專利名稱：友菌素的生物合成基因簇及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及抗生素友菌素(amicetin)的生物合成基因簇的克隆、分析、功能研究及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
友菌素是一類二糖核苷類抗生素，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示，其能有效抑制革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌、結(jié)核桿菌，對(duì)雞球蟲病和肺結(jié)核病有一定的療效，并有抗病毒功能(如 1 型皰疹病毒 herpesvirus 和脊髓灰質(zhì)炎病毒 poliovirus 等)[Med. Res. Rev. (1984)4 471-512]。友菌素主要由Str印tomyces和AethrcAater產(chǎn)生，其主要結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是以胞嘧啶為基本骨架，通過一位氮連接兩個(gè)脫氧己糖amicetose和amosamine，通過四位氮耦合了一個(gè)分子的對(duì)氨基苯甲酸和一個(gè)分子的α-甲基絲氨酸。友菌素的主要抗菌作用機(jī)制是通過結(jié)合到宿主23S核糖體RNA的一個(gè)非常保守的“肽酰轉(zhuǎn)移酶中心”區(qū)域，從而阻斷宿主的蛋白質(zhì)合成[Embo J. (1994) 13:1682-1686]。采用同樣機(jī)制的抗生素還包括氯霉素，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素和其他核苷類抗生素，如滅瘟素(blasticidin S)，谷氏菌素(gougerotin)， 抗螺霉素(anthelmycin)以及嘌呤霉素(puromycin)等[Med. Res. Rev. (1984)4 :471-512 ； Russ. Chem. Rev. (2004)73 :401-414]，其中友菌素對(duì)古細(xì)菌，細(xì)菌和真核生物的蛋白質(zhì)合成都有抑制作用，被稱為“通用”抗生素[EmboJ. (1994) 13:1682-1686]。
核苷類抗生素由于獨(dú)特的活性而得到了人們的關(guān)注，尤其近二十年來生物技術(shù)的發(fā)展為了解核苷類抗生素的生物合成機(jī)制提供了新的平臺(tái)和機(jī)遇[中國抗生素雜志.0009)34:1^-141]，越來越多的核苷類抗生素的生物合成基因簇被克隆和鑒定， 包括尼克霉素(nikkomycin) [Mol. Gen. Genet. (1999)262 :102-114 ；Mol. Gen. Genet. (2001)264 :662-673 ；Mol. Microbiol. (2005)55 1855-1866],多氧霉素(polyoxin) [J. Biol. Chem. (2009)284 :10627-10638],嘌呤霉素(puromycin)[Embo J. (1992) 11 785-792 ；J. Biol. Chem. (1996)271 :1579-1590],殺稻癌菌素 S (blasticidin S) [Chembiochem. (2003) 4 :821-828], streptothricins[J.Bacteriol. (1997) 179 6929-6936], toyocamycin[Chem. Biol. (2008) 15 :790-798], A-500359s[J.Antibiot.(2009)62 :325-332]， caprazamycin[J. Biol. Chem. (2009) 284 :14987-14996]， lipisidomycin[Chembiochem. (2010) 11(2) :191-196]及其類似物 A-90289 [Chembiochem.(2010)11(2) :184-190],其中國內(nèi)的科學(xué)家系統(tǒng)研究了尼克霉素和多氧霉素的生物合成， 同時(shí)國內(nèi)科學(xué)家也克隆和鑒定了米多霉素的兩個(gè)生物合成酶[Chembiochem. (2008)9 1286-U94]。核苷類抗生素友菌素具有獨(dú)特的二糖鏈，尤其是amosamine以獨(dú)特的保留型糖苷鍵與amicetose相連，這種保留型的糖苷鍵在微生物天然產(chǎn)物中并不多見。因此，克隆和鑒定友菌素的生物合成基因簇，對(duì)于了解二糖鏈的形成機(jī)制，以及末端氨基酸 (α-methylserine)的合成及其構(gòu)效關(guān)系，都顯得非常必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種友菌素的生物合成基因簇。
本發(fā)明的友菌素的生物合成基因簇，其特征在于，該友菌素的生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，由其中的從7917位到34889位的堿基序列組成。
本發(fā)明的友菌素的生物合成基因簇，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第7917位到 34889位的堿基序列所示，包含21個(gè)基因，其中8個(gè)脫氧糖合成酶基因(amiB，amiC, amiD, amiE,amiH,amiK,amiN,amiU)和2個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因(amiJ，amiG)編碼的蛋白負(fù)責(zé)友菌素兩個(gè)脫氧糖基的生物合成，3個(gè)基因(amiA，amiM，amiL)編碼的蛋白負(fù)責(zé)對(duì)氨基苯甲酸的生物合成，1個(gè)基因(amil)編碼的蛋白負(fù)責(zé)胞嘧啶的生物合成，1個(gè)基因(amiF)編碼的蛋白負(fù)責(zé)胞嘧啶脫氧核苷與對(duì)氨基苯甲酸輔酶A之間的縮合反應(yīng)，3個(gè)基因(amiT，amiR, amiS) 編碼的蛋白負(fù)責(zé)末端氨基酸的生物合成，此外，還包括1個(gè)調(diào)控基因(amiP)，2個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)基因 (amiO, amiQ),具體為
1)脫氧糖合成基因，即 amiB，amiC, amiD, amiE, amiH, amiK, amiN, amiU 共 8 個(gè)基因
amiB位于基因簇核苷酸序列第9160-10278個(gè)堿基處，長度為1119個(gè)堿基對(duì)，編碼氨基轉(zhuǎn)移酶，372個(gè)氨基酸；
amiC位于基因簇核苷酸序列第10275-11651個(gè)堿基處，長度為1377個(gè)堿基對(duì)，編碼NDP-己糖-2，3-脫水酶，458個(gè)氨基酸；
amiD位于基因簇核苷酸序列第11648-U616個(gè)堿基處，長度為969個(gè)堿基對(duì)，編碼 NDP-己糖-3-酮還原酶，322個(gè)氨基酸；
amiE位于基因簇核苷酸序列第12778-13551個(gè)堿基處，長度為774個(gè)堿基對(duì)，編碼葡萄糖-1-磷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶，257個(gè)氨基酸；
amiH位于基因簇核苷酸序列第16530-17279個(gè)堿基處，長度為750個(gè)堿基對(duì)，編碼甲基轉(zhuǎn)移酶，249個(gè)氨基酸；
amiK位于基因簇核苷酸序列第19048-19995個(gè)堿基處，長度為948個(gè)堿基對(duì)，編碼 NDP-己糖-4-酮還原酶，315個(gè)氨基酸；
amiN位于基因簇核苷酸序列第23609-249 個(gè)堿基處，長度為1320個(gè)堿基對(duì)，編碼⑶P-4-酮-6-脫氧葡萄糖-3-脫水酶，439個(gè)氨基酸；
amiU位于基因簇核苷酸序列第33825-34889個(gè)堿基處，長度為1065個(gè)堿基對(duì)，編碼dTDP-葡萄糖-4，6-脫水酶，354個(gè)氨基酸；
2)糖基轉(zhuǎn)移酶基因，即amiJ，amiG共兩個(gè)基因
ami J位于基因簇核苷酸序列第17821-19032個(gè)堿基處，長度為1212個(gè)堿基對(duì)，編碼胞嘧啶葡萄糖酸合成酶/糖基轉(zhuǎn)移酶，403個(gè)氨基酸；
amiG位于基因簇核苷酸序列第15035-16522個(gè)堿基處，長度為1488個(gè)堿基對(duì)，編碼糖基轉(zhuǎn)移酶，495個(gè)氨基酸；
3)對(duì)氨基苯甲酸合成基因，即amiA，amiM, amiL共三個(gè)基因
amiA位于基因簇核苷酸序列第7917-8711個(gè)堿基處，長度為795個(gè)堿基對(duì)，編碼 4-氨基-4-脫氧分支酸裂解酶，264個(gè)氨基酸；
amiL位于基因簇核苷酸序列第20038-21534個(gè)堿基處，長度為1497個(gè)堿基對(duì)，編碼苯輔酶A合成酶，498個(gè)氨基酸；
amiM位于基因簇核苷酸序列第21531-23564個(gè)堿基處，長度為2034個(gè)堿基對(duì)，編碼對(duì)氨基苯甲酸合成酶，677個(gè)氨基酸；
4)胞嘧啶生物合成基因，即amil共1個(gè)基因
amil位于基因簇核苷酸序列第17276-178 個(gè)堿基處，長度為549個(gè)堿基對(duì)，編碼 (脫氧)胞苷脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶，182個(gè)氨基酸；
5)?；D(zhuǎn)移酶基因，即amiF共1個(gè)基因；
amiF位于基因簇核苷酸序列第13592-14998個(gè)堿基處，長度為1407個(gè)堿基對(duì)，編碼酰基轉(zhuǎn)移酶，468個(gè)氨基酸；
6)末端絲氨酸生物合成基因，即amiR，amiS, amiT共3個(gè)基因
amiR位于基因簇核苷酸序列第觀935_四834個(gè)堿基處，長度為900個(gè)堿基對(duì)，編碼丙二酰輔酶A?；d體蛋白轉(zhuǎn)?；?，299個(gè)氨基酸；
amiS位于基因簇核苷酸序列第29925-31283個(gè)堿基處，長度為1359個(gè)堿基對(duì)，編碼絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶，452個(gè)氨基酸；
amiT位于基因簇核苷酸序列第313四_33794個(gè)堿基處，長度為M66個(gè)堿基對(duì)，編碼非核糖體肽合成酶，821個(gè)氨基酸；
7)調(diào)控基因，即amiP共1個(gè)基因
amiP位于基因簇核苷酸序列第沈996_27634個(gè)堿基處，長度為639個(gè)堿基對(duì)，編碼 TetR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，212個(gè)氨基酸；
8)轉(zhuǎn)運(yùn)基因，即amiO，amiQ共2個(gè)基因
amiO位于基因簇核苷酸序列第24970-26649個(gè)堿基處，長度為1680個(gè)堿基對(duì)，編碼ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，559個(gè)氨基酸；
amiQ位于基因簇核苷酸序列第2768448877個(gè)堿基處，長度為1194個(gè)堿基對(duì)，編碼主要易化超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，397個(gè)氨基酸。
SEQ ID NO. 1所示序列的互補(bǔ)序列可根據(jù)DNA堿基互補(bǔ)原則隨時(shí)得到。SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或用合適的限制性內(nèi)切酶酶切相應(yīng)的DNA或使用其他合適的技術(shù)得到。本發(fā)明提供了得到至少包含部分 SEQ IDN0. 1所示序列中DNA序列的重組DNA載體的途徑。
本發(fā)明還提供了產(chǎn)生友菌素生物合成基因被中斷或加倍的微生物體的途徑，至少其中之一的基因包含有SEQ ID NO. 1中的核苷酸序列。
本發(fā)明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法或包含本發(fā)明序列SEQ ID NO. 1的DNA作為探針以Southern雜交等方法從其他生物體中得到與友菌素生物合成基因相似的基因。
包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆DNA可用于從 Streptomyces vinaceus-drappus NRRL 2363基因組文庫中定位更多的文庫質(zhì)粒。這些文庫質(zhì)粒至少包含本發(fā)明中的部分序列，也包含有S. vinaceus-drappus NRRL 2363基因組中以前鄰近區(qū)域未克隆的DNA。
包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被修飾或突變。這些途徑包括插入、置換或缺失，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，錯(cuò)誤介導(dǎo)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，位點(diǎn)特異性突變，不同序列的重新連接，序列的不同部分或與其他來源的同源序列進(jìn)行定向進(jìn)化(DNAshuffling)，或通過紫外線或化學(xué)試劑誘變等。
包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通過合適的表達(dá)體系在外源宿主中表達(dá)以得到相應(yīng)的酶或其他更高的生物活性或產(chǎn)量。這些外源宿主包括大腸桿菌、鏈霉菌、假單孢菌、芽孢桿菌、酵母、植物和動(dòng)物等。
本發(fā)明所提供的氨基酸序列可以用來分離所需要的蛋白并可用于抗體的制備。
包含本發(fā)明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物學(xué)活性，或者提高了產(chǎn)量或優(yōu)化了蛋白動(dòng)力學(xué)特征或其他致力于得到的性質(zhì)。
包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在異源宿主中表達(dá)并通過DNA芯片技術(shù)了解它們?cè)谒拗鞔x中的功能。
包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列編碼的蛋白可以催化合成脫氧糖amosamine、 amicetose、褶皺菌素及正褶皺菌素，進(jìn)一步催化合成抗生素友菌素。
因此本發(fā)明還提供友菌素的生物合成基因簇在制備友菌素及其類似物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供友菌素的生物合成基因簇在制備脫氧糖amosamine中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供友菌素的生物合成基因簇在制備脫氧糖amicetose中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供友菌素的生物合成基因簇在制備褶皺菌素及其類似物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供友菌素的生物合成基因簇在制備正褶皺菌素及其類似物中的應(yīng)用。
包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通過遺傳重組來構(gòu)建重組載體以獲得新型生物合成途徑，也可以通過插入、置換、缺失或失活進(jìn)而獲得新型生物合成途徑。
包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因或DNA片段可以通過中斷友菌素生物合成的一個(gè)或幾個(gè)步驟而得到新的友菌素結(jié)構(gòu)類似物或前體。包含DNA片段或基因可以用來提高友菌素或其衍生物的產(chǎn)量，本發(fā)明提供了在基因工程微生物中提高產(chǎn)量的途徑。
本發(fā)明所提供的友菌素的糖基轉(zhuǎn)移酶、甲基轉(zhuǎn)移酶或其他酶提供了通過遺傳修飾得到類似物的途徑。
總之，本發(fā)明所提供的包含友菌素生物合成相關(guān)的所有基因和蛋白信息可以幫助人們理解友菌素家族天然產(chǎn)物的生物合成機(jī)制，為進(jìn)一步遺傳改造提供了材料和知識(shí)。本發(fā)明所提供的基因及其蛋白質(zhì)也可以用來尋找和發(fā)現(xiàn)可用于醫(yī)藥、工業(yè)或農(nóng)業(yè)的化合物或基因、蛋白。
用于本發(fā)明的酒紅土褐鏈霉菌NRRL2363 (Sti^ptomyces vinaceusdrappus NRRL 2363)，保藏于美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection，簡寫NRRL)，其登錄號(hào)為 NRRL 2363。


圖1是友菌素的化學(xué)結(jié)構(gòu)；
圖2(A)是友菌素生物合成基因簇的結(jié)構(gòu)示意圖和限制性內(nèi)切酶譜。B代表限制性內(nèi)切酶BamHI，E代表限制性內(nèi)切酶EcoRI，X*代表原始載體pOJ446中的限制性內(nèi)切酶父匕&1，5*代表原始載體？0446中的限制性內(nèi)切酶& 1。(B)pCSG3104的亞克隆。pCSG3201 11650bp BamHI/NdeI 片段克隆至 pED8a ；pCSG3202 :8479bp NotI 片段克隆至 pUCPU21 ； PCSG3203 :8479bp BamHI/Spel 片段克隆至 pED8a ；pCSG3205 :10903bp NotI 片段克隆至 PUCPU21 ；pCSG3206 :9008bp Xbal/Hindlll 片段克隆至pUCPU21 ；pCSG3207 :5953bp NotI 片段克隆至PUCPU21。
圖3是友菌素生物合成基因簇的異源表達(dá)和基因簇邊界的確定。(A)友菌素生物合成基因簇在S. Iivdans TK64中異源表達(dá)代謝產(chǎn)物的高壓液相分析，(I)包含載體pOJ446 的TK64，(II)包含質(zhì)粒pCSG3104(含完整的友菌素生物合成基因簇)的TK64，(III)友菌素標(biāo)準(zhǔn)品，(IV)化合物正褶皺菌素(9)和褶皺菌素(10)的標(biāo)準(zhǔn)品。(B)友菌素野生型生產(chǎn)菌酒紅土褐鏈霉菌NRRL2363(V)，Aorf(-l)突變株AMlOOl (VI)和Aorfl突變株 AMlOll (VII)的代謝產(chǎn)物的高壓液相分析；
圖4是提出的友菌素兩個(gè)脫氧糖amosamine和amicetose的生物合成途徑；
圖5是提出的友菌素的生物合成途徑；
圖6是友菌素生物合成基因突變株代謝產(chǎn)物的高壓液相分析及所產(chǎn)化合物的結(jié)構(gòu)式。㈧友菌素生物合成基因突變株代謝產(chǎn)物的高壓液相分析，(I)AamiB突變株 AM1002，(II) AamiF 突變株 AM1003，(III) Δ amiG 突變株 AM1004，(IV) AamiH 突變株 AM1005，(V) AamiI 突變株 AMlOO6，(VI) Δ amiL 突變株 AMIOO7，(VII) AamiP 突變株 AM1008, (VIII) AamiR 突變株 AM1009，(IX) Δ amiS 突變株 AM1010，(X) AamiT 突變株 AM1012, (XI)友菌素野生型生產(chǎn)菌酒紅土褐鏈霉菌NRRL2363。(B)突變株所產(chǎn)化合物2_11 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式；圖7是對(duì)氨基苯甲酸(PABA)在突變株AM1006中生物轉(zhuǎn)化為4-乙酰氨基-3-羥基-苯甲酸(3)。(A)對(duì)氨基苯甲酸生物轉(zhuǎn)化的示意圖。(B)生物轉(zhuǎn)化菌株的高壓液相分析，(I)突變株AM1006，(II)突變株AM1006添加ImM的對(duì)氨基苯甲酸，(III)突變株AM1006添加IOmM的對(duì)氨基苯甲酸，(IV)對(duì)氨基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品，(V) 4-乙酰氨基-3-羥基-苯甲酸⑶標(biāo)準(zhǔn)品；
圖8是糖基轉(zhuǎn)移酶AmiG的異源表達(dá)和分離純化的蛋白電泳分析。(A)糖基轉(zhuǎn)移酶AmiG在大腸桿菌中的異源表達(dá)。1，E. coli BL21 (DE3)/pET28a全細(xì)胞提取物；2，Ε. coli BL21 (DE3)/pCSG3247全細(xì)胞提取物；3，E. coli BL21 (DE3)/pCSG3247全細(xì)胞提取物的上清部分；M，蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量。⑶糖基轉(zhuǎn)移酶AmiG的分離純化。1，純化后的4!^6(化1);1， 純化后的AmiG (5 μ 1)；
圖9是AmiG催化的代表性反應(yīng)。㈧在TDP或UDP介導(dǎo)下AmiG催化的逆向反應(yīng)， 如AmiG可催化由化合物正褶皺菌素(9)變成化合物12，同時(shí)生成核苷糖。(B)AmiG催化的正向反應(yīng)，如在TDP-葡萄糖(TDP-glucose)或UDP-葡萄糖(UDP-glucose)存在時(shí)，AmiG 可催化化合物4的加糖反應(yīng)形成化合物13。(C)AmiG催化的交換反應(yīng)，如在AmiG的反應(yīng)體系中同時(shí)加入化合物4和化合物10，AmiG可先進(jìn)行逆向催化將化合物10轉(zhuǎn)化為化合物12 和TDP-amosamine，再將形成的TDP-amosamine經(jīng)正向反應(yīng)添加到化合物4上，最終形成化合物1 ；
圖10是AmiG催化反應(yīng)的高壓液相分析。㈧AmiG催化的逆向反應(yīng)，i)對(duì)照反應(yīng)， 100 μ M 化合物 9，ImM TDP，無 AmiG ;ii) 100 μ M 化合物 9，ImM Τ Ρ,δμΜ AmiG ;iii) 100 μ M 化合物9，ImM UDP,5yM AmiG ;iv) 100 μ M化合物 10，ImM Τ Ρ,δμΜ AmiG ;ν) 100 μ M化合物 7, ImM Τ Ρ,δμΜ AmiG ；vi) 100 μ M 化合物 1, ImM TDP, 5 μ MAmiG ；vii) 100 μ M 化合物 6，ImMTDP,5yM AmiG0 (B)AmiG催化的正向反應(yīng)和交換反應(yīng)，viii)對(duì)照反應(yīng)，100 μ M化合物4， ImM TDP-glucose, ^AmiG ；ix) 100 μImM TDP-glucose, 5 μ M AmiG ；χ) 100 μ M^合物4，ImM 皿卩飛111(；086，無六1^6;11)10(^]\1化合物4，11111 UDP-glucose, 5 μ M AmiG ；xii) 對(duì)照反應(yīng)，50 μ M化合物4，100 μ M化合物10，無AmiG ；xiii) 50 μ M化合物4，100 μ M化合物 10，5μΜ AmiGo
具體實(shí)施例方式
以下是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
1、友菌素生物合成基因簇克隆、序列分析及功能分析
友菌素(圖1)結(jié)構(gòu)中含有一分子的對(duì)氨基苯甲酸(PABA，para-Amino Benzoic Acid)，通過比較一些次級(jí)代謝產(chǎn)物的PABA合成酶AurG (aureothin， Streptomyces thioluteus, CAE02603)，PabAB (Streptomyces sp.FR-008, AAQ82560)， PabAB(chloramphenicol, Streptomyces venezuelaeISP5230, AAB30312)的氨基酸序列， 確定了保守區(qū)域，設(shè)計(jì)兼并性引物 PABA-2F :5' -GGGVGT SCA GTT CCM MCC SGA GTC-3‘ 和 PABA-5R:5' -CAG GTC GAC GAT CAT SAG GTTCTC GGC-3 ‘，成功從酒紅土褐鏈霉菌 (Streptomyces vinaceus-drappus) NRRL 2363 基因組中擴(kuò)增到一個(gè) 1. Ikb 的 DNA 片段，經(jīng)克隆到T載體并測(cè)序確認(rèn)了該片段與上述PABA合成酶有一定的相似性，從而暗示克隆到的基因片段很有可能參與了友菌素中對(duì)氨基苯甲酸結(jié)構(gòu)域的生物合成。以該DNA片段為篩選探針，從酒紅土褐鏈霉菌NRRL 2363基因組文庫約2000個(gè)克隆中，成功篩選到9個(gè)陽性柯斯質(zhì)粒，其中陽性克隆PCSG3104在異源宿主變鉛青鏈霉菌(Sti^ptomyces lividans) TK64 中表達(dá)可使其產(chǎn)生友菌素及其中間體，表明PCSG3104包含了友菌素生物合成所必須的全部基因。對(duì)PCSG3104進(jìn)行DNA測(cè)序分析表明其插入序列全長為37337bp，其序列如SEQ ID NO. 1所示，GC含量為68. 5%，生物信息學(xué)分析包含了沈個(gè)開放閱讀框(表1，圖2)，其中 21個(gè)開放閱讀框(amiA-amiU)可能與友菌素的生物合成有關(guān)。根據(jù)基因編碼蛋白的功能分析，兩個(gè)轉(zhuǎn)座基因amiO和amiQ可能與友菌素的轉(zhuǎn)運(yùn)輸送相關(guān)；一個(gè)調(diào)控子基因amiP可能與友菌素生物合成的調(diào)控相關(guān)；八個(gè)基因(amiB-amiE，amiH, amiK, amiN和amiU)可能和友菌素中的兩個(gè)脫氧糖的生物合成相關(guān)；兩個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因amiG和amij可能和兩個(gè)脫氧糖的添加有關(guān)；核苷2-脫氧戊糖轉(zhuǎn)移酶基因amil可能參與胞嘧啶的合成；四個(gè)基因 (amiM，amiA, amiL和amiF)可能參與對(duì)氨基苯甲酸的生物合成；三個(gè)基因(amiS，amiT和 amiR)可能參與末端α -甲基絲氨酸的生物合成。
表1 友菌素生物合成基因簇的基因及其功能分析
權(quán)利要求
1.一種友菌素的生物合成基因簇，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第 7917位到34889位的堿基序列所示。
2.權(quán)利要求1所述的友菌素的生物合成基因簇在制備友菌素及其類似物中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的友菌素的生物合成基因簇在制備脫氧糖amosamine中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的友菌素的生物合成基因簇在制備脫氧糖amicetose中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的友菌素的生物合成基因簇在制備褶皺菌素及其類似物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述的友菌素的生物合成基因簇在制備正褶皺菌素及其類似物中的應(yīng)
全文摘要
本發(fā)明公開一種友菌素的生物合成基因簇及其應(yīng)用。包含21個(gè)基因，其中8個(gè)脫氧糖合成酶基因(amiB，amiC，amiD，amiE，amiH，amiK，amiN，amiU)和2個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因(amiJ，amiG)編碼的蛋白負(fù)責(zé)友菌素兩個(gè)脫氧糖基的生物合成，3個(gè)基因(amiA，amiM，amiL)編碼的蛋白負(fù)責(zé)對(duì)氨基苯甲酸的生物合成，1個(gè)基因(amiI)編碼的蛋白負(fù)責(zé)胞嘧啶的生物合成，1個(gè)基因(amiF)編碼的蛋白負(fù)責(zé)胞嘧啶脫氧核苷與對(duì)氨基苯甲酸輔酶A之間的縮合反應(yīng)，3個(gè)基因(amiT，amiR，amiS)編碼的蛋白負(fù)責(zé)末端氨基酸的生物合成，此外，還包括1個(gè)調(diào)控基因(amiP)，2個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)基因(amiO，amiQ)。本發(fā)明所提供的基因及其蛋白質(zhì)也可以用來尋找和發(fā)現(xiàn)可用于醫(yī)藥、工業(yè)或農(nóng)業(yè)的化合物或基因、蛋白。
文檔編號(hào)C12N15/53GK102533813SQ20121003083
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月10日
發(fā)明者張光濤, 張改云, 張海波, 張長生, 朱義廣, 李蘇梅, 肖吉, 陳瑞東, 鞠建華 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院南海海洋研究所