠。在腫瘤細(xì)胞有充足的時間形成腫瘤后，將有潛力的活性化合物施用給所述動物，通過測定報道基因的表達(dá)評價所述化合物對肺瘤細(xì)胞的作用。與藥物活性化合物一起培養(yǎng)會導(dǎo)致與對照水平相比提高了的報道基因表達(dá)(參見實施例C.6.C)。特定的HDAC抑制劑不應(yīng)抑制其它的酶，例如大量的CYPP450蛋白質(zhì)。CYPP450(大腸桿菌表達(dá)的)蛋白質(zhì)3A4、2D6en2C9將其特定的底物轉(zhuǎn)化為熒光分子。CYP3A4蛋白質(zhì)將7-芐氧基-三氟曱基香豆素(BFC)轉(zhuǎn)化為7-羥基-三氟甲基香豆素。CYP2D6蛋白質(zhì)將3-[2-(N,N-二乙基-N-曱基氨基)乙基]-7-甲氧基-4-曱基香豆素(AMMC)轉(zhuǎn)化為3-[2-(N,N-二乙基氨基)乙基]-7-羥基-4-曱基香豆素鹽酸鹽，CYP2C9蛋白質(zhì)將7-曱氧基-4-三氟曱基香豆素(MFC)轉(zhuǎn)化為7-羥基-三氟甲基香豆素?；衔镆种扑龅拿复俜磻?yīng)將導(dǎo)致熒光信號的降低(參見實施例C.7)。實施例C丄抑制組蛋白脫乙?；傅捏w外試-驗使用Biomol(cat.No:AK-500-0001)的HDAC熒光活性試-瞼/藥物發(fā)現(xiàn)試劑盒。HDAC熒光活性試驗基于FluordeLys(熒光基因組蛋白脫乙酰基酶賴氨酰((FluorogenicHistonedeAcetvlaseLvsvl))底物和顯影劑組合物。FluordeLys底物含有乙酰化賴氨酸側(cè)鏈。底物的脫乙酰作用使所速底物具有感光性，從而在第二個步驟中，用FluordeLys顯影劑處理生成熒光團(tuán)。HeLa細(xì)胞核萃取物(供應(yīng)商Biomol)以60|ug/ml量與75(iM的底物一起培養(yǎng)。將FluordeLys底物加入到緩沖劑中，所述緩沖劑含25mMTris、137mMNaCl、2.7mMKC1和1mMMgCl2*6H20,pH值7.4。30分鐘后，加入l體積顯影劑。用355nm光激發(fā)熒光團(tuán)，在熒光板檢測器上纟企測發(fā)射光(450nm)。對于每個試-驗，對照(含HeLa細(xì)胞核萃取物和緩沖劑)、空白培養(yǎng)(含緩沖劑，但是不含HeLa細(xì)胞核萃取物)和樣品(含溶于DMSO并進(jìn)一步在緩沖劑中稀釋的化合物和HeLa細(xì)胞核萃取物)平行進(jìn)行。在第一種情況下，化合物在10^M的濃度測試。當(dāng)所述化合物在10-5M顯示活性時，產(chǎn)生濃度-響應(yīng)曲線，其中化合物在10-5M和10-9M之間的濃度測試。所有樣品測試4次。在每個測試中，從對照和樣品數(shù)值扣除空白值。對照樣品表示底物100%脫乙?；?。對于每個樣品，熒光表示為對照平均值的百分比。如果合適，IC50-值(將代謝產(chǎn)物的量降低至對照的50%所需的藥物的濃度)用對已分級數(shù)據(jù)的概率分析計算。在此，測試化合物的作用表示為pIC5Q(IC50-值200780003016.6說明書第39/48頁的負(fù)對數(shù)值)(參見表F-2)。實施例C.2:在A2780細(xì)胞上測定抗增殖活性將測試的所有化合物溶于DMSO并進(jìn)一步用培養(yǎng)液稀釋。在細(xì)i包增殖試驗中，最終的DMSO濃度從不超過0.1%(v/v)。對照樣品含A2780細(xì)胞和DMSO,不含化合物；空白樣品含DMSO,但是不含細(xì)胞。MTT以5mg/ml溶于PBS。制備由O.IM甘氨酸和0.1MNaCl組成的甘氨酸緩沖劑，用NaOH(1N)緩沖到pH10.5(所有試劑來自于Merck)。人A2780卵巢癌細(xì)胞(T.C.Hamilton博士[FoxChaseCancerCentre,Pennsylvania,USA]熱心捐贈)在補充了2mML-谷氨酸鹽、50|Lig/ml慶大霉素和10%胎牛血清的RPMI1640介質(zhì)中培養(yǎng)。在37。C、濕潤的5%C02氣氛中將細(xì)胞常規(guī)保持為單層培養(yǎng)物。細(xì)胞用胰蛋白酶/EDTA溶液以1:40的分流比每周傳代一次。所有介質(zhì)和添加劑/人LifeTechnologies獲得。用Gen-Probe類茵質(zhì)體組織培養(yǎng)試劑盒(供應(yīng)商BioMerieux)確定細(xì)月包無支原體污染。將細(xì)胞接種到NUNC96-孔培養(yǎng)皿(供應(yīng)商LifeTechnologies)中，使其附著在塑料板上過夜。接種密度為每孔1500個細(xì)胞，介質(zhì)總體積為200|ul。在細(xì)胞粘到所述的板以后，介質(zhì),皮改變，加入藥物和/或溶劑得到最終體積200iLi1。然后培養(yǎng)四天，用200iul新鮮介質(zhì)替代介質(zhì)，用基于MTT的試驗評價細(xì)胞密度和活力。向每個孔中加入25|ul的MTT溶液，在37。C進(jìn)一步培養(yǎng)所述細(xì)胞2小時。然后小心地吸出所述介質(zhì)，加入25iul甘氨酸緩沖液，然后加入100iul的DMSO將藍(lán)色MTI-曱臘(formazan)產(chǎn)物溶解。在微板振蕩器上振動微量培養(yǎng)板10分鐘，用Emax96-孔分光光度計(供應(yīng)商Sopachem)在540nm測定吸光度。在一個試驗中，每次試驗條件的結(jié)果為3個平行測定孔的平均值。出于最初的篩選目的，化合物在單一固定的10—SM濃度測試。對于活性化合物，重復(fù)實驗以建立完整的濃度-響應(yīng)曲線。對于每個試驗，對照樣(不含藥物)和空白樣(不含細(xì)胞或藥物)的培養(yǎng)平行進(jìn)行。從所有的對照和樣本數(shù)值減去空白試驗值。對于每個樣本，細(xì)胞生長的平均值(以吸收度單位)表示為對照樣細(xì)胞生長平均值的百分比。如果合適，。IC5o-值(將代謝產(chǎn)物的量降低至對照的50%所需的藥物的濃度)用對已分級數(shù)據(jù)的概率分析計算(Finney,DJ.,ProbitAnalyses,2ndEd.Chapter10,GradedResponses,CambridgeUniversityPress,Cambridge1962)。在此，測試化合物的作用表示為pIC50(IC5o-值的負(fù)對數(shù)值)(參見表F-2)。實施例C.3:溶解度/穩(wěn)定性C.3.a.在含水介質(zhì)中的動態(tài)溶解度在第一稀釋步驟中，將溶解在DMSO(5mM)中的活性化合物濃縮儲備溶液10|ul加入到pH7.4的100fil磷酸鹽4寧檬酸鹽緩沖液中并混合。在第二稀釋步驟中，第一稀釋步驟的等分樣品(20pl)進(jìn)一步溶于100pi的pH7.4的磷酸鹽檸檬酸鹽緩沖液中并混合。最后，在第三稀釋步驟中，第二稀釋步驟的樣品(20)iil)進(jìn)一步在pH7.4的100iul磷酸鹽檸檬酸鹽緩沖液中稀釋并混合。所有稀釋在96孔板中進(jìn)行。在最后的稀釋步驟后立即用濁度計測定所述三個連續(xù)稀釋步驟的濁度。對于每種化合物進(jìn)行一式三份的稀釋以免偶然誤差。基于所述濁度測定進(jìn)行三級分類排序。具有高溶解度的化合物得3分，對于這類化合物的第一次稀釋物為澄清的。具有中等溶解度的化合物得2分。對于這類化合物的第一次稀釋物不澄清，第二次稀釋物為澄清的。具有低溶解度的化合物得l分，對于這些化合物第一次和第二次得稀釋物不澄清(見表F-2)。C.3.b.在含水介質(zhì)中的動態(tài)溶解度5000-9.8jiM(1/2稀釋)的DMSO-儲備溶液是在96孔儲備溶液板(每孔200pl)中在DMSO中制備的。每次稀釋后將樣品混合。然后將等份的此DMSO溶液(2iul)轉(zhuǎn)移到2個另外的96孔緩沖溶液板中，該板每孔含有200fil緩沖溶液。每一緩沖溶液板既含有pH7.4的含水緩沖溶液又含有pH4.0的含水緩沖溶液。在最后稀釋之后，將緩沖溶液板混合，并使樣品在室溫下穩(wěn)定1/2小時。對于每種化合物進(jìn)行一式二份的稀釋以免偶然誤差。然后在BDGentest溶解度掃描儀上對形成的沉淀物掃描?；谠摶旌衔镏胁淮嬖?存在沉淀物，通過插值計算動態(tài)溶解度。分級成3級。具有高溶解度的化合物得3分并具有高于或等于50的溶解度。具有中等溶解度的化合物得2分并具有高于20|aM且低于50pM的溶解度。具有低溶解度的化合物得1分，對于這些化合物溶解度低于或等于10^iM(參見表F-2)。C.3.c.在不同pH下，化合物的溶解度還可以使用化學(xué)發(fā)光的氮氣檢測測定(參見表F-2)。實施例C.4:平4亍人工膜滲透性分析將儲備液樣品(10]ul的5mM儲備液的等分樣品在100%DMSo中)稀釋于含有2ml的pH4或pH7.4的含水緩沖系統(tǒng)(PSR4系統(tǒng)溶液濃縮物(pION)的深孔板或預(yù)混合板中。在樣品加入到所述參比板前，將150|ul的緩沖液加入到孔中，測定空白樣的UV。此后，棄去所述H沖液，該板用作參比板。所有測定在抗UV-板(供應(yīng)商Costar或Greiner)中進(jìn)行。在參比板的空白測定之后，將150|ul的稀釋樣品加到該參比板，將稀釋的樣品200|ul加入到供體板1。將受體濾板1(供應(yīng)商Millipore,型號MAIPN45)用4)ul人工膜形成溶液(1,2-二油?；?sn-Glycer-3-磷酸膽堿在十二烷中，含0.1%2,6-二叔丁基-4-甲酚)涂敷，置于供體板1的上部形成"夾心"。將緩沖液(200pi)分配到上方的受體孔中。夾心用蓋板覆蓋，在室溫下在暗處儲藏18小時。受體板2的空白測定是通過在孔中加入150的緩沖液然后進(jìn)行UV測定進(jìn)行的。在受體板2空白測定之后，棄去緩沖液，將150]iil的受體溶液從受體濾板1轉(zhuǎn)移到受體板2。然后除去受體濾板1形成夾心。在供體板2的空白測定之后(參見上文)，將150|Lil的供體溶液從供體板1轉(zhuǎn)移到供體板2。掃描(使用SpectraMAX190)供體板2、受體板2和參比板孔的紫外光譜。用PSR4pCommand軟件處理所有光譜以計算滲透性。所有化合物計算三次。在每次試驗中使用卡馬西平、灰黃霉素、阿昔洛韋、阿替洛爾、呋塞米和氯噻。秦作為標(biāo)準(zhǔn)?；衔锓譃?個等級的類別，即，具有低滲透率(平均效果〈0.5x10—6cm/s;分?jǐn)?shù)1)、中滲透率(lxl0-6cm/s〉平均效果^0.5xl0-6cm/s;分?jǐn)?shù)2)或高滲透率($1xl(r6cm/s;分?jǐn)?shù)3)。實施例C.5:代謝穩(wěn)定性實施例C.5.a.根據(jù)Gorrod等人(Xenobiotica5:453-462，1975)在機械均化組織之后通過離心分離制備亞細(xì)胞組織制劑。肝臟組織在水冷的0.1MTris-HCl(pH7.4)緩沖液中漂洗以洗滌過量的血液。然后吸干組織、稱重和用手術(shù)剪粗粗地切^淬。組織碎片用裝配了Teflon扦的Potter-S(Braun,意大利)或者SorvallOmni-混合勻漿器在3體積水冷的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中均化7xl0秒。在兩種情況下，容器在所述均化步驟期間#皮保存在冰上/冰內(nèi)。在4。C下將組織勻漿用Sorvall離心機或Beckman超離心機以9000xg離心20分鐘。得到的上層清液在-8(TC儲藏并標(biāo)記為'S9'。S9級分可以用Beckman超離心機以100.000xg進(jìn)一步離心60分鐘(4°C)。得到的上層清液^皮小心地吸出，等分并標(biāo)記為'細(xì)胞溶質(zhì)'。將所述顆粒(pellet)重新懸浮在O.IM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中，每0.5g原始組織重量最終體積為lml,標(biāo)記為嗜i粒體'。所有亞細(xì)胞部分一皮等分試樣，立即在液氮中水凍，在-8(TC-賭藏直到使用。對于要測試的樣品，培養(yǎng)混合物含有PBS(0.1M)、化合物(5|uM)、微粒體(1mg/ml)和NADPH-生成系統(tǒng)(0.8mM葡萄糖-6-磷酸、0.8mM氯化鎂和0.8單位葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)。對照樣品含相同物質(zhì)，但是所述微粒體被加熱失活(在95攝氏度下IO分鐘)的微粒體替代。在對照樣品中化合物的回收率的總是100%。將混合物在37攝氏度預(yù)培養(yǎng)5分鐘。反應(yīng)在0時間點(t=0)通過添加0.8mMNADP啟動，樣品培養(yǎng)15分鐘(t=15)。通過加入2體積的DMSO終止反應(yīng)。然后樣品以900xg離心IO分鐘，在分析前，上層清液在室溫下儲藏不超過24小時。所有培養(yǎng)^皮在duplo中進(jìn)行。上層清液的分析用LC-MS分析儀進(jìn)行。樣品的洗脫在XterraMSC18(50x4.6mm,5|um,Waters,US)上進(jìn)行。使用Alliance2790(供應(yīng)商Waters,US)HPLC系統(tǒng)。用緩沖液A(在H20/乙腈(95/5)中25mM的乙酸銨(pH5.2))、溶劑B乙腈和溶劑C甲醇以2.4毫升/分鐘的流速洗脫。使用的梯度是以線性方式在5分鐘內(nèi)有機相濃度從0%提高至50%B和50%C,在1分鐘內(nèi)提高到100%B,有機相濃度再保持穩(wěn)定1.5分鐘。樣品的總注射體積是25pl。4吏用酉己備了ESI源的Quattro(供應(yīng)商Micromass,Manchester,UK)三重四極質(zhì)譜4義作為纟全測器。所述源和脫溶劑溫度分別設(shè)定在120200780003016.6和350。C,用氮氣作為霧化劑和干燥氣體。以正掃描方式(單一離子反應(yīng))方式獲取數(shù)據(jù)。錐體電壓設(shè)定在10V，停留時間l秒。代謝穩(wěn)定性可以表示為在活性微粒體(E(活性的))存在下培養(yǎng)15分鐘之后的化合物％代謝t=15時，E(活性的)的總離子電流(TIC)(%代謝=100%-(-)x100)。t=0時，E(活性的)的TIC具有t=0時E(活性的)的TIC百分代謝小于20%的化合物定義為高代謝穩(wěn)定的。具有20-70%代謝的化合物定義為中等穩(wěn)定的，顯示百分代謝高于70%的化合物定義為低代謝穩(wěn)定的。當(dāng)進(jìn)行代謝穩(wěn)定性篩選時，總是包括三個參比化合物。維拉帕米作為具有低代謝穩(wěn)定性(％代謝=73%)的化合物被包括在內(nèi)。西沙比利作為中等代謝穩(wěn)定性(％代謝=45%)的化合物被包括在內(nèi)，丙醇作為中等至高代謝穩(wěn)定性(25%代謝)的化合物被包括在內(nèi)。這些參比化合物用來確認(rèn)所述的代謝穩(wěn)定性試驗。試驗了八個化合物，其中的3個為高代謝穩(wěn)定的，3個顯示中等代謝穩(wěn)定性，2個化合物為低代謝穩(wěn)定性。C.5.b:用大鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)物測定代謝穩(wěn)定性從雄性SpragueDowley大鼠分離大鼠肝細(xì)胞?；衔锶苡?00%DMSO中形成5mM儲備溶液，在jliM的最后濃度和大鼠肝細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)物(0.5百萬活細(xì)胞/0.5ml)用24孔板培養(yǎng)0、15、30、60和120分鐘。通過添加2體積的DMSO制備用于LC-MS的樣品。將所述樣品充分振動，隨后以900g離心IO分鐘(室溫)。所有試-險進(jìn)行一式三卞分。得到的上層清液50用LC-MS分析。對于LC隱MS,在HypersilBDSC18柱(50x4.6mm,5|um,Thermohypersil,UK)上進(jìn)行樣品的洗脫。HPLC系統(tǒng)包括Surveyor輸送系統(tǒng)(SurveyorInc.,SanJose,US),裝備了Surveyor自動取樣器裝置。使用緩沖液A(在H20/乙腈(95:5)中的10mM乙酸4妄(pH6.9))和溶劑B(乙腈)以1.2ml/min的流速洗脫。使用的梯度為開始條件下0.5mm溶劑A,然后以線性方式提高有機相濃度，用2分鐘從0%B提高到95%B。該相再保持穩(wěn)定2min,然后在0.5min內(nèi)再次降低到0%B。樣品的總注射體積為50iliL。柱加熱爐的溫度保持在40°C。分離LC流用于MS檢測，O.lml進(jìn)入所述源。配備了ESI源的三重四極質(zhì)譜儀TSQQuantum(Thermofinnigan,LaJolla,USA)質(zhì)鐠儀用于才全測。源電壓設(shè)定在3800伏，毛細(xì)管溫度在300。C。為了定量評價，質(zhì)i普儀以陽離子模式在調(diào)節(jié)到M+H質(zhì)量的SIM中操作，掃描寬度1Da。儀器控制、數(shù)據(jù)收錄和處理用Xcalibur軟件(ThermOFinnigan，San.lose,CA,U.S.A)進(jìn)行。在大鼠肝細(xì)胞中化合物的代謝穩(wěn)定性可以以體外半衰期來表示。實施例C.6:p21i秀導(dǎo)性能實施例C.6.a:p21酶聯(lián)免疫吸附試-驗用以下方法在人A2780卵巢癌細(xì)胞中確定p21蛋白質(zhì)表達(dá)水平。將A2780細(xì)胞(20000細(xì)胞/180|ul)接種到96孩i孔滴定板的RPMI1640介質(zhì)中，所述的RPMI1640介質(zhì)補充了2mML-谷氨酸鹽、50]ug/ml慶大霉素和10%胎牛血清。在細(xì)胞溶胞前24小時，以IO-5、l(T6、10-7和10-8M的最后濃度加入化合物。將所有一皮測試的化合物溶于DMSO,用培養(yǎng)液進(jìn)一步稀釋。在加入化合物后24小時，從細(xì)胞上去掉上層清液。細(xì)胞用200|al水冷的PBS洗滌。吸清所述孔，加入30的溶胞緩沖液(50mM的Tris.HCl(pH7.6)、150mM的NaCl、1%的Nonidetp40和10%的甘油)。所述板在-70。C培養(yǎng)過夜。將適合數(shù)量的微滴定孔從金屬箔包裝中取出，置入空孔固定器中。制備洗滌緩沖液(20x分析板洗滌濃縮液100mlPBS和表面活性劑的20倍濃溶液。含2%的氯乙酰胺)的工作溶液(lx)。冷凍干燥的p21WAF標(biāo)準(zhǔn)物用蒸餾水復(fù)原，用樣品稀釋劑(在所述試劑盒中提供)進(jìn)一步稀釋。通過在樣品稀釋劑中以1:4的比例稀釋制備樣品。樣品(100和p21WAFI標(biāo)準(zhǔn)物(100|Lil)用移液管移入合適的孔并在室溫下培養(yǎng)2小時。用lx洗滌緩沖液洗滌所述孔3次，然后將100pl的檢-驗抗體試劑(生物素化的單克隆p21WAF1抗體的溶液)用移液管移入每個孔。將所述孔在室溫下培養(yǎng)1小時，然后用lx洗滌緩沖液洗滌3次。稀釋400x共軛物(過氧化物酶抗生物素共軛物400倍濃溶液)，再將100|ul的lx溶液加入到所述孔。所述孔在室溫下培養(yǎng)30分鐘，然后用lx洗滌緩沖液洗滌3次，用蒸餾水洗滌1次。底物溶液(顯色底物)(100pi)加入到所述孔中，在室溫下在黑暗中培養(yǎng)所述孔30分鐘。按早先加入底物溶液的相同的順序?qū)⑼Ｖ谷芤杭尤氲矫總€孔。用分光光度計板計數(shù)器在450/595nm雙波長測定每個孔的吸光度。對于每個試^驗，對照樣(不含藥物)和空白樣(不含細(xì)胞或藥物)的培養(yǎng)平行運行。從所有的對照和樣本數(shù)值扣除空白試-驗值。對于每一樣品，p21WAF1誘導(dǎo)作用(以吸光度為單位)可以表示為對照樣p21WAF1值的百分比。誘導(dǎo)百分比高于130%定義為具有顯著誘導(dǎo)作用。測試三個化合物，均顯示出顯著的誘導(dǎo)作用。實施例C.6.b.細(xì)月包方法在37。C下在5%C02的濕潤培養(yǎng)箱中，將A2780細(xì)胞(ATCC)在RPMI1640介質(zhì)中培養(yǎng)，所述RPMI1640介質(zhì)補充了10%FCS、2mM的L-谷氨酸鹽和慶大霉素。所有細(xì)力包培養(yǎng)溶液由Gibco-BRL(Gaithersburg,MD)提供。其它材料由Nunc提供。從增殖的A2780細(xì)胞提取基因組DNA,用作p21啟動子的巢床PCR分離的模板。第一次擴(kuò)增用低聚核苷酸對GAGGGCGCGGTGCTTGG和TGCCGCCGCTCTCTCACC,以基因組DNA為模板，在55。C韋刃化溫度(annealingtemperature)進(jìn)行20個周期。得到的4.5kb片段包含相對于TATA盒的-4551至+88的片段，該片段用低聚核苷酸TCGGGTACCGAGGGCGCGGTGCTTGG和ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC在88。C韌化溫度再擴(kuò)增20個周期，得到4.5kb片段，隨后用低聚核苷酸對TCGGGTACCGGTAGATGGGAGCGGATAGACACATC和ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC在88。C韌化溫度擴(kuò)增20個周期，得到包含相對于TATA盒的-1300至+88片段的1.3kb片段。存在于低聚核苦酸(加下劃線的序列)中的限制酶切位點Xhol和Kpnl用于亞克隆。從pGL3-basic去掉熒光素酶指針，在Kpnl和Xbal限制酶切位點用ZsGreen指針(來自pZsGreen1—Nl質(zhì)粒)替代。通過將上述人p21啟動子區(qū)域的1.3kb片段在Xhol和Kpnl位點插入pGL3-basic-ZsGreenp構(gòu)成GL3-basic-ZsGreen-1300。所有限制性內(nèi)切酶由BoehringerManheim(德國)提供。將A2780細(xì)胞以2x105細(xì)胞的密度涂敷在6孔板中，培養(yǎng)24小時，通過4吏用Lipofectamine2000(Invitrogen,Brussels,比利時)如制造商所述用2|ug的pGL3-basic-ZsGreen-1300和0.2)ug的pSV2neo介體轉(zhuǎn)染。用G418(Gibco-BRL,Gaithersburg,MD)選擇所述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞10天，取單細(xì)胞懸浮液生長。3周后，得到單克隆。擴(kuò)增A2780選擇的克隆，以每孔10000細(xì)胞接種在96孔板中。接種24小時后，用化合物再處理細(xì)胞24小時(影響鄰近p21啟動子區(qū)域的spl位點)。隨后，用4%PFA固定細(xì)胞30秒，用Hoechst染料染色。p21啟動子活化導(dǎo)致ZsGreen產(chǎn)生，并因此發(fā)焚光，通過AscentFluoroskan(ThermoLabsystems,Brussels,比利時)4企測。對于每個試驗，對照樣(不含藥物)和空白樣(不含細(xì)胞或藥物)的培養(yǎng)平行運行。從所有的對照和樣本數(shù)值扣除空白試驗值。對于每個樣品，p21誘導(dǎo)值可以表示為對照樣p21值的百分比。誘導(dǎo)百分比高于130%的定義為顯著誘導(dǎo)。試驗了10個化合物，并且顯示出顯著誘導(dǎo)。實施例C.6.c.:體內(nèi)方法將選擇的克隆皮下注入(107細(xì)胞/200pi)棵鼠的側(cè)腹，12天后得到可用卡尺測量到的腫瘤。從第12天起，在6天內(nèi)對動物經(jīng)口或經(jīng)靜脈每天施用溶劑和20-40mpk化合物(每組4-10只動物)。通過自制的自動整體成像系統(tǒng)(OlympusSZX12熒光立體顯微鏡，裝備了GFP濾片，并與JAICV-M90型CCD照相才幾組合，用基于來自NationalInstmments⑧的IMAQVision軟件的軟件包控制)以熒光評Y介肺瘤。測試了化合物6的C6c,并且可與R306465相比較。實施例C.7:P450抑制性能將所有一皮測試的化合物溶于DMSO(5mM),在乙腈中進(jìn)一步稀釋到5xl0"M。在試驗緩沖液中制備進(jìn)一步的稀釋物(0.1MNaK磷酸鹽緩沖液pH7.4),最終的溶劑濃度不高于2%。對CYP3A4蛋白質(zhì)的分析包括每孔15pmolP450/mg蛋白質(zhì)(在0.01MNaK磷酸鹽緩沖液+1.15。/oKCl中)、NADPH發(fā)生系統(tǒng)(3.3mM葡萄糖-6-磷酸、0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脫氬酶、1.3mMNADP和3.3mMMgCl2'6H2〇，在分析緩沖液中)和化合物，總分析體積為100|ul。在37°C預(yù)培養(yǎng)5分鐘后，加入在分析緩沖液中150pM的熒光探針底物BFC啟動酶促反應(yīng)。在室溫下培養(yǎng)30分鐘后，加入2體積乙腈終止反應(yīng)。在405nm激發(fā)波長和535nm發(fā)射波長處進(jìn)行萸光測定。包括酮康唑(IC50-值3X10-8M)作為該試驗的參比化合物。對CYP2D6蛋白質(zhì)的分析包括每孔6pmo1P450/mg蛋白質(zhì)(在0.01MNaK磷酸鹽緩沖液+1.15%KC1中)、NADPH發(fā)生系統(tǒng)(0.41mM葡萄糖-6-磷酸、0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脫氪酶、0.0082mMNADP和0.41mMMgCl2-6H20，在分析緩沖液中)和化合物，總分析體積100^1。在37。C預(yù)培養(yǎng)5分鐘后，加入在分析緩沖液中的3pM的熒光探針底物AMMC啟動酶促反應(yīng)。在室溫下培養(yǎng)45分鐘后，加入2體積乙腈終止反應(yīng)。在405nm激發(fā)波長和460nm發(fā)射波長處進(jìn)行熒光測定。包括奎尼丁(IC5o-值〈5X1(T8M)作為該試驗的參比化合物。對CYP2C9蛋白質(zhì)的分析包括每孔15pmolP450/mg蛋白質(zhì)(在0.01MNaK磷酸鹽緩沖液+1.15。/oKCl中)、NADPH發(fā)生系統(tǒng)(3.3mM葡萄糖誦6畫磷酸、0.4U/ml葡萄糖-6國磷酸脫氳酶、1.3mMNADP和3.3mMMgCl2'6H20,在分析緩沖液中)和化合物，總分析體積100|Lil。在37°C預(yù)培養(yǎng)5分鐘后，加入在分析緩沖液中200|uM的熒光探針底物MFC啟動酶促反應(yīng)。在室溫下培養(yǎng)30分鐘后，加入2體積乙腈終止反應(yīng)。在405nm激發(fā)波長和535nm發(fā)射波長處進(jìn)行熒光測定。包括磺胺苯吡唑(IC5。-值二6.8X1(T7M)作為該試'驗的參比化合物。為了初步篩選的目的，化合物在單一固定的濃度的lxlO^M測試。對于活性化合物，重復(fù)試驗建立完整的濃度-響應(yīng)曲線。對于每個試驗，對照樣(不含藥物)和空白培養(yǎng)(不含酶或藥物)平行運行。所有化合物一式四份分析。從所有的對照和樣本數(shù)值減去空白試^r值。對于每個樣本，樣品的P450活性平均值(以相對熒光度為單位)表示為對照樣P450活性平均值的百分比。抑制百分比可以表示為100yo減去樣品P450活性平均值。如果合適，計算IC,值(將P450活性降低到對照樣的50%所需的藥物的濃度)。表F-2:列出了根據(jù)實施例C.l、C.2、C.3.a、C.3.b和C.3.c測試的<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>D.組合物實施例包膜衣的片劑片芯的制備100g式(I)化合物、570g乳糖和200g淀粉的混合物充分混合，然后用5g十二烷基硫酸鹽鈉和10g聚乙烯基吡咯烷酮在約200ml水中的溶液濕潤。將濕粉末混合物過篩，干燥，然后再次過篩。然后加入100g微晶纖維素和15g氬化植物油。全部混合均勻，壓成片劑，得到10000片，每片含10mg的式(I)化合物。包衣向10g曱基纖維素在75ml變性乙醇中的溶液加入5g乙基纖維素在150ml二氯曱烷中的溶液。然后加入75ml的二氯曱烷和2.5ml1,2，3-丙二醇。熔融10g的聚乙二醇，溶于75ml二氯甲烷。將后一溶液加入前者，然后加入2.5g十八酸鎂、5g聚乙烯吡咯烷酮和30ml濃染料懸浮液，全部材料勻漿。用這樣得到的混合物在包衣設(shè)備中將片芯包衣。權(quán)利要求1.式(I)化合物及其N-氧化物形式、藥學(xué)可接受的加成鹽和立體化學(xué)異構(gòu)形式其中n是0或1，并且當(dāng)n是0時，表示直接鍵；p是0或1，條件是當(dāng)p是0時n是0，-(CH2)n-(NR3)p-是直接鍵并且Y是N；各X獨立地是N或CH；各Y獨立地是O、N、NH、CH或CH2，并且當(dāng)Y是N或CH時所述的取代基連接到所述環(huán)結(jié)構(gòu)的所述Y原子；R1是羥基或式(a-1)的基團(tuán)其中R4是羥基或-NH2；R5是氫、噻吩基、呋喃基或苯基，并且各噻吩基、呋喃基或苯基可任選被以下基團(tuán)取代鹵代、氨基、硝基、氰基、羥基、苯基、C1-6烷基、(二C1-6烷基)氨基、C1-6烷基氧基、苯基C1-6烷基氧基、羥基C1-6烷基、C1-6烷基氧基羰基、羥基羰基、C1-6烷基羰基、多鹵代C1-6烷基氧基、多鹵代C1-6烷基、C1-6烷基磺?；?、羥基羰基C1-6烷基、C1-6烷基羰基氨基、氨基磺酰基、氨基磺?；鵆1-6烷基、異噁唑基、氨基羰基、苯基C2-6烯基、苯基C3-6炔基或吡啶基C3-6炔基；R6、R7和R8各自獨立地是氫、-NH2、硝基、呋喃基、鹵代、C1-6烷基、C1-6烷基氧基、三氟甲基、噻吩基、苯基、C1-6烷基羰基氨基、氨基羰基C1-6烷基或-C≡C-CH2-R9；其中R9是氫、C1-6烷基、羥基、氨基或C1-6烷基氧基；R2是CH2OH、CH2CH(OH)-CH2OH、CH2OCH3或CH2OCH2CH3；R3是氫、C1-6烷基、C3-7環(huán)烷基、C1-6烷基羰基或C1-6烷基磺?；?；和Z是下式的基團(tuán)其中R10是氫、C1-6烷基、C3-7環(huán)烷基或苯基磺酰基；和R11是氫、羥基、氨基、鹵代、C1-6烷基、多鹵代C1-6烷基、C1-6烷基羰基、氰基、羥基羰基、C1-6烷基羰基氨基、C1-6烷氧基或者單-或二(C1-6烷基)氨基。2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中各X是N;各Y是N或CH;R1是羥基；R2是CH2OH或CH2CH(OH)-CH2OH,R3是氫或d-6烷基；R1Q是氬或苯基磺酰基；和R11是氬。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的化合物，其中各X是N;各Y是N;W是羥基；R是CH20H;W是氫；A是式(b-3)或(b-6)的基團(tuán)；和R"是氫。4.根據(jù)權(quán)利要求l、2或3的化合物，其中所述化合物是下式化合物No.l和化合物No.2:<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>5.—種藥物組合物，包括藥學(xué)可接受的載體和作為活性成分的治療有效量的權(quán)利要求1~4所述的化合物。6.制備權(quán)利要求5所述藥物組合物的方法，其中所述的藥學(xué)可接受的載體與權(quán)利要求1~4所述的化合物被緊密地混合。7.用作藥物的權(quán)利要求1-4任一項所述的化合物。8.權(quán)利要求14任一項所述的化合物在制備治療增殖疾病的藥物中的用途。9.抗癌劑和權(quán)利要求1~4任一項所述HDAC抑制劑的組合物。10.制備權(quán)利要求1所述化合物的方法，其特征在于，a)將式(II)中間體與適宜的酸反應(yīng)得到式(I)異羥肟酸，其中W是羥基，在此稱為式(I-a)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(I-a)b)將其中的M表示氫或鈉或鋰或堿金屬陽離子的式(III)中間體與式(XIV)中間體在適宜試劑存在下在適合的溶劑中反應(yīng)，形式(I)化合物，其中W是式(a-1)的基團(tuán)且W是-NH2，在此稱為式(I-b)化合物,<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>C)將式(IV)中間體與適宜的酸在適合的溶劑中反應(yīng)，形式式化合物，或者<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>d)將式(V)中間體，其中TBDMS表示叔丁基(二曱基)曱硅烷基，與氟化四丁基銨在適合的溶劑中反應(yīng)，形成式(I)化合物，其中W是式(a-l)的基團(tuán)且R"是羥基，在此稱為式(I-c)化合物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>11.式(A)化合物，其中Q是d.2烷氧基羰基、羥基羰基或四氬p比喃基氧基氨基羰基，并且n、p、X、Y、Z、112和113如式(I)所定義,以及其N-氧化物形式、藥學(xué)可接受的加成鹽和立體化學(xué)異構(gòu)形式。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>12.制備權(quán)利要求11所述化合物的方法，其特征在于，a)將式(VI)中間體與與中間體(VII)反應(yīng)，形成其中的Q是四氳吡喃基氧基氨基羰基的由式(II)表示的式(A)化合物，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>b)將式(VIII)中間體以單個的步驟與1,4-二嗜烷-2,5-二醇和適宜的式(IX)的硼酸反應(yīng)，形成式(II)化合物，其中R是-CH20H并且n和p均為0以及Y是N,在此稱為式(II-a)化合物，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>c)將式(VIII)中間體以單個的步驟與式(XI)中間體和適宜的式(IX)的硼酸反應(yīng)，形成式(II)化合物，其中RS是-CH20H-CH20H并且n和p均為0以及Y是N,在此稱為式(II-b)化合物，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>d)將式(XVII)中間體與適宜的酸或堿溶液反應(yīng)，形成其中的Q是羥基羰基的由式(VI)表示的式(A)化合物，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>e)將式(XII)中間體以單個的步驟與1,4-二嗜烷-2,5-二醇和適宜的式(IX)的硼酸反應(yīng)，形成式(A)化合物，其中Q是d-2烷氧基羰基，RS是-CH20H并且n和p均為0以及Y是N,在此稱為式(XVII-a)化合物，或者<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>(XVII-a)f)將式(XII)中間體以單個的步驟與式(XI)中間體和適宜的式(IX)的硼酸反應(yīng)，形成式(A)化合物，其中Q是d-2烷氧基羰基，R2是-CH20H-CH20H并且n和p均為0以及Y是N,在此稱為式(XVII-b)化合物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>(XVII-b)全文摘要本發(fā)明包括具有組蛋白脫乙?；敢种泼富钚缘男碌氖?I)化合物，其中R¹、R²、R³、X、Y和Z具有所定義的含義；它們制備、含有它們的組合物以及它們作為藥物的用途。文檔編號C07D405/12GK101370791SQ200780003016公開日2009年2月18日申請日期2007年1月16日優(yōu)先權(quán)日2006年1月19日發(fā)明者B·魯克斯,L·F·B·馬康尼特-德克拉恩,P·R·安吉鮑德,S·F·A·范布蘭德特申請人:詹森藥業(yè)有限公司