專利名稱：一種用于檢測(cè)基因變異的pcr引物設(shè)計(jì)方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體 涉及一種全新的、高效易控的PCR引物設(shè)計(jì)方法，以及利用該方法設(shè)計(jì)引物參與的癌癥基因檢測(cè)試劑盒和耐藥基因檢測(cè)試劑盒，利用該方法生產(chǎn)的試劑盒靈敏度高、重復(fù)性好、非常穩(wěn)定可靠，適用于臨床癌癥基因檢測(cè)和篩查，以及耐藥基因的檢測(cè)。
背景技術(shù)：
基因變異在生物體中時(shí)刻發(fā)生，有的變異是無(wú)意義的，它不影響生物體正常生長(zhǎng)，但是，有一些變異后果非常嚴(yán)重，給人類的生存帶來(lái)威脅?，F(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)癌癥的發(fā)生是由于基因重組、突變或缺失等變異造成的。也有充分證據(jù)證明，病原微生物在某些條件下基因變異可以獲得某種耐藥抗性，給臨床治療帶來(lái)巨大麻煩。例如HBV拉咪呋啶耐藥基因突變、HIV耐藥基因變異、TB利福平耐藥基因變異、TB異煙肼耐藥基因變異、TB乙胺丁醇耐藥基因變異等。癌癥，也叫惡性腫瘤，它可以破壞組織、器官的結(jié)構(gòu)和功能，引起壞死出血合并感染，患者最終可能由于器官功能衰竭而死亡。人體內(nèi)存在原癌基因和抑癌基因。原癌基因主管細(xì)胞分裂、增殖，是維持機(jī)體正常生命活動(dòng)所必須的，在進(jìn)化上高等保守。抑癌基因負(fù)責(zé)控制細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。平時(shí)，原癌基因和抑癌基因維持著平衡，但在致癌因素作用下，原癌基因的力量會(huì)變大，而抑癌基因卻變得弱小，導(dǎo)致細(xì)胞癌變。每年，癌癥在全球致死700萬(wàn)人，我國(guó)也有100萬(wàn)人因此失去生命。為了降伏這一絕癥，科學(xué)家們付出了極大努力。但直到現(xiàn)在，還是沒(méi)找到攻克癌癥的辦法。目前，靶向治療已經(jīng)成為腫瘤臨床治療的重要手段。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)是靶向治療的主要作用靶點(diǎn)。EGFR的靶向藥物包括EGFR抗單克隆抗體藥愛(ài)必妥、帕尼單抗，以及EGFR酪氨酸激酶抑制劑易瑞沙和特羅凱。這些藥物能通過(guò)抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展中必須的表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶阻斷腫瘤細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的增生、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的調(diào)亡。EGFR基因突變與酪氨酸激酶抑制類靶向藥物Iressa(易瑞沙)和Tarceva(特羅凱)等的治療療效有顯著相關(guān)性。大多數(shù)EGFR基因突變患者的靶向藥物治療效果顯著。中國(guó)人非小細(xì)胞肺癌患者EGFR基因突變率為30%左右，為明確是否進(jìn)行相應(yīng)的靶向治療，有必要進(jìn)行EGFR基因突變的檢測(cè)。非小細(xì)胞肺癌等腫瘤患者在進(jìn)入個(gè)體化靶向治療療程之前應(yīng)進(jìn)行EGFR突變檢測(cè)，可為患者個(gè)體用藥提供用藥科學(xué)依據(jù)，降低治療風(fēng)險(xiǎn)、減輕患者負(fù)擔(dān)。但是，臨床試驗(yàn)表明這些靶向藥物僅對(duì)部分病人有顯著療效。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中K-ras基因發(fā)生突變(體細(xì)胞突變)的病人對(duì)此類靶向藥物存在完全耐藥。因此，檢測(cè)病人K-ras基因是否突變成為決定能否使用EGFR靶向藥物的必要前提條件。ras基因家族與人類腫瘤相關(guān)的基因有三種H_ras、K-ras和N_ras,分別定位在11、12和I號(hào)染色體上。作為原癌基因的ras基因被激活后就變成有致癌活性的癌基因，ras基因通過(guò)突變而激活。其中，K-ras則對(duì)人類癌癥影響最大，它好像分子開(kāi)關(guān)當(dāng)正常時(shí)能控制調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的路徑；發(fā)生異常時(shí)，則不受上游EGFR的信號(hào)影響，導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)，并阻止細(xì)胞自我毀滅。這也是具有突變型K-ras基因患者對(duì)抗EGFR藥物治療無(wú)效的理論基礎(chǔ)。K-ras突變的最常見(jiàn)的方式就是點(diǎn)突變，多發(fā)生在N端第12、13和61密碼子，占所有突變率的90%以上。K-ras基因的突變導(dǎo)致細(xì)胞逃逸凋亡，這種異常在胰腸癌、大腸癌、肺癌等腫瘤組織中發(fā)生率較高。據(jù)國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，最高為胰外分泌腺癌，達(dá)90%，結(jié)腸癌為
40% 50 %，肺癌和膀胱癌為40 %，而胃癌較低在10 %以下。因此這幾種癌癥中K-ras基因野生型患者使用易瑞沙的療效也比較顯著，特別是結(jié)腸直腸癌，美國(guó)癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)(NCCN)已把K-ras突變的檢測(cè)列為《結(jié)腸癌臨床治療指南》與《直腸癌臨床治療指南》臨床用藥必檢項(xiàng)目。研究表明，BRAF基因突變的患者接受EGFR-TKI藥物治療的有效率低。而且，BRAFV600E突變可導(dǎo)致部分K-ras基因野生型患者對(duì)EGFR-TKI及EGFR單抗藥物治療不敏感。因此檢測(cè)腫瘤患者BRAF基因突變情況可用于指導(dǎo)EGFR-TKI的靶向用藥。BRAF基因突變被 發(fā)現(xiàn)存在于黑色素瘤、大腸癌等多種惡性腫瘤中，可結(jié)合該患者EGFR、KRAS基因突變的檢測(cè)信息制定出最為適合病人個(gè)體的腫瘤治療方案。為臨床醫(yī)生用藥提供用藥科學(xué)依據(jù)，降低醫(yī)生治療風(fēng)險(xiǎn)以及患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。另外，隨著抗生素藥物濫用和個(gè)別病原微生物基因易變性，導(dǎo)致過(guò)去容易治療的感染性疾病變成難以治愈的疾病，例如超級(jí)細(xì)菌、多耐藥結(jié)核；還有一些病毒，如HBV、HIV,在用藥數(shù)月，甚至有的數(shù)周就可產(chǎn)生耐藥性。由于沒(méi)有進(jìn)行基因變異監(jiān)測(cè)，傳統(tǒng)的治療方案面對(duì)基因變異時(shí)，不能及時(shí)改變治療策略往往導(dǎo)致治療效果差、病情持續(xù)惡化的情況出現(xiàn)。由于上述基因變異存在，極大的影響了患者的生存和生活質(zhì)量?？茖W(xué)工作者發(fā)明了許多檢測(cè)基因變異的方法，具體包括PCR-限制性酶切分析、PCR-SSCP分析、PCR-測(cè)序分析、PCR-基因芯片分析、PCR-LDR、連接酶反應(yīng)LDR、PCR-HRM分析、ARMS-PCR等。其中最為常用方法為PCR-限制性酶切分析、PCR-測(cè)序分析、PCR-基因芯片分析、PCR-HRM分析、ARMS-PCR。PCR-限制性酶切分析是針對(duì)位點(diǎn)明確、且突變型與野生型在序列上至少存在一種酶切位點(diǎn)差異。PCR完成后，用該酶進(jìn)行酶切后，測(cè)序鑒定。耗時(shí)、繁瑣，但靈敏度高。對(duì)于有些樣品由于野生型和突變型之間無(wú)差異酶切位點(diǎn)，導(dǎo)致該方法不可用。PCR-測(cè)序分析是突變檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)方法，可發(fā)現(xiàn)未知變異位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)周期久、靈敏度低(10%左右^PCR-基因芯片分析是針對(duì)大量已知突變位點(diǎn)的有效方法，但是其靈敏度僅能做到5% 10%，且成本較高。PCR-HRM分析成本低、通量大，由于不能自動(dòng)化分析結(jié)果，需實(shí)驗(yàn)人員判讀，僅在科研中有所應(yīng)用。ARMS-PCR是目前開(kāi)發(fā)基因變異最為常用技術(shù)，系統(tǒng)中包含通用引物和變異區(qū)域特異引物(以后簡(jiǎn)稱“變異引物”)。通用引物可與野生型和突變型同時(shí)結(jié)合、變異引物與基因變異區(qū)域完全互補(bǔ)，與野生型僅在3端有I 5個(gè)堿基的差異，因此基因變異的檢測(cè)完全依賴于變異引物的設(shè)計(jì)，變異引物的設(shè)計(jì)也決定了試劑盒的靈敏度和特異性(見(jiàn)圖I)。由于變異引物與野生型模板僅有I 3個(gè)堿基不互補(bǔ)，也存在一定幾率結(jié)合而發(fā)生錯(cuò)誤引導(dǎo)的PCR合成，這種結(jié)合的概率很高，約為O. 1% 1%。一旦發(fā)生此類反應(yīng)，則結(jié)果和試劑盒的可靠性將大大下降。影響此類反應(yīng)的因素主要是核酸提取殘留鹽離子、模板濃度過(guò)高兩個(gè)，這兩個(gè)因素在實(shí)際應(yīng)用中不是可控因素，因此無(wú)法在研究測(cè)試初期通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件來(lái)降低。歐洲D(zhuǎn)XS基于ARMS-PCR/Scorpion系統(tǒng)開(kāi)發(fā)的Κ-ras試劑已獲得CE認(rèn)證，并在SFDA提出注冊(cè)申請(qǐng)。因此基于ARMS-PCR開(kāi)發(fā)新的分子診斷試劑盒是一個(gè)較為可靠的方法。由于基因變異，面對(duì)復(fù)雜的基因變異，傳統(tǒng)的分子診斷方法顯得很無(wú)力，這是因?yàn)樵诖祟惢蜃儺悩悠分?，含有大量的野生型背景，從而為鑒別這些重要基因是否發(fā)生后果嚴(yán)重的變異帶來(lái)巨大麻煩。本發(fā)明旨在解決在大量野生型背景下，變異基因檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)方法和試劑盒，為腫瘤患者和病原微生物感染者提供可選的、有效的診斷手段。本發(fā)明在ARMS-PCR基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)新一代檢測(cè)方法，與ARMS-PCR/Scorpion系統(tǒng)比較，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)具體為I.野生型背景是突變型1000倍以上，仍然可以檢出突變型；2.本方法可與實(shí)時(shí)熒光PCR、PCR-ELISA、PCR-反向分子雜交、PCR-基因芯片分析等技術(shù)聯(lián)合，用于分子診斷領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明屬于分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種全新的、高效易控的PCR引物設(shè)計(jì)方法，以及利用該方法設(shè)計(jì)引物參與的癌癥基因檢測(cè)試劑盒和耐藥基因檢測(cè)試劑盒，利用該方法生產(chǎn)的試劑盒靈敏度高、重復(fù)性好，非常穩(wěn)定可靠，適用于臨床癌癥基因檢測(cè)和篩查，以及耐藥基因的檢測(cè)。本發(fā)明包含三項(xiàng)相互獨(dú)立而又關(guān)聯(lián)的內(nèi)容1. 一種用于基因變異的PCR引物設(shè)計(jì)方法，其特點(diǎn)是易于設(shè)計(jì)，可控性高且擴(kuò)增靈敏度高；2.提供了一種全新的基因變異檢測(cè)試劑盒的設(shè)計(jì)理念；3.利用I和2所述內(nèi)容開(kāi)發(fā)的基因變異檢測(cè)試劑盒，該試劑盒與傳統(tǒng)測(cè)序檢測(cè)基因變異比較，具有靈敏度高(100倍以上)、特異性強(qiáng)、時(shí)間短(3小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè))、操作步驟少的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的基因變異的PCR引物設(shè)計(jì)方法，其特征在于ARMS-PCR引物設(shè)計(jì)中，在通用引物中附加一段與基因變異區(qū)域的野生型完全互補(bǔ)序列，該序列在PCR退火時(shí)，會(huì)優(yōu)于針對(duì)變異基因設(shè)計(jì)的變異基因檢測(cè)引物退火到野生型上。本發(fā)明的最終目的是通過(guò)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增目標(biāo)序列，并用測(cè)序方法檢測(cè)K-ras密碼子12/13和61的突變情況，結(jié)合兩者突變的情況，指導(dǎo)腫瘤患者對(duì)易瑞沙、特羅凱等藥物的治療。根據(jù)本發(fā)明的基因變異檢測(cè)PCR引物設(shè)計(jì)方法，其特征在于通用引物可以引導(dǎo)一個(gè)DNA鏈合成，當(dāng)此次合成DNA鏈野生型時(shí)，“變性一退火”后，可發(fā)生自身引導(dǎo)合成的DNA鏈內(nèi)折疊，阻礙變異引物與野生型模板結(jié)合，稱之為阻遏ARMS-PCR系統(tǒng)。在此阻遏ARMS-PCR系統(tǒng)中，通用引物的5’端附加一段與變異引物高度同源、但與變異基因的野生型完全互補(bǔ)的寡核苷酸序列(見(jiàn)圖2)，該序列在分子內(nèi)優(yōu)先與變異基因的野生型結(jié)合，從而抑制或阻礙了變異引物與野生型結(jié)合的幾率(見(jiàn)圖3)，解決了變異引物特異性問(wèn)題，從而極大的提高了變異弓I物的靈敏度。具體而言,如圖2所不,本發(fā)明的通用引物分為A、B兩部分，B部分為正常的PCR引物，A部分為與變異引物C相互競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)的寡核苷酸序列。通用引物B段與野生型模板D段和突變型模板F段完全互補(bǔ)，是PCR合成的一個(gè)引導(dǎo)鏈；變異引物C與突變型模板G’完全互補(bǔ)，是PCR合成的另一個(gè)引導(dǎo)鏈。H與H’區(qū)是設(shè)計(jì)熒光探針和雜交探針的位置；E和E’是野生型發(fā)生基因變異的位置。G和G’是E和E’發(fā)生基因變異的新序列。在適當(dāng)?shù)臈l件下，A部分與野生型E’結(jié)合效率高于變異引物C ;變異引物C更易于G’結(jié)合。特別是，反應(yīng)完成第I個(gè)循環(huán)后(如圖3所示)，通用引物合成的野生型DNA鏈在“變性一退火”過(guò)程中，會(huì)自動(dòng)形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，從而屏蔽掉變異引物的結(jié)合位點(diǎn)。此類分子內(nèi)折疊的效率通常比分子間結(jié)合效率高10倍以上，因此能取得較好的屏蔽效果。本發(fā)明公開(kāi)的引物設(shè)計(jì)方法中引物設(shè)計(jì)參照通用的引物設(shè)計(jì)原則不允許引物間或/和引物內(nèi)3’端出現(xiàn)5個(gè)以上堿基互補(bǔ)；變異引物的長(zhǎng)度在15bp 25bp之間，退火溫度(用軟件Primer Express 3. O計(jì)算)在42攝氏度 60攝氏度之間；優(yōu)選變異引物的長(zhǎng)度在16bp 22bp之間,退火溫度(用軟件Primer Express 3. O計(jì)算)在48攝氏度 52攝氏度之間；通用引物B區(qū)的長(zhǎng)度在15bp 25bp之間,退火溫度(用軟件Primer Express3. O計(jì)算)在42攝氏度 60攝氏度之間；優(yōu)選通用引物B區(qū)的長(zhǎng)度在16bp 20bp之間，退火溫度(用軟件Primer Express 3. O計(jì)算)在48攝氏度 52攝氏度之間；通用引物A區(qū)的長(zhǎng)度在IObp 18bp之間,退火溫度(用軟件Primer Express 3. O計(jì)算)在37攝氏度 55攝氏度之間；可能發(fā)生變異的區(qū)域設(shè)計(jì)在通用引物A區(qū)的較中間的位置。 依據(jù)本發(fā)明的引物設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)的引物，可用于實(shí)時(shí)熒光PCR、PCR_ELISA、PCR-反向分子雜交、PCR-基因芯片分析等實(shí)驗(yàn)中。與其他方法聯(lián)用，可開(kāi)發(fā)多種基因變異檢測(cè)試劑盒。根據(jù)上述方法，本發(fā)明可以與實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)設(shè)計(jì)各種用于基因變異(癌癥基因、耐藥突變等)檢測(cè)PCR試劑盒，其中包括dNTPs、二價(jià)陽(yáng)離子、耐熱DNA聚合酶、緩沖體系、引物、探針等常規(guī)試劑，其特征在于、耐熱DNA聚合酶使用量為(O. 5 1)U/測(cè)試、二價(jià)陽(yáng)離子濃度在(O. 5 I. 5)mM、KCl濃度為30 50mM、引物和探針各IOP/測(cè)試、10% Gly0PCR循環(huán)參數(shù)中退火溫度要高于變異引物Tm值10攝氏度 15攝氏度，保證變異引物的嚴(yán)謹(jǐn)性和封閉的效果。上述方法或應(yīng)用，優(yōu)先用于K-ras基因突變、EGFR外顯子18 20基因變異、Braf基因突變等的分子診斷。上述方法或應(yīng)用，也優(yōu)先用于HBV耐藥、HIV耐藥、TB耐藥等的分子診斷。


圖I是通用ARMS-PCR工作原理；圖2是本發(fā)明中阻遏ARMS-PCR中弓丨物設(shè)計(jì)原理；圖3是阻遏ARMS-PCR工作原理。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例I 一種鑒定K-ras密碼子12/13突變情況的方法
I.提取腫瘤患者組織基因組DNA ;2.進(jìn)行PCR擴(kuò)增，20 μ I PCR反應(yīng)體系如下待測(cè)腫瘤組織基因組DNA50 lOOng，Taq 酶 O. 125μ 1，上下游引物和探針(10 μ Μ)各 1μ 1，dNTP (2. 5mM) 2 μ 1，10XPCR 緩沖液(含Mg2+) 1.5 μ 1，甘油10%，余下為無(wú)菌蒸餾水；PCR反應(yīng)條件為95°C變性5min，隨后95°C變性10sec，58°C退火延伸35sec，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，最后37°C延伸Imin ;在58°C進(jìn)行熒光信號(hào)收集。3. PCR結(jié)果分析a. CT < 40，判定為陽(yáng)性；
d. CT > 40，判定為陰性。
權(quán)利要求
1.ー種用于檢測(cè)基因變異的PCR引物設(shè)計(jì)方法，具體為在基因高度同源和保守的區(qū)域設(shè)計(jì)正向PCR通用引物，此通用引物的5’端附加一段與基因變異區(qū)域野生型完全互補(bǔ)的6 20個(gè)堿基的寡核苷酸；在變異基因的位置設(shè)計(jì)與變異基因完全互補(bǔ)的反向引物。
2.如權(quán)利要求I所述，正向PCR通用引物所附加的寡核苷酸更優(yōu)選擇為8 15個(gè)堿基。
3.如權(quán)利要求1、2所述，本方法可與現(xiàn)行用于臨床檢驗(yàn)的其它技術(shù)聯(lián)合使用，這些技術(shù)包括但不限于實(shí)時(shí)熒光PCR、PCR-ELISA、PCR-反向分子雜交、PCR-基因芯片分析等。
4.如權(quán)利要求1-3所述的應(yīng)用，本方法適用于人癌癥基因、耐藥基因的檢測(cè)，癌癥基因包括但不限于EGFR 18密碼子的突變基因(突變類型包括G719A、G719S、G719C)、EGFR19密碼子的基因變異(基因變異類型包括2235-2249del、2235-2252 > AAT (complex)、2236-2253del、2237-2251del、2237-2254del、2237-2255 > T(complex)、2236_2250del、2238-2255del、2238-2248> GC(complex),2238-2252 > GCA(complex)、2239_2247del、2239-2253del、2239-2256del、2239-2248delTTAAGAGAAG> C(complex),2239-2258 >CA (complex)、2240-2251del、2240-2257del、2240-2254del、2239_2251 > C(complex)),EGFR 20密碼子的基因變異(基因變異類型包括T790M、S768I、2307_2308ins9、2319-2320ins CAC、2310_2311insGGT)、EGFR 21密碼子的基因變異(基因變異類型包括 L858R、L861Q)、K-ras 12 密碼子突變(Glyl2Asp (GGT > GAT)、Glyl2Ala(GGT > GCT)、Glyl2Val (GGT > GTT)、Glyl2Ser (GGT > AGT)、Glyl2Arg (GGT > CGT)、Glyl2Cys (GGT> TGT))、K-ras 13 密碼子突變(Glyl3Asp (GGC > GAC))、K-ras 61 密碼子突變(Gln61Lys(CAA > AAA)、Gln61Lys(CAA > AAA)、Gln61Arg(CAA > CGA)、Gln61His(CAA >CAT)、Gln61Leu(CAA > TTA))、B-raf基因突變(基因變異類型包括V600E);耐藥基因包括但不限于HBV拉咪呋啶耐藥、TB利福平耐藥、TB異煙肼耐藥、TBこ胺丁醇耐藥等。
5.ー種PCR擴(kuò)增試劑盒，其中包括dNTP、Mg2+、Taq DNA聚合酶、Tris-KCl體系、引物，其特征在干對(duì)于野生型的擴(kuò)增，其中所述正向通用引物附加寡核苷酸優(yōu)于反向引物與野生型模板結(jié)合而阻止野生型擴(kuò)增；對(duì)于突變型的擴(kuò)增，由于所述正向通用引物附加寡核苷酸與之不完全配對(duì)，因此反向引物可以結(jié)合到突變基因模板上進(jìn)行擴(kuò)增。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種用于檢測(cè)基因變異的PCR引物設(shè)計(jì)方法及試劑盒。根據(jù)本發(fā)明提供的PCR引物設(shè)計(jì)方法，在大量野生型基因存在的情況下，可選擇性擴(kuò)增變異基因的目的片段，從而實(shí)現(xiàn)變異基因的檢測(cè)。該方法解決了傳統(tǒng)測(cè)序方法靈敏度高不足、基因芯片方法非特異性雜交的問(wèn)題，大大提高了變異基因的檢測(cè)靈敏度。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102816834SQ20121006383
公開(kāi)日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月9日
發(fā)明者樓敬偉, 李炳亮 申請(qǐng)人:上海寶藤生物醫(yī)藥科技有限公司