專利名稱：一種促進(jìn)綿羊卵母細(xì)胞體外發(fā)育的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及促進(jìn)綿羊卵母細(xì)胞的體外發(fā)育，采用腺苷酸環(huán)化酶激活劑Forskolin (FSK)、憐酸二酷酶抑制劑cilostamide (CIL)和3-異丁基-I-甲基黃嘿呤
3-isobutyl-l-methylxanthine (IBMX),聯(lián)合對綿羊卵母細(xì)胞進(jìn)行處理,能顯著提高其體外發(fā)育能力。
背景技術(shù)：
在畜牧業(yè)上利用體外受精技術(shù)能以工廠化的形式批量生產(chǎn)試管胚胎，從而為家畜胚胎移植提供更多的高質(zhì)量的胚胎，促進(jìn)家畜良種化。體外受精技術(shù)主要包含卵母細(xì)胞體外成熟、精子獲能受精、胚胎體外培養(yǎng)三個(gè)環(huán)節(jié)。對于哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞而言，高濃度的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)能使減數(shù)分裂受到抑制，從而抑制卵母細(xì)胞的核成熟，為細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)同步成熟創(chuàng)造時(shí)間，進(jìn)而能提高卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量。FSK能刺激腺苷酸環(huán)化酶(adenylyl cyclase)的活性,從而升高細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平。IBMX和CIL都屬于磷酸二酯酶抑制劑，它們通過減少cAMP的降解來提高cAMP濃度。文獻(xiàn)檢索披露1.Biology of reproduction, 65 (2001), 1444 - 1451,作者:FJ Richard等發(fā)表的《3A型磷酸二酯酶在鼠卵母細(xì)胞成熟中的作用》，通過對不同階段卵母細(xì)胞檢測，研究了 3A型磷酸二酯酶在鼠卵母細(xì)胞中的性質(zhì)和表達(dá)規(guī)律。2. MolecularReproduction and Development, 70, 3 (2005) , 361-372,作者M(jìn)F Laforest 等發(fā)表的《特異性磷酸二酯酶對豬卵母細(xì)胞自發(fā)減數(shù)分裂恢復(fù)控制的重要意義》研究中得出，CIL和IBMX能可逆性地阻滯減數(shù)分裂的恢復(fù)。3. Human Reproduction, 23, 3 (2008)，504-513，作者Yi-min Shu等發(fā)表的《cilostamide和forskolin對人未成熟卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)和胚胎發(fā)育的影響》中指出，聯(lián)合使用CIL和FSK能通過阻止縫隙連接通訊丟失和恢復(fù)減數(shù)分裂的協(xié)同效應(yīng)，影響人卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。4. Human Reproduction, 25，12 (2010),2999-3011，作者F. K. Albuz等發(fā)表的《卵母細(xì)胞成熟的生理模型一種能顯著提高胚胎生產(chǎn)和妊娠結(jié)果的新的體外成熟系統(tǒng)》文章，得出，成熟前的牛、鼠卵母細(xì)胞使用SPOM系統(tǒng)，能增加卵母細(xì)胞-卵丘細(xì)胞復(fù)合體間的縫隙連接，減緩減數(shù)分裂進(jìn)程，能顯著提高牛卵母細(xì)胞體外受精囊胚率和囊胚質(zhì)量，顯著提高小鼠囊胚率、移植受胎率和胎兒出生率。國內(nèi)有1999年7卷3期《農(nóng)業(yè)生物技術(shù)》上陳勇等人發(fā)表的《Forskolin對昆明白小鼠卵母細(xì)胞體外成熟及卵丘擴(kuò)展的影響》、2007年12卷5期《中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)》上卜淑敏等人發(fā)表的《3種磷酸二醋酶對小鼠卵母細(xì)胞自發(fā)成熟的影響》等等。上述已有方法用于牛和鼠、豬，但很少有用于提高綿羊卵母細(xì)胞發(fā)育能力的報(bào)道。本發(fā)明以此為切入點(diǎn)，展開的研究方法具有科學(xué)性與實(shí)踐性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于使用三種試劑促進(jìn)綿羊卵母細(xì)胞體外發(fā)育的方法，能顯著提高體外受精效率，將該方法用于良種繁育，將縮短育種時(shí)代間隔，顯著降低生產(chǎn)成本。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種促進(jìn)綿羊卵母細(xì)胞體外發(fā)育的方法，采用腺苷酸環(huán)化酶激活劑，即為FSK，磷酸二酯酶抑制劑，即為CIL，3-異丁基-I-甲基黃嘌呤，即為IBMX,聯(lián)合對綿羊卵母細(xì)胞進(jìn)行處理，提高其體外發(fā)育能力，其步驟為
其I摘取宰殺30分鐘內(nèi)的綿羊卵巢，置入溫度在30-35°C，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml鏈霉素的生理鹽水中，3小時(shí)內(nèi)用其生理鹽水清洗3-4次；吸有Iml加有100μ Mol/L的FSK和500 μ Mol/L IBMX的抽卵液，帶有9號針頭的IOml注射器，抽吸卵巢表面2-8mm大小的卵泡，將注射器內(nèi)回收的卵泡液打在35_60mm的皿內(nèi)；
其2在顯微鏡下?lián)斐雎涯讣?xì)胞，放置在抽卵液中2小時(shí)，用含有20 μ Mol/L CIL的體外成熟液洗滌3次，置于CO2箱，在5% CO2,95%空氣、溫度為38. 6°C條件下培養(yǎng)2小時(shí)；再用 不含CIL的體外成熟液洗滌3次，置于CO2箱培養(yǎng)22-24小時(shí)；用體外受精液洗滌2_4次，按25-30枚/滴的密度加入2小時(shí)前平衡好的50-70 μ I的體外受精液滴內(nèi)；
其3用水浴解凍精液，移入2小時(shí)前平衡好的裝有體外受精液的試管內(nèi)，放入CO2箱，上游20-25分鐘，取上清，以1500轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速，離心4-5分鐘棄去上清液，按2_4X IO6個(gè)/ml的密度加入體外受精液滴，與卵母細(xì)胞共同孵育；
其4將受精22-24小時(shí)的卵取出，移至平衡好的體外培養(yǎng)液內(nèi)，洗滌3-4次，按50-70枚/孔的密度移入平衡好的500μ I/孔的體外培養(yǎng)液的四孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，24小時(shí)后統(tǒng)計(jì)卵裂率，168小時(shí)后統(tǒng)計(jì)囊胚率；將囊胚放在Hochest33342中平衡10分鐘，載玻片上壓片，在紫外光激發(fā)器作用下統(tǒng)計(jì)囊胚細(xì)胞數(shù)；
其中實(shí)驗(yàn)液體的配制
抽卵液TCM199-h印es+lmg/mlPVA+0· 7 mg / ml 肝素鈉+100 μ Mol/L FSK+500 μ Mol/L IBMX ；
含 CIL 的體外成熟液TCM199-HC03 十 10%FBS 十 0. 05IU/ml FSH 十 0. 05IU/ml LH十 I μ g/ml 雌二醇 + 24. 2 μ g/ml 丙麗酸納 +0. ImM/L 半胱氨酸 +10ng/ml EGF+20 μ Mol/LCIL +100IU/ml 青霉素 +100IU/ml 鏈霉素；
不含 CIL 的體外成熟液TCM199-HC03 十 10%FBS 十 0. 05IU/ml FSH 十 0. 05IU/ml LH十 I μ g/ml 雌二醇 + 24. 2 μ g/ml 丙麗酸納 +0. ImM/L 半胱;氛酸 +10ng/ml EGF+100IU/ml 青霉素+100IU/ml鏈霉素；
SOF 6.29mg/ml NaCL +0. 534 mg/ml KCL+0. 162 mg/ml KH2P04+0. 6ul/ml 乳酸鈉+0. 089mg/mlMgS04+2. lmg/mlNaHC03+0 . 0 3 5 7mg/ml 丙酮酸鈉 +0. 299mg/mlCaCL2 · 2H20 ；
體外受精液S0F+20%FBS+6IU/ml肝素鈉+100IU/ml慶大霉素；
體外培養(yǎng)液S0F+3mg/mlBSA。所述的方法，所用腺苷酸環(huán)化酶激活劑，磷酸二酯酶抑制劑，3-異丁基-I-甲基黃嘌呤，Hochest33342為SIGMA公司生產(chǎn)。本發(fā)明采用三種試劑促進(jìn)綿羊卵母細(xì)胞體外發(fā)育的方法，將綿羊卵母細(xì)胞放在含有FSK和IBMX的抽卵液內(nèi)2小時(shí)，用含有CIL的體外成熟液培養(yǎng)2_4小時(shí)，再用不含有CIL的體外成熟液培養(yǎng)22-24小時(shí),與精子結(jié)合實(shí)施體外受精,24小時(shí)后置于體外培養(yǎng)液中培養(yǎng)，48小時(shí)后統(tǒng)計(jì)卵裂率，168小時(shí)后統(tǒng)計(jì)囊胚率和囊胚細(xì)胞數(shù)；彰顯技術(shù)進(jìn)步。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例摘取宰殺30分鐘內(nèi)的綿羊卵巢，置入溫度在30°C，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml鏈霉素的生理鹽水中，3小時(shí)內(nèi)用生理鹽水清洗4次；在吸有Iml加有100μ Mol/L的FSK和500 μ Mol/L IBMX的抽卵液，帶有9號針頭的IOml注射器抽吸卵巢表面6mm大小的卵泡，將注射器內(nèi)回收的卵泡液打在60_的皿內(nèi)，在顯微鏡下?lián)斐雎涯讣?xì)胞，放置在抽卵液中2小時(shí)，用含有20 μ Mol/L CIL的體外成熟液洗滌3次，在CO2箱內(nèi)培養(yǎng)2小時(shí)，CO2箱的氣象條件為5% C02，95%空氣，溫度為38. 6°C。再用不含CIL的體外成熟液洗滌3次，CO2箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)，用體外受精液洗滌4次，按30枚/滴的密度加入2小時(shí)前平衡好的70 μ I的體外受:精液滴內(nèi)；用水浴解凍精液，移入2小時(shí)如平衡好的裝有體外受:精液的試管內(nèi)，放入CO2箱，上游25分鐘，取上清，以1500轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心5分鐘棄去上清液，用剩余的精子沉淀進(jìn)行密度計(jì)算，按4Χ IO6個(gè)/ml的密度加入體外受精液滴，與卵母細(xì)胞共同孵育；將受精24小時(shí)的卵取出，移至平衡好的體外培養(yǎng)液內(nèi)，洗滌4次，按70枚/孔的密度移入平衡好的500 μ I/孔體外培養(yǎng)液的四孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)；24小時(shí)后統(tǒng)計(jì)卵裂率，168小時(shí)后統(tǒng)計(jì)囊胚率；將囊胚放在Hochest33342中平衡10分鐘，載玻片上壓片，在紫外光激發(fā)器作用下統(tǒng)計(jì)囊胚細(xì)胞數(shù)。其中實(shí)驗(yàn)液體的配置
抽卵液TCM199-h印es+lmg/mlPVA+0. 7 mg / ml 肝素鈉+100 μ Mol/L FSK+500 μ Mol/L IBMX ；
含 CIL 的體外成熟液TCM199-HC03 十 10%FBS 十 0. 05IU/ml FSH 十 0. 05IU/ml LH 十I μ g/ml 雌二醇 + 24. 2 μ g/ml 丙麗酸納+0. ImM/L 半月光氛酸+10ng/ml EGF+20 μ Mol/L CIL+100IU/ml 青霉素 +100IU/ml 鏈霉素；
不含 CIL 的體外成熟液TCM199-HC03 十 10%FBS 十 0. 05IU/ml FSH 十 0. 05IU/ml LH十 I μ g/ml 雌二醇 + 24. 2 μ g/ml 丙麗酸納 +0. ImM/L 半胱;氛酸 +10ng/ml EGF+100IU/ml 青霉素+100IU/ml鏈霉素；
SOF 6.29mg/ml NaCL +0. 534 mg/ml KCL+0. 162 mg/ml KH2P04+0. 6ul/ml 乳酸鈉+0. 089mg/mlMgS04+2. lmg/mlNaHC03+0 . 0 3 5 7mg/ml 丙酮酸鈉 +0. 299mg/mlCaCL2 · 2H20 ；
體外受精液S0F+20%FBS+6IU/ml肝素鈉+100IU/ml慶大霉素；
體外培養(yǎng)液S0F+3mg/mlBSA。本發(fā)明的聯(lián)合制劑實(shí)驗(yàn)組與對照組使用結(jié)果驗(yàn)證見下表。
WW I卵裂率I囊胚率I囊胚細(xì)胞數(shù)
實(shí)驗(yàn)組 73·73±5·96Α 41. 24±2· 33Α 187. 17±36· 00a 對照組 |54· 74±6· 78B |33·84±2·87Β | 25· 70±25· 94b _由上表得知，將FSK、IBMX和CIL相結(jié)合，體外受精后的囊胚率和囊胚細(xì)胞數(shù)顯著高于沒有使用這三種試劑的對照組。試驗(yàn)所用腺苷酸環(huán)化酶激活劑Forskolin，即為FSK ;磷酸二酯酶抑制劑cilostamide,即為 CIL ;3_ 異丁基-I-甲基黃嘌 3-isobutyl-l-methy lxanthine,即為、IBMX ；Hochest33342 ;TCM199_h印es、PVA、肝素鈉、TCM199_HC03、FBS, FSH、LH EGF, BSA 皆為SIGMA公司生產(chǎn)。青霉素為江西省科大動(dòng)物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，鏈霉素為陜西驪祥動(dòng)物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，慶大霉素為鄭州羚銳制藥有限公司生產(chǎn)?！?br> 權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)綿羊卵母細(xì)胞體外發(fā)育的方法，其特征在于采用腺苷酸環(huán)化酶激活劑，即為FSK，磷酸二酯酶抑制劑，即為CIL，3-異丁基-I-甲基黃嘌呤，即為IBMX，聯(lián)合對綿羊卵母細(xì)胞進(jìn)行處理，提高其體外發(fā)育能力，其步驟為 其I摘取宰殺30分鐘內(nèi)的綿羊卵巢，置入溫度在30-35°C，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml鏈霉素的生理鹽水中，3小時(shí)內(nèi)用其生理鹽水清洗3_4次；吸有Iml加有100μ Mo I/L的FSK和500 μ Mo I/L IBMX的抽卵液，帶有9號針頭的IOml注射器，抽吸卵巢表面2-8mm大小的卵泡，將注射器內(nèi)回收的卵泡液打在35_60mm的皿內(nèi)； 其2在顯微鏡下?lián)斐雎涯讣?xì)胞，放置在抽卵液中2小時(shí)，用含有20 μ Mol/L CIL的體外成熟液洗滌3次，置于CO2箱，在5% CO2,95%空氣、溫度為38. 6°C條件下培養(yǎng)2小時(shí)；再用不含CIL的體外成熟液洗滌3次，置于CO2箱培養(yǎng)22-24小時(shí)；用體外受精液洗滌2_4次，按25-30枚/滴的密度加入2小時(shí)前平衡好的50-70 μ I的體外受精液滴內(nèi)； 其3用水浴解凍精液，移入2小時(shí)前平衡好的裝有體外受精液的試管內(nèi)，放入CO2箱，上游20-25分鐘，取上清，以1500轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速，離心4-5分鐘棄去上清液，按2_4X IO6個(gè)/ml的密度加入體外受精液滴，與卵母細(xì)胞共同孵育； 其4將受精22-24小時(shí)的卵取出，移至平衡好的體外培養(yǎng)液內(nèi)，洗滌3-4次，按50-70枚/孔的密度移入平衡好的500μ I/孔的體外培養(yǎng)液的四孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，24小時(shí)后統(tǒng)計(jì)卵裂率，168小時(shí)后統(tǒng)計(jì)囊胚率；將囊胚放在Hochest33342中平衡10分鐘，載玻片上壓片，在紫外光激發(fā)器作用下統(tǒng)計(jì)囊胚細(xì)胞數(shù)； 其中實(shí)驗(yàn)液體的配制抽卵液TCM199-h印es+lmg/mlPVA+0· 7 mg / ml 肝素鈉 +100 μ Mol/L FSK+500 μ Mol/L IBMX ； 含 CIL 的體外成熟液TCM199-HC03 十 10%FBS 十 0. 05IU/ml FSH 十 0. 05IU/ml LH十 I μ g/ml 雌二醇 + 24. 2 μ g/ml 丙麗酸納 +0. ImM/L 半胱氨酸 +10ng/ml EGF+20 μ Mol/LCIL +100IU/ml 青霉素 +100IU/ml 鏈霉素； 不含 CIL 的體外成熟液TCM199-HC03 十 10%FBS 十 0. 05IU/ml FSH 十 0. 05IU/ml LH十 I μ g/ml 雌二醇 + 24. 2 μ g/ml 丙麗酸納 +0. ImM/L 半胱;氛酸 +10ng/ml EGF+100IU/ml 青霉素+100IU/ml鏈霉素；SOF 6.29mg/ml NaCL +0. 534 mg/ml KCL+0. 162 mg/ml KH2P04+0. 6ul/ml 乳酸鈉+0. 089mg/mlMgS04+2. lmg/mlNaHC03+0 . 0 3 5 7mg/ml 丙酮酸鈉 +0. 299mg/mlCaCL2 · 2H20 ； 體外受精液S0F+20%FBS+6IU/ml肝素鈉+100IU/ml慶大霉素； 體外培養(yǎng)液S0F+3mg/mlBSA。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所用腺苷酸環(huán)化酶激活劑，磷酸二酯酶抑制劑，3-異丁基-I-甲基黃嘌呤，Hochest33342為SIGMA公司生產(chǎn)。
全文摘要
本發(fā)明提供的一種促進(jìn)綿羊卵母細(xì)胞體外發(fā)育的方法，采用腺苷酸環(huán)化酶激活劑，即為FSK，磷酸二酯酶抑制劑，即為CIL，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，即為IBMX，聯(lián)合對綿羊卵母細(xì)胞進(jìn)行處理，提高其體外發(fā)育能力；具體步驟摘取宰殺綿羊卵巢，置入生理鹽水中清洗3-4次；吸有1ml加有100μmol/L的FSK和500μmol/LIBMX的抽卵液，帶有9號針頭的10ml注射器，抽吸卵巢表面2-8mm大小的卵泡，將注射器內(nèi)回收的卵泡液打在35-60mm的皿內(nèi)；在顯微鏡下?lián)斐雎涯讣?xì)胞，放置在抽卵液中，用含有20μmol/LCIL的體外成熟液洗滌3次，置于CO2箱培養(yǎng)；再用不含CIL的體外成熟液洗滌3次，置于CO2箱培養(yǎng)，加入體外受精液滴內(nèi);用水浴解凍精液，與卵母細(xì)胞共同孵育；24小時(shí)后統(tǒng)計(jì)卵裂率，168小時(shí)后統(tǒng)計(jì)囊胚率。
文檔編號C12N5/075GK102618496SQ201210079810
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月23日
發(fā)明者唐森, 林嘉鵬, 汪立芹, 瑪依拉, 趙云程, 黃俊成 申請人:新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學(xué)院中國-澳大利亞綿羊育種研究中心