一個(gè)棉花黃萎病抗性主效qtl及其連鎖的分子標(biāo)記的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于作物遺傳育種領(lǐng)域，涉及一個(gè)棉花黃萎病抗性主效QTL及其連鎖的 SSR分子標(biāo)記。
【背景技術(shù)】
[0002] 棉纖維是重要的紡織工業(yè)原料，棉花黃萎病是土傳性維管束病害，大范圍發(fā)生嚴(yán) 重影響了棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)，被稱為棉花的"癌癥"。由于氣候環(huán)境變化，棉田長(zhǎng)期連作，棉 種異地頻繁引種等諸多因素影響，黃萎病害爆發(fā)嚴(yán)重，迫切需要發(fā)掘抗黃萎病新基因，培育 抗黃萎病棉花新品種。
[0003] 近年來，通過構(gòu)建分離群體定位了大量的黃萎病抗性相關(guān)QTLs (Bolek et al. 2005 ；Yang et al. 2008 ；ffang et al. 2008 ；Jiang et al. 2009 ；Ning et al. 2013 ；Fang et al. 2013 ；Li et al. 2013 ；Zhang et al. 2014 ；Zhang et al. 2014)〇Zhao et al. (2014) 利用212個(gè)SSRs對(duì)158個(gè)陸地棉種質(zhì)材料開展黃萎病關(guān)聯(lián)分析，共檢測(cè)到42個(gè)黃萎病抗 性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，分布于棉花15條染色體上。同時(shí)比較了四篇關(guān)于黃萎病抗性QTLs定位的文 獻(xiàn)，整合獲得至少60個(gè)黃萎病抗性相關(guān)QTLs，分布于棉花10條染色體上。由于棉花黃萎病 鑒定工作比較困難，比如：對(duì)于暫時(shí)性的分析群體不可能實(shí)現(xiàn)多年多點(diǎn)黃萎病鑒定工作，黃 萎病田間發(fā)病不均勻?qū)е妈b定結(jié)果變異大等。因此明確抗病相關(guān)的穩(wěn)定QTL，通過分子標(biāo)記 輔助選擇（MAS)準(zhǔn)確高效應(yīng)用于育種實(shí)踐非常重要。
[0004] MAS可以將傳統(tǒng)的表型選擇轉(zhuǎn)變?yōu)橹苯舆x擇基因型，從而大大提高選擇效率。 Boleket et al (2005)利用抗黃萎病海島棉Pima S-7品種和感黃萎病品種Acala44配 制了一個(gè)海陸雜交F2群體，用集團(tuán)分離分析方法（BSA法）篩選到三個(gè)SSR標(biāo)記（CM12、 STS1、BNL3147-2)對(duì)黃萎病抗性有較大作用，上述3個(gè)標(biāo)記均位于All染色體上。Yang et al (2008)利用海島棉耐黃萎病品種海7124為母本與新疆棉區(qū)大面積推廣的高感黃萎 病陸地棉品種軍棉1號(hào)為父本配制[(海7124X軍棉1號(hào)）X軍棉1號(hào)]BC 1分離群體， 構(gòu)建了一張含205個(gè)位點(diǎn)，35個(gè)連鎖群，覆蓋1772. 5cM的遺傳圖譜，標(biāo)記間的平均間距為 8. 65cM，其中33個(gè)連鎖群定位到相應(yīng)的26條染色體上。以96個(gè)BC1S2家系分別種植在新 疆和江蘇南京兩地，接種BP2，VD8和592等3個(gè)不同致病力的黃萎病菌株，調(diào)查葉片和劈桿 兩個(gè)時(shí)期各家系抗感黃萎病表現(xiàn)，開展抗病QTLs的篩選工作，共檢測(cè)到13個(gè)黃萎病抗性相 關(guān)QTLs，其中Dll染色體上共檢測(cè)到兩個(gè)QTLs，一個(gè)為（qVV-Dll-lBC^VDS)，標(biāo)記區(qū)間為 隱服43-隱仍481，解釋的表型變異率為12.2%;另一個(gè)為（9"-011-18(^ 2592)，標(biāo)記區(qū)間為 隱瓜640-813279，解釋的表型變異率為22.3%。推測(cè)第一個(gè)011與8〇161?^6七31(2005) 鑒定到的對(duì)黃萎病抗性有較大的影響的三個(gè)SSR標(biāo)記之一 BNL3147-2是位于部分同源群上 的同一個(gè)QTL。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一個(gè)新的棉花高抗黃萎病的主效QTL位點(diǎn)。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供該棉花高抗黃萎病的主效QTL位點(diǎn)的分子標(biāo)記。
[0007] 本發(fā)明的又一目的是提供該主效QTL位點(diǎn)及其分子標(biāo)記的引物。
[0008] 本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0009] -個(gè)棉花高抗黃萎病的主效QTL位點(diǎn)qVV-Dll-Ι，位于棉花Dll染色體上，在海 島棉耐黃萎病品種海7124和新疆棉區(qū)大面積推廣的高感黃萎病陸地棉品種軍棉1號(hào)配制 的回交群體[軍棉1號(hào)X (海7124X軍棉1號(hào)UBC1S2家系接種黃萎病菌592及VD8,成 株期調(diào)查維管束發(fā)病結(jié)果，檢測(cè)到一個(gè)抗病主效QTL，解釋13. 23-13. 25%的表型變異。有 以下 6 個(gè) SSR 標(biāo)記與之緊密連鎖，分別是：SSR/NAU6593, SSR/NAU6697, SSR/NAU6675, SSR/ NAU6520, SSR/NAU6530,和SSR/NAU6431。各分子標(biāo)記的引物及擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度如下：
[0010] SSR/NAU6593的正向引物序列為SEQ ID NO. 1，反向引物序列為SEQ ID NO. 2,在耐 黃萎病品種海7124中可擴(kuò)增出長(zhǎng)度為280bp的DNA片段；
[0011] SSR/NAU6697的正向引物序列為SEQ ID NO. 3,反向引物序列為SEQ ID NO. 4,在耐 黃萎病品種海7124中可擴(kuò)增出長(zhǎng)度為200bp的DNA片段；
[0012] SSR/NAU6675的正向引物序列為SEQ ID NO. 5,反向引物序列為SEQ ID NO. 6,在耐 黃萎病品種海7124中可擴(kuò)增出長(zhǎng)度為320bp的DNA片段；
[0013] SSR/NAU6520的正向引物序列為SEQ ID NO. 7,反向引物序列為SEQ ID NO. 8,在耐 黃萎病品種海7124中可擴(kuò)增出長(zhǎng)度為310bp的DNA片段；
[0014] SSR/NAU6530的正向引物序列為SEQ ID NO. 9,反向引物序列為SEQ ID NO. 10,在 耐黃萎病品種海7124中可擴(kuò)增出長(zhǎng)度為350bp的DNA片段；
[0015] SSR/NAU6431的正向引物序列為SEQ ID NO. 11，反向引物序列為SEQ ID NO. 12,在 耐黃萎病品種海7124中可擴(kuò)增出長(zhǎng)度為420bp的DNA片段。
[0016] 上述棉花黃萎病抗性基因主效QTL位點(diǎn)，是通過以下方法進(jìn)行標(biāo)記定位的：
[0017] Yang et al (2008)用抗黃萎病海島棉品種海7124和感黃萎病陸地棉品種軍棉1 號(hào)配制雜交組合，用F1單株與軍棉1號(hào)回交得到含有96個(gè)單株的BC i群體，自交產(chǎn)生BC & 家系。用BC1群體構(gòu)建了一張含有204個(gè)SSR位點(diǎn)，全長(zhǎng)1772. 54cM，標(biāo)記間平均距離是 8. 65cM的海陸遺傳圖譜。對(duì)BC1S2家系接種黃萎病菌BP2，VD8,和592,在成株期調(diào)查群體的 發(fā)病情況，用復(fù)合區(qū)間作圖法進(jìn)行抗病QTL的檢測(cè)，結(jié)果在Dl 1染色體上檢測(cè)到2個(gè)QTL，一 個(gè)為（Qw-DII-IBC1S2VDS)，標(biāo)記區(qū)間為NAU643-NAU3481，解釋的表型變異率為12. 2% ;另 一個(gè)為（ανν-?11-1Β(^2592)，標(biāo)記區(qū)間為NAU1640-BNL3279,解釋的表型變異率為22. 3%。 同時(shí)，Guo et al. (2008)等人根據(jù)陸地棉Maxxa的142個(gè)BAC序列開發(fā)出578對(duì)SSR引物， 并利用這些引物開展海陸種間遺傳圖譜的加密工作，將70個(gè)BACs的166個(gè)多態(tài)位點(diǎn)錨定 到對(duì)應(yīng)的染色體。
[0018] 為了更加準(zhǔn)確定位位于棉花Dll染色體上的抗黃萎病QTL，我們利用Guo et al. (2008)定位在Dll染色體上，在海島棉和陸地棉種間表現(xiàn)差異的23個(gè)多態(tài)位點(diǎn)（源于 11個(gè)BAC克?。?duì)應(yīng)的SSR引物，在海7124和軍棉1號(hào)兩個(gè)親本間進(jìn)行多態(tài)性篩選，利用 多態(tài)性引物對(duì)群體中每個(gè)BC 1單株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，完成基因型鑒定工作，利用 遺傳作圖軟件J〇inMap3. 0構(gòu)建遺傳連鎖圖譜；對(duì)分別種植在新疆和江蘇的BC1S2家系接種 BP2, VD8和592等3個(gè)不同致病力的黃萎病菌株，在葉片和成株劈桿兩個(gè)時(shí)期進(jìn)行黃萎病 發(fā)病鑒定，開展抗病QTLs的篩選。利用Windows QTL Cartographer 2. 5軟件，采用復(fù)合區(qū) 間作圖法（Composite interval mapping)，LR 閾值為 11. 5 (相當(dāng)于 LOD 值 2· 5)，1000 次測(cè) 驗(yàn)分析陸地棉黃萎病抗性的QTL。研宄結(jié)果所述如下：
[0019] ①、選用Guo et al. (2008)發(fā)表的Dll染色體上海陸種間23個(gè)多態(tài)位點(diǎn)（源于 11個(gè)BAC克隆）相對(duì)應(yīng)的SSR引物，在海7124和軍棉1號(hào)兩個(gè)親本間進(jìn)行多態(tài)性篩選，共 得到多態(tài)位點(diǎn)16個(gè)。與Yang et al (2008)建圖數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，整合后的Dll染色體上位 點(diǎn)數(shù)由15個(gè)增加到31，連鎖群長(zhǎng)度由96. 4cM增加到115. 107cM，標(biāo)記間平均距離由6. 43cM 減小到3. 71cM。
[0020] ②、基于BC1S2家系在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦試驗(yàn)站和新疆石河子大學(xué)兩環(huán)境，利用3 個(gè)不同的黃萎病菌株（BP2, VD8和592)分別接種，在葉片和劈桿兩個(gè)時(shí)期進(jìn)行黃萎病抗性 鑒定，開展抗病QTLs的篩選工作。利用復(fù)合區(qū)間作圖法對(duì)黃萎病抗性QTL進(jìn)行篩選。研宄 表明：在種植于新疆石河子大學(xué)的[(海7124X軍棉1號(hào)）X軍棉1號(hào)]BC 1S2家系接種黃 萎病菌592及種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)的[(海7124X軍棉1號(hào)）X軍棉1號(hào)]BC 1S2家系接種 黃萎病菌VD8成株期劈桿調(diào)查結(jié)果中，棉花Dll染色體上檢測(cè)到一個(gè)與黃萎病抗性相關(guān)的 主效〇11(9"-〇11-1)，標(biāo)記區(qū)間為隱服593-隱服431，解釋13.23-13.25%的表型變異（圖 1)。與該QTL緊密連鎖的SSR分子標(biāo)記有6個(gè)，分別是：SSR/NAU6593, SSR/NAU6697, SSR/ NAU6675, SSR/NAU6520, SSR/NAU6530,和 SSR/NAU6431。因此，該目標(biāo) QTL 是一個(gè)抗黃萎病 的主效QTL。該QTL與已經(jīng)公布的位于Dll染色體上的抗性QTL(Yang et al 2008)所在區(qū) 間不同，是一個(gè)新的抗病QT