專利名稱：用于犬瘟熱病毒野毒株與疫苗株鑒別診斷rt-lamp檢測(cè)引物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明設(shè)計(jì)一套檢測(cè)毒株的引物，尤其涉及一套用于檢測(cè)犬瘟熱病毒野毒株的 RT-LAMP引物，屬于犬瘟熱病毒的檢測(cè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
犬痕熱病毒(Canine distemper virus, CD V)屬于副粘病毒科 (Paramyxoviridae)，副粘病毒亞科(Paramyxovirinae)，麻疫病毒屬(Morbillivirus)。 CDV為有囊膜的單股、負(fù)鏈、不分節(jié)段的RNA病毒，基因組全長(zhǎng)15 690bp，主要編碼核衣殼蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝蛋白⑶和大蛋白(L)6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白。目前公認(rèn)CDV只有一個(gè)血清型，但根據(jù)H基因氨基酸序列同源性高于95%的毒株可歸為同一基因型的原則，可將⑶V分為亞洲I型(Asia-I)、亞洲II型(Asia-II)、歐洲型 (Europe)、美國(guó)型(USA 或 America)、北極型(Arctic)和疫苗型(Vaccine 或 Old CDVs) 6 個(gè)不同基因型。犬瘟熱(Canine distemper，⑶)是由⑶V感染犬或其它肉食目動(dòng)物所引起的急性、高度接觸性傳染病。臨床以雙相熱、紅疹、結(jié)膜炎及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害為主要特征。 自1809年首次報(bào)道以來(lái)，該病已呈世界性分布，給養(yǎng)犬業(yè)、毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)和野生動(dòng)物保護(hù)業(yè)造成巨大危害。⑶感染可導(dǎo)致犬、貂、狐等的病死率達(dá)30% -80%，雪貂高達(dá)100%。 而對(duì)于CD的防治，除采用疫苗進(jìn)行定期的免疫接種外，尚無(wú)特異性治療方法。而目前用于CD防制的主要為弱毒疫苗，弱毒疫苗大規(guī)模應(yīng)用使得區(qū)分動(dòng)物自然感染與疫苗免疫 (Diffreentiating Infected from vaccinated Animals,DIVA)變得非常困難。因此建立一種可以鑒別診斷CDV強(qiáng)、弱野毒感染的敏感而特異的檢測(cè)方法已勢(shì)在必行。目前CDV檢測(cè)方法有很多，包括病毒分離培養(yǎng)、動(dòng)物接種試驗(yàn)、血清學(xué)診斷方法、 RT-PCR、RT-nested PCR,Semi-nested PCR和實(shí)時(shí)熒光定量RT_PCR(Real time RT-PCR)等。 其中病毒分離和動(dòng)物試驗(yàn)不同程度的存在診斷周期長(zhǎng)、操作繁瑣、檢出率低等不足；常規(guī)的血清學(xué)試驗(yàn)又很難鑒別⑶V野毒感染和疫苗接種，而Real time RT-PCR方法對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器的要求很高。雖然單克隆抗體技術(shù)用于診斷在一定程度上彌補(bǔ)了這一缺陷，但是基于抗原抗體反應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)仍有一定的局限性(即敏感性不夠高等)，如膠體金檢測(cè)技術(shù)。上述方法或多或少存在缺陷，很難適合于基層實(shí)驗(yàn)室的快速準(zhǔn)確檢測(cè)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)方法是日本學(xué)者Notomi等在2000年發(fā)明的一項(xiàng)恒溫核酸擴(kuò)增新技術(shù)。該技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、成本低廉，特別適合在現(xiàn)場(chǎng)和基層部門應(yīng)用。關(guān)于⑶V的RT-LAMP方法已有報(bào)道，但均不能用于⑶V野毒株和疫苗株的鑒別。為此，本研究建立了無(wú)需特殊的儀器、適合基層實(shí)驗(yàn)室使用的快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確，且可用于CDV野毒株和疫苗株進(jìn)行鑒別診斷的RT-LAMP方法
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的結(jié)束問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一套可用于檢測(cè)犬瘟熱病毒野毒株的RT-LAMP引物。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的一套用于區(qū)分犬瘟熱病毒野毒株與疫苗株的RT-LAMP引物，其特征在于所述RT-LAMP引物包括一對(duì)外引物和一對(duì)內(nèi)引物，其中，所述的外引物的序列為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2所示，所述內(nèi)引物的序列分別為SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示。本發(fā)明還提供了一種用于區(qū)分犬瘟熱病毒野毒株與疫苗株的方法，其特征在于包括以下步驟配制25 μ L反應(yīng)體系10 μ M引物F3和Β3各0.5 μ L，10 μ M引物FIP和BIP各 5 μ L,2. 5mM dNTPs 2. 5 μ L, 25mM MgCl2 5 μ L,5M Betaine 2. 5 μ L, 10 X ThermoBuffer
2.5 μ L, Bst DNA聚合酶20U,模板2 μ L,用去離子水補(bǔ)足25 μ L ;其中，引物F3和Β3為外引物，其序列分別為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示; 引物FIP和BIP為內(nèi)引物，其序列分別為SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示;PCR 反應(yīng)程序62°C 45min ；80°C 2min ；觀察取5μ L PCR產(chǎn)物，經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。進(jìn)一步的，本發(fā)明提出了一種區(qū)分犬瘟熱病毒野毒株與疫苗株的試劑盒，其特征在于包含本發(fā)明所述的引物。更進(jìn)一步的，本發(fā)明提出了所述的引物在制備區(qū)分犬瘟熱病毒野毒株與疫苗株感染試劑中的應(yīng)用。及所述的試劑盒在制備區(qū)分犬瘟熱病毒野毒株與疫苗株感染試劑中的應(yīng)用。及所述的引物在制備檢測(cè)犬瘟熱病毒野毒株或疫苗株試劑中的應(yīng)用。及所述的試劑盒在制備檢測(cè)犬瘟熱病毒野毒株或疫苗株試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明根據(jù)GenBank中⑶V H基因序列，設(shè)計(jì)RT-LAMP引物(因?yàn)镠基因序列存在的差異是CDV基因型分類依據(jù)，所以根據(jù)H基因的堿基差異設(shè)計(jì)了專門針對(duì)CDV野毒株的RT-LAMP引物)，包括一對(duì)外引物F3/B3 (SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2)，一對(duì)內(nèi)引物 FIP/BIP(SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示)，以樣品的cDNA為模板，利用Bst DNA聚合酶，在62°C恒溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增。該方法可檢測(cè)出不同基因型的CDV野毒株，檢出極限為
3.5TCID50的CDV ;特異性試驗(yàn)表明，該方法對(duì)CDV疫苗株、CPV以及其他常見犬源性病毒均無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)。該方法無(wú)需特殊儀器，是一種適用于基層的快速、簡(jiǎn)便的CDV野毒株鑒別方法。以本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物采用RT-LAMP檢測(cè)方法對(duì)各種基因型的CDV野毒株進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，而對(duì)CDV弱毒疫苗株、CPV以及其他常見犬源性病毒檢測(cè)結(jié)果均為陰性。應(yīng)用本發(fā)明引物序列采用RT-LAMP檢測(cè)方法，可以非常準(zhǔn)確的鑒別出CDV野毒株，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物序列在犬瘟熱早期檢測(cè)和快速診斷中具有重要意義。


圖I為RT-LAMP敏感性試驗(yàn)結(jié)果；I DL 2000 DNA Marker ；2 10_1 ；3 :1(Γ2 ；4 :1(Γ3 ；5 :1(Γ4 ；6 :1(Γ5 ；7 :1(Γ6 ；8 :陰性對(duì)
圖2為RT-LAMP特異性試驗(yàn)結(jié)果；I CPV 模板；2 =CAV-I 模板；3 =CAV-II 模板；4 :CDV 模板；5 DL 2000 DNA Marker圖3為RT-LAMP重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果。I DL2000 DNA Marker ；2~4 :不同代次的⑶V野毒株細(xì)胞培養(yǎng)物，同一時(shí)間提取 RNA模板；5-7 同一 CDV野毒株細(xì)胞培養(yǎng)物，分別在3個(gè)時(shí)間提取RNA模板
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例II材料和方法I. I病毒株和待檢材料Asia-I型和Asia-II型⑶V野毒株XDV弱毒疫苗株、CPV株、I型犬腺病毒(CAV-I) 株、II型犬腺病毒(CAV-II)株和狂犬病毒(RV)株均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所經(jīng)濟(jì)動(dòng)物組保存。待檢材料包括56份從東北地區(qū)不同養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的臨床病例樣品。I. 2引物設(shè)計(jì)與合成參照GenBank中Q)V H基因序列，利用在線軟件Primer Explorer V4作為輔助， 設(shè)計(jì)RT-LAMP引物，其中包括2條外引物F3/B3和2條內(nèi)引物FIP/BIP (表I)。表IRT-LAMP引物序列
_引物序列(5，-3，)_
F3 GCCTGTATTGGTCTCTGAG (SEQ ID NO: I)
B3 CTCCG TTCAGTATAACCGG ( SEQID NO: 2)
FIP TGCACATAGGGTAGGATTTTCT-
GAACAAGAGGAGCAAAAAAACT ( SEQ ID NO: 3)
BIP AGTTGCCTTCTTATGGGCGGATG-
TTAAGTTGAAGGTCAATGC( SEQ ID NO: 4)I. 3病毒RNA提取和cDNA合成I. 3. IRNA 的提取用QIAamp Viral RNA Kit提取試劑盒(QIAgen公司)提取病毒RNA，具體操作方法參照說(shuō)明書進(jìn)行。I. 3. 2cDNA 的合成
取1“1^病毒1 應(yīng)，加入到2(^1^反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，內(nèi)含44 1^ 5XRT Buffer、2yL dNTP Mixture (各 IOmM)、50pmoI 9_mer 隨機(jī)引物、IOU禽源反轉(zhuǎn)錄酶(AMVRT XL)和 20U RNA 酶抑制劑(HPRI)，42°C水浴lh，最后70°C 15min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。I. 4RT-LAMP 方法的優(yōu)化I. 4. I鎂離子濃度的優(yōu)化以⑶V全長(zhǎng)cDNA為模板，鎂離子的濃度在2. 5 6. 5mM,以O(shè). 5mM遞增，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。反應(yīng)條件為62°C 60min,80°C 2min，產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳中觀察。1. 4. 2引物濃度的優(yōu)化由于外弓丨物對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響很小，所以實(shí)驗(yàn)中固定外弓丨物濃度，對(duì)內(nèi)引物濃度進(jìn)行梯度稀釋(O. 8μΜ、1. 2μΜ、1. 6μΜ和2. O μ Μ)，每個(gè)濃度的引物重復(fù)3個(gè)反應(yīng)，產(chǎn)物于 2%瓊脂糖凝膠電泳中觀察。I. 4. 3反應(yīng)溫度的優(yōu)化在完成以上所有條件優(yōu)化基礎(chǔ)上進(jìn)行反應(yīng)溫度優(yōu)化。反應(yīng)溫度從61 °C 65°C，以 I°C依次遞增，每個(gè)溫度重復(fù)3次反應(yīng)，產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳中觀察。I. 5擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束后，取6 μ L RT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物，于2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。I. 6RT-LAMP的敏感性試驗(yàn)將104_ 6TCID5tl的⑶V野毒株細(xì)胞培養(yǎng)物用滅菌的去離子水進(jìn)行連續(xù)10倍梯度稀釋，分別提取RNA反轉(zhuǎn)錄后，運(yùn)用優(yōu)化的RT-LAMP方法進(jìn)行檢測(cè)。L 7RT-LAMP的特異性試驗(yàn)提取CDV 疫苗株、Asia-I 型和 Asia-ΙΙ 型的 CDV 野毒株、CPV、CAV-I、CAV_II 和 RV 等病毒核酸，按照所建立的CDV RT-LAMP檢測(cè)方法進(jìn)行特異性試驗(yàn)。同時(shí)把CDV株F3和B3 之間的擴(kuò)增條帶切膠回收，插入PMD18-T載體，然后測(cè)序驗(yàn)證。應(yīng)用DNAStar軟件對(duì)序列進(jìn)行分析，并在GenBank中對(duì)序列進(jìn)行BLAST分析，用以驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。I. 8RT-LAMP的重復(fù)性試驗(yàn)取等量的3份不同代次的CDV株細(xì)胞培養(yǎng)物，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行RT-LAMP檢測(cè)，用以檢測(cè)批內(nèi)重復(fù)性。取等量的3份不同代次的CDV毒株細(xì)胞培養(yǎng)物，不同時(shí)間提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄后，在同一反應(yīng)條件下進(jìn)行獨(dú)立的RT-LAMP，用以檢測(cè)批間重復(fù)性。2 結(jié)果2. I優(yōu)化的RT-LAMP反應(yīng)條件通過對(duì)RT-LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定最佳的反應(yīng)體系為反應(yīng)體系為25 μ L : 1(^]\1引物卩3和83各0.54 1^，1(^]\1引物？1 和81 各54 1^，2.51111 dNTPs 2. 5μ L,25mM MgCl2 5μ L,5M Betaine 2. 5 μ L, IOXThermo Buffer 2. 5 μ L, Bst DNA 聚合酶 20U，模板
2μ L，用去離子水補(bǔ)足25 μ L。反應(yīng)條件為62°C 45min ；80°C 2min。2. 2RT-LAMP 的敏感性運(yùn)用優(yōu)化的RT-LAMP方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)為陽(yáng)性的最低稀釋度為10°_6(3. 5TCID50) (圖I所示)。2. 3RT-LAMP 的特異性所建立的⑶V RT-LAMP檢測(cè)方法可以檢測(cè)出不同基因型的⑶V野毒株，而對(duì)⑶V 弱毒疫苗株、CPV、CAV-I, CAV-II和RV檢測(cè)結(jié)果均為陰性(圖2所示)。測(cè)序結(jié)果分析表明，擴(kuò)增的214bp的片段與CDV的H基因序列(FJ409464)同源性為100%。2. 4RT-LAMP 的重復(fù)性2. 4. I批內(nèi)重復(fù)性取不同代次的CDV野毒株細(xì)胞培養(yǎng)物，同一時(shí)間提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后，在同一反應(yīng)條件下進(jìn)行獨(dú)立的RT-LAMP檢測(cè)，3次檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯差異(圖3所示)。2. 4. 2批間重復(fù)性取同一 CDV野毒株細(xì)胞培養(yǎng)物，分別3個(gè)時(shí)間提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行一次 RT-LAMP檢測(cè)，3個(gè)重復(fù)結(jié)果無(wú)明顯差異(圖3所示)。
權(quán)利要求
1.一套用于區(qū)分犬瘟熱病毒野毒株與疫苗株的RT-LAMP引物，其特征在于所述 RT-LAMP引物包括一對(duì)外引物和一對(duì)內(nèi)引物，其中，所述的外引物的序列為SEQ ID NO :1和 SEQ ID NO :2所示，所述內(nèi)引物的序列分別為SEQ ID NO :3和SEQ ID N0:4所示。
2.一種用于區(qū)分犬瘟熱病毒野毒株與疫苗株的方法，其特征在于包括以下步驟配制25 μ L反應(yīng)體系10 μ M引物F3和Β3各O. 5 μ L，10 μ M引物FIP和BIP各5 μ L，2.5mM dNTPs 2. 5 μ L,25mM MgCl2 5 μ L,5M Betaine 2. 5 μ L,10 X ThermoBuffer 2. 5 μ L, Bst DNA聚合酶20U,模板2μ L,用去離子水補(bǔ)足25 μ L ;其中，引物F3和Β3為外引物，其序列分別為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示；引物 FIP和BIP為內(nèi)引物，其序列分別為SEQ ID NO 3和SEQ ID NO :4所示；PCR 反應(yīng)程序62°C 45min ；80°C 2min ；觀察取5μ L PCR產(chǎn)物，經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。
3.—種區(qū)分犬瘟熱病毒野毒株與疫苗株的試劑盒，其特征在于包含權(quán)利要求I所述的引物。
4.權(quán)利要求I所述的引物在制備區(qū)分犬瘟熱病毒野毒株與疫苗株感染試劑中的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求2所述的試劑盒在制備區(qū)分犬瘟熱病毒野毒株與疫苗株感染試劑中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求I所述的引物在制備檢測(cè)犬瘟熱病毒野毒株或疫苗株試劑中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求2所述的試劑盒在制備檢測(cè)犬瘟熱病毒野毒株或疫苗株試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一套用于區(qū)分犬瘟熱病毒野毒株與疫苗株的RT-LAMP引物及其應(yīng)用，所述RT-LAMP引物包括一對(duì)外引物和一對(duì)內(nèi)引物，其中，外引物的序列為SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示；內(nèi)引物的序列分別為SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示。以本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物采用RT-LAMP檢測(cè)方法對(duì)各種基因型CDV野毒株進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，而對(duì)犬瘟熱疫苗株、犬細(xì)小病毒以及其他常見犬源病毒檢測(cè)結(jié)果均為陰性。應(yīng)用本發(fā)明引物序列采用RT-LAMP檢測(cè)方法，可以非常準(zhǔn)確地區(qū)分CDV野毒株和CDV疫苗株，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102586485SQ20121006346
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月12日
發(fā)明者劉大飛, 劉春國(guó), 張洪英, 戚亭, 曲連東 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所