專利名稱：一種鑒定棉花品種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種棉花種子鑒定的試劑的研發(fā)，更具體涉及一種用于棉花種子鑒定的引物組及其試劑盒，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
棉花是紡織工業(yè)的主要原料。我國棉花年產(chǎn)量在500萬噸左右，價值量在750億元左右，是僅次于糧食的第二大農(nóng)作物，全國有2億多農(nóng)民直接參與棉花的生產(chǎn)。紡織業(yè)產(chǎn)業(yè)鏈長，目前我國纖維加工量已占世界的48%。近年來，石油價格上漲推高了化纖成本，促使紡織企業(yè)提高用棉比例，棉花和化纖的比例已達到I : I。隨著全球經(jīng)濟的復(fù)蘇，紡織品需求上升，國內(nèi)棉花需求還將保持增長態(tài)勢。 新疆棉花基地的戰(zhàn)略地位十分重要，其作用不可替代。新疆是我國最大的優(yōu)質(zhì)棉、商品棉生產(chǎn)基地和出口基地，棉花總產(chǎn)、單產(chǎn)、種植面積已連續(xù)18年穩(wěn)居全國首位，棉花產(chǎn)量占全國總產(chǎn)量的40%。棉花是新疆經(jīng)濟支柱產(chǎn)業(yè)，原棉產(chǎn)值達到300億元，占全疆種植業(yè)產(chǎn)值的65%和農(nóng)林牧漁業(yè)總產(chǎn)值的1/3 ;棉花收入占全區(qū)農(nóng)民收入的35%，占南疆主產(chǎn)區(qū)農(nóng)民收入的60% ;棉花加工產(chǎn)值占全疆工業(yè)產(chǎn)值的60-80% ;全疆15%的財政收入、產(chǎn)棉縣50%的財政收入來自棉花及其相關(guān)產(chǎn)業(yè)?！笆晃濉逼陂g，新疆棉花種植面積穩(wěn)定在2100萬畝以上，棉花產(chǎn)量保持在250-300萬噸。2003年以來新疆累計調(diào)出棉花1800多萬噸，超出同期全國棉花進口量200多萬噸；2004至2006年，我國棉花年進口增至364萬噸，進口依存度由28%上升至38% ;2006-2008年新疆年均調(diào)出棉花300萬噸，有力地支持了我國棉紡工業(yè)的高速發(fā)展，也為保持國內(nèi)棉花70%的自給率奠定了基礎(chǔ)。假如沒有新疆棉花的支撐，我國對國際棉花市場的依存度將超過50%以上，棉花產(chǎn)業(yè)將重蹈大豆、油脂產(chǎn)業(yè)的覆轍。新疆棉花發(fā)展?jié)摿Υ?，今后在全國棉花產(chǎn)業(yè)中的地位更加重要。通過優(yōu)化生態(tài)布局，棉花生產(chǎn)形成了北疆早熟棉區(qū)和南疆早中熟棉區(qū)等主產(chǎn)區(qū)。新品種應(yīng)用，在提高單產(chǎn)、改善品質(zhì)方面起到了決定性作用。在栽培上，新疆棉花單產(chǎn)提高主要依靠增加密度，靠大群體提高總鈴數(shù)，實現(xiàn)產(chǎn)量突破。技術(shù)上，推廣矮密早栽培技術(shù)、膜下滴灌技術(shù)、平衡施肥技術(shù)。全區(qū)棉花單產(chǎn)2009年已達到119公斤，比1995年增長33%，高于全國其它地區(qū)平均單產(chǎn)35公斤。其中，兵團平均單產(chǎn)達到155公斤。新疆棉花品質(zhì)好、品級高，平均紗支達到36支，比全國平均紗支水平高4支。近年來，隨著新疆棉花生產(chǎn)的快速發(fā)展，病蟲害日危害加重。新疆棉花生產(chǎn)要求選育適合當(dāng)?shù)孛藁ㄉa(chǎn)發(fā)展，適應(yīng)市場需求的豐產(chǎn)潛力大、穩(wěn)產(chǎn)性好、適應(yīng)性強的新品種。品種研發(fā)滯后，影響棉花核心競爭力提高。進一步拓寬遺傳基礎(chǔ)，加強產(chǎn)量和抗性育種，選育不同纖維類型的高品質(zhì)棉花新品種、實現(xiàn)纖維類型生產(chǎn)多元化有重要意義。目前新疆棉花每年的用種需求量巨大，每年達10萬噸以上。在如此巨大的用種量需求下，生產(chǎn)中假劣偽冒、套牌貼牌種子時有發(fā)生，常給育種家、種子企業(yè)和棉農(nóng)帶來巨大損失，同時這種混亂的局面也不利于種子管理部門的監(jiān)管，為保證新疆棉花生產(chǎn)的正常發(fā)展和種子市場的規(guī)范管理，建立一套行之有效、簡單快速檢測技術(shù)顯得尤為必要。DNA指紋圖譜技術(shù)快速發(fā)展，為品種鑒定、純度檢測、品種親緣關(guān)系與分類研究及品種專利權(quán)的正當(dāng)維護等提供了很好的解決途徑。DNA指紋圖譜是指能夠鑒別生物個體之間差異的DNA電泳圖譜，它是建立在DNA分子標(biāo)記的基礎(chǔ)之上的。這種電泳圖譜多態(tài)性豐富，具有高度的個體特異性和環(huán)境穩(wěn)定性，就象人的指紋一樣，因而被稱為“指紋圖譜”。指紋圖譜是鑒別品種、品系(含雜交親本、自交系)的有力工具，具有快速、準確等優(yōu)點。因此指紋圖譜技術(shù)非常適合于品種資源的鑒定工作。該技術(shù)已在各種作物品種資源和純度鑒定研究中得到應(yīng)用，并發(fā)揮著越來越重要的作用。正是在這樣的市場環(huán)境大背景下，開展新疆棉花品種指紋圖譜技術(shù)的建立與應(yīng)用對解決上述問題具有重要作用。DNA指紋圖譜技術(shù)現(xiàn)狀眾所周知，作物品種資源作為國家的重要戰(zhàn)略資源之一，它是作物高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要基礎(chǔ)，在未來的生命科學(xué)和農(nóng)業(yè)科學(xué)研究領(lǐng)域中將占據(jù)越來越重要的地位(Tanksleyand McCouch，1997)。目前，我國種子生產(chǎn)和經(jīng)營單位管理還不太規(guī)范，不合格種子，甚至假 種屢屢混入市場并用于生產(chǎn)，造成糧食減產(chǎn)，同時也極大地損害了品種專利擁有者的利益和農(nóng)民的經(jīng)濟利益，因此進行品種資源鑒定顯得尤為重要。早期，人們多采用形態(tài)學(xué)方法對品種進行識別，即植物的外部特征特性，如株高、穗長、粒色、干粒重等。該方法簡便、經(jīng)濟，但是由于許多形態(tài)學(xué)性狀鑒定周期長、受環(huán)境影響大(劉勛甲等，1998，湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，
(I)33-35 ； (3) 27-32 ;梁明山等，2001)，并且隨著育種親本的利用集中化，品種鑒定愈來愈困難，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法已越來越不適應(yīng)品種鑒定和純度分析的需要。近年來，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，誕生了一系列DNA分子標(biāo)記技術(shù)，如限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,簡稱 RFLP)、隨機擴增多態(tài)性DNA (random amplified polymorphic DNA,簡稱RAPD)、擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,簡稱 AFLP)、簡單序列長度多態(tài)性(simple sequence length polymorphism,簡稱 SSLP)、隨機擴增微衛(wèi)星多態(tài)性(randomamplified micro-satellitepolymorphism,簡稱 RAMP)、序列標(biāo)簽位點(sequence-taggedsites,簡稱 STS)、DNA 擴增指紋(DNA amplified f ingerprinting, DAF)、擴增子長度多態(tài)性(amplicon length polymorphism,簡稱 ALP)、特異擴增子多態(tài)性(specificampiliconpolymorphism,簡稱 SAP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(singlestrand conformationpolymorphism,簡稱 SSCP)和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,簡稱SNPs)等(李梅芳和周開達，2001 ;鄒喻蘋和葛頌，2003 ;王忠華，2005)。與上述形態(tài)標(biāo)記相比，DNA分子標(biāo)記具有以下多種優(yōu)點(I)直接以遺傳物質(zhì)DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的不同組織和發(fā)育時期均可檢測到，受季節(jié)和環(huán)境的影響較少；(2)數(shù)量多、分布廣，遍及整個基因組；(3)多態(tài)性高，自然存在著許多等位變異，不需專門創(chuàng)造特殊的遺傳材料；(4)表現(xiàn)為“中性”，即不影響目標(biāo)性狀的表達，與不良性狀無必然的連鎖；(5)有許多分子標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性(codominance)，能夠鑒別出作物品種或品系的純合基因型與雜合基因型，為育種利用提供極大的便利(賈繼增，1996)。遺傳標(biāo)記主要分為形態(tài)標(biāo)記、細胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記、分子標(biāo)記等四種類型。形態(tài)標(biāo)記形態(tài)標(biāo)記是一種外部形態(tài)特征，如矮桿、變態(tài)葉、雄性不育等。從形態(tài)學(xué)或表型性狀來檢測遺傳變異是最直接也最簡便易行的方法。廣義形態(tài)標(biāo)記包括色素、生理特性、生殖特性抗病蟲性等有關(guān)的標(biāo)記。由于表型和基因型之間存在著基因表達、調(diào)控、個體發(fā)育等復(fù)雜的中間環(huán)節(jié)，如何根據(jù)表型上的差異來反映基因型上的差異就成為形態(tài)學(xué)方法檢測遺傳變異的關(guān)鍵所在。棉花中通常所用的表型性狀包括株高、子葉節(jié)高、主莖茸毛、果枝數(shù)、株型、鈴形、葉形、鈴的大小、葉片裂缺等。形態(tài)標(biāo)記缺點是數(shù)量較少，遺傳表達有時不太穩(wěn)定，易受環(huán)境條件及基因顯隱性的影響。細胞學(xué)標(biāo)記細胞遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，染色體核型(染色體數(shù)目、大小、隨體有無、著絲粒位置等)和帶型(C帶、N帶、G帶等)分析可測定基因所在的染色體及相對位置，也可通過染色體置換等進行基因的定位。染色體數(shù)目的變化(如單體、缺體、三體、四體)和染色體結(jié)構(gòu)的變異(如缺失、易位、倒位、重復(fù)等)也都各有其特定的細胞學(xué)特征，也可作為一種細胞標(biāo)記。顯然，細胞學(xué)標(biāo)記的數(shù)目也很有限。對于染色體數(shù)目相同的物種，用細胞學(xué)標(biāo)記很難區(qū)別。生化標(biāo)記生化標(biāo)記也叫蛋白質(zhì)標(biāo)記，主要包括等位酶和同工酶標(biāo)記。這種類型標(biāo)記不易受環(huán)境影響，能很好的反映遺傳多樣性。但其檢測手段復(fù)雜，數(shù)量有限，不能滿足標(biāo)記輔助選擇的需要。 分子標(biāo)記20世紀80年代以后發(fā)展起來的分子標(biāo)記技術(shù)是以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記。分子標(biāo)記具有遺傳多態(tài)性高、共顯性，信息完整、在基因組中大量存在且均勻分布、選擇中性、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好、信息量大，分析效率高、檢測手段簡單快捷、開發(fā)和使用成本低等特點。因此，分子標(biāo)記技術(shù)自出現(xiàn)以來被廣泛應(yīng)用在作物遺傳育種、植物親緣關(guān)系鑒另O、物種起源演化、遺傳多樣性分析、基因組作圖、基因定位、基因庫構(gòu)建等方面?，F(xiàn)在DNA標(biāo)記技術(shù)已有數(shù)十種，而且技術(shù)本身也被不斷的改進和發(fā)展。根據(jù)分子標(biāo)記產(chǎn)生的特點，通常可以將之分為五類。第一類以Southern雜交技術(shù)為基礎(chǔ)，如限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)。第二類以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，如隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)、序列標(biāo)簽位點(STS)、表達序列標(biāo)簽(EST)、序列特征擴增片段(SCAR)、酶切擴增多態(tài)性(CAP)、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)。第三類以重復(fù)序列為基礎(chǔ)，如簡單序列重復(fù)(SSR)、簡單序列間重復(fù)(ISSR)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)。第四類以單鏈構(gòu)象多態(tài)性為基礎(chǔ)，如單鏈物質(zhì)多態(tài)性(SSCP)。第五類原位雜交技術(shù)(ISH)，包括熒光原位雜交(FISH)、原位雜交(GISH)等。本發(fā)明技術(shù)應(yīng)用情況SSR(simple sequence repeat),簡單序列重復(fù)，又稱微衛(wèi)星 DNA(microsatelliteDNA)，是近幾年在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的第二代分子標(biāo)記。SSR是一種真核生物基因組中普遍存在的重復(fù)序列，重復(fù)序列一般由1-6個堿基組成，重復(fù)次數(shù)在不同物種或同一物種不同基因型之間是高度可變的。這些重復(fù)序列兩端大多是保守的單拷貝序列，因此可以根據(jù)保守序列設(shè)計特異引物，通過PCR技術(shù)將中間的核心重復(fù)序列擴增出來，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析技術(shù)可獲得其長度多態(tài)性(張立榮等，2002)。SSR具有RFLP的所有遺傳學(xué)優(yōu)點，且避免了 RFLP技術(shù)中的使用放射性同位素的缺點，又比RAPD的重復(fù)性和穩(wěn)定性高，因而目前已成為遺傳標(biāo)記中的研究熱點。但是，如何獲得合適的引物組，既能提到種子鑒定的能力，又不過多的增加工作量是本領(lǐng)域亟待解決的技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有鑒定方法周期長，為棉花品種的生產(chǎn)鑒別提供了有力工具，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案本發(fā)明一方面涉及棉花種子鑒定的引物組，其特征在于包括以下60對引物

權(quán)利要求
1.棉花種子鑒定的引物組或試劑，其特征在于包括以下60對引物
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的引物組或試劑，所述的引物組所包括的其它引物不超過15對，優(yōu)選的不超過10對，進一步優(yōu)選的不超過5對，進一步優(yōu)選不含有其它引物對。
3.含有權(quán)利要求I或2所述的引物組的試劑盒，所述試劑盒中任選包括PCR所需的試劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，所述的試劑盒中每個引物對都單獨包裝。
5.權(quán)利要求3或4所述的試劑盒在鑒定棉花種子中的應(yīng)用，所述的棉花種子優(yōu)選是新疆棉花種子，進一步優(yōu)選是新疆陸地棉種子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒定棉花品種的方法，其包括提取待測樣品的DNA，然后使用60對核心引物分別對待測樣品的DNA進行PCR擴增，然后對擴增結(jié)果進行凝膠電泳，將凝膠電泳結(jié)果與標(biāo)準譜圖進行比對以鑒定待測樣品的品種或真?zhèn)?。本發(fā)明的生產(chǎn)鑒別方法為今后生產(chǎn)中發(fā)生的假冒偽劣、套牌冒牌等坑農(nóng)害農(nóng)事件的發(fā)生提供了強有力的鑒別工具，為當(dāng)?shù)胤N子管理部門處理問題種子糾紛提供了可靠方法和技術(shù)保證，極大地保護了棉花育種者、種子生產(chǎn)經(jīng)營單位和廣大棉農(nóng)的生產(chǎn)利益。通過本套核心標(biāo)記進行品種的指紋圖譜進行鑒定，無需再進行分子標(biāo)記的大量篩選，節(jié)約成本和時間，達到事半功倍的效果。
文檔編號C12Q1/68GK102776274SQ20121007696
公開日2012年11月14日 申請日期2012年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月22日
發(fā)明者劉建喜, 華金平, 吐爾遜江, 多力坤, 孫國清, 孫杰, 李雪源, 梁亞軍, 沙紅, 王俊鐸, 艾先濤, 莫明, 鄭巨云, 郭江平, 馬玄, 龔照龍 申請人:艾先濤