專利名稱：源于里氏木霉的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與真菌的生長發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子cDNA及其編碼蛋白，尤其涉及從真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)中所分離、克隆的轉(zhuǎn)錄因子TrTFl cDNA序列及其編碼的蛋白，本發(fā)明還涉及含有該cDNA序列的表達載體以及它們在調(diào)控里氏木霉生長發(fā)育及其抗逆性中的用途，本發(fā)明屬于源于里氏木霉的轉(zhuǎn)錄因子的分離及其應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
里氏木霉(Trichoderma reesei)是一種廣泛存在自然界的嗜溫腐生真菌,第二次世界大戰(zhàn)期間首先從棉帆布中分離出來(Mandels et al.，1957)。里氏木霉可以分泌產(chǎn)生很多酶類，包括纖維素酶、半纖維素酶以及蛋白酶和淀粉酶，尤其是纖維素酶含量很高，分泌的纖維素酶多年來已廣泛應(yīng)用于造紙，釀酒和食品等行業(yè)中(Miettinen-Oinonen et al. , 2002 ；Boer et al. , 2002 ；Cherry et al. , 2003) 近年來，隨著能源危機的加劇，可持續(xù)再生能源的研究成為當今研究熱點。利用可再生的纖維素資源生產(chǎn)生物乙醇 (bioethanol)已成為克服能源危機的有效途徑之一。在生產(chǎn)生物乙醇的流程中，纖維素酶水解纖維素產(chǎn)生葡萄糖是整個過程的至關(guān)重要的一步。因此，里氏木霉作為一種廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)纖維素酶的工業(yè)用菌，國內(nèi)外科研人員在如何提高纖維素酶活性方面做了大量的研究工作。研究中發(fā)現(xiàn)，僅僅通過對菌株的改造和發(fā)酵過程的優(yōu)化不能完全解決纖維素酶活性的問題。要想徹底解決這個問題，必須從根本上了解里氏木霉的整個生長發(fā)育以及纖維素酶的誘導(dǎo)、表達和分泌的整個調(diào)控的過程。近年來，里氏木霉分子生物學(xué)方面的研究進展十分迅速，尤其是在2008年里氏木霉基因組序列的公布，通過對基因組分析、預(yù)測，為更深入的了解里氏木霉整個生長發(fā)育過程奠定了更好的基礎(chǔ)。作為一種廣泛應(yīng)用的工業(yè)菌株，里氏木霉分子水平上的相關(guān)研究大多集中在纖維素酶的誘導(dǎo)表達等方面，單獨從生長發(fā)育角度研究里氏木霉的相關(guān)報道很少。目前已經(jīng)克隆和分析的參與到纖維素酶代謝途徑的基因有如下=ACEl，ACE2，XYRl，CREl，HAP2/3/5復(fù)合體，XYLl，GALl，GNAl，GNA3，PGLl 等(Ilmen et al.，1996 ；Aro et al. ,2001 ；Aro et al.， 2002 ；Mach-Aigner et al. , 2008 ；Stricker et al. , 2006 ；Stricker et al. ,2008 ；Seibel et al. , 2009 ； Schmo 11 et al. , 2009 ； Limon et al. ,2011 等)。由此可見，研究的重點都偏向于直接或者間接的參與纖維素酶代謝途徑的基因，但是纖維素酶的代謝調(diào)控遠不止受到這些基因的調(diào)節(jié)，它受到里氏木霉整個生長發(fā)育過程中其他許多未知的途徑來輔助完成。已知里氏木霉纖維素酶的表達主要是在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控的。已發(fā)現(xiàn)有5個轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子參與到這個過程中，其中XYR1，ACE2，HAP2/3/5復(fù)合體起到正調(diào)控作用，而ACEl和 CREl起到負調(diào)控作用。與此同時，這些基因都還影響著里氏木霉發(fā)育過程的其它方面。因此，發(fā)現(xiàn)和找到新的轉(zhuǎn)錄因子有著重要的意義。鑒定和克隆新的轉(zhuǎn)錄因子，尤其是那些直接或間接與纖維素酶調(diào)控的基因，可以為利用分子手段改造里氏木霉提高纖維素酶產(chǎn)率提供一定的參考。目前，并沒有通過分子生物學(xué)手段改造的里氏木霉菌株直接用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，因此，利用分子生物學(xué)技術(shù)克隆和鑒定新的轉(zhuǎn)錄因子對全面了解里氏木霉的代謝網(wǎng)絡(luò)有著非常重要的意義，也為最終分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一種從里氏木霉(Trichoderma reesei)中所分離、克隆的與其生長發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子cDNA及其編碼蛋白。本發(fā)明目的之二是提供含有上述轉(zhuǎn)錄因子cDNA的表達載體以及含有該表達載體的重組宿主細胞。本發(fā)明目的之三是將所述轉(zhuǎn)錄因子cDNA及其編碼蛋白應(yīng)用于調(diào)控里氏木霉 (Trichoderma reesei)的生長發(fā)育或其抗逆性。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一方面提供了一種從里氏木霉(Trichodermareesei)中所分離的TrTFl轉(zhuǎn)錄因子cDNA，其多核苷酸為(a)、(b)或(c)所示(a)、SEQ ID No. I所示的多核苷酸；(b)、編碼SEQ ID No. 2所示氨基酸的多核苷酸；(c)、與SEQ ID NO 1的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的多核苷酸，該核苷酸所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸為SEQ ID N0:2所示。優(yōu)選的，本發(fā)明所述的從里氏木霉所分離的轉(zhuǎn)錄因子cDNA為SEQ IDNo. I所示的多核苷酸序列。此外,本發(fā)明還提供了里氏木霉(Trichoderma reesei)中所分離的TrTFl轉(zhuǎn)錄因子的全基因，其多核苷酸序列為SEQ ID N0:3所示。本發(fā)明的另一方面是提供由上述轉(zhuǎn)錄因子cDNA所編碼的調(diào)控里氏木霉生長發(fā)育的TrTFl轉(zhuǎn)錄因子，其氨基酸為(a)或(b)所示(a)、SEQ ID No. 2 所示的氨基酸；(b) jfSEQ ID No. 2所示的氨基酸通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或/ 和插入而衍生得到的仍具有SEQ ID No. 2所示轉(zhuǎn)錄因子功能或活性的蛋白變體；優(yōu)選的，本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)錄因子為SEQ ID No. 2所示的氨基酸。所述的“多個”通常意味著2-10個，優(yōu)選為2-6個，更優(yōu)選為2-4個，這取決于轉(zhuǎn)錄因子三維結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的位置或氨基酸的種類；所述的“替換”是指分別用不同的氨基酸殘基取代一個或多個氨基酸殘基；所述的“缺失”是指氨基酸殘基數(shù)量的減少，也即是分別缺少其中的一個或多個氨基酸殘基；所述的“插入”是指氨基酸殘基序列的改變，相對天然分子而言，所述改變導(dǎo)致添加一個或多個氨基酸殘基。本發(fā)明所述的蛋白變體可由遺傳多態(tài)性或人為操作產(chǎn)生，這些操作方法通常為本領(lǐng)域所了解。例如，可通過DNA的突變來制備轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列變體或片段，其中所述誘變或改變多核苷酸的方法為本領(lǐng)域所習(xí)知。保守的取代是將一種氨基酸殘基替換成具有相似性質(zhì)的另一種氨基酸。本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因包括天然存在的序列和變體兩種形式?！白凅w”意指基本相似的序列，對于多核苷酸，變體包含天然多核苷酸中一個或多個位點處一個或多個核苷酸的缺失、插入或/和替換。對于多核苷酸，保守的變體包括由于遺傳密碼的簡3/8頁
并性而不改變編碼的氨基酸序列的那些變體。諸如此類天然存在的變體可通過現(xiàn)有的分子生物學(xué)技術(shù)來鑒定。變體多核苷酸還包括合成來源的多核苷酸，例如采用定點誘變或者是通過重組的方法得到的仍編碼SEQ ID No. 2所示的氨基酸的多核苷酸變體。本發(fā)明中所分離的TrTFl轉(zhuǎn)錄因子基因插入失活后導(dǎo)致里氏木霉產(chǎn)孢量下降、分生孢子梗形態(tài)變化、抵抗外界環(huán)境壓力的能力下降?？梢?，本發(fā)明所分離的TrTFl轉(zhuǎn)錄因子基因與里氏木霉的生長發(fā)育及抗逆敏感性相關(guān)，由此，本發(fā)明的再一方面是提供了一種調(diào)控里氏木霉生長發(fā)育或提高里氏木霉抗逆性的方法，包括將本發(fā)明所分離的轉(zhuǎn)錄因子 cDNA引入到里氏木霉中，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子cDNA表達。本發(fā)明進一步提供了含有所述轉(zhuǎn)錄因子基因的表達載體以及含有該表達載體的宿主細胞。將本發(fā)明所述轉(zhuǎn)錄因子cDNA可操作的與表達調(diào)控元件相連接，得到可以在里氏木霉中表達該基因的表達載體?！翱刹僮鞯倪B接”指兩個或更多個元件之間功能性的連接， 可操作的連接的元件可為鄰接或非鄰接的。該表達載體可以由5'端非編碼區(qū)，SEQ ID No. I所示的核苷酸和3'非編碼區(qū)組成，其中，所述的5'端非編碼區(qū)可以包括啟動子序列、增強子序列或/和翻譯增強序列；所述的3'非編碼區(qū)可以包含終止子序列、mRNA切割序列等。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將SEQ ID No. I所示的核苷酸進行優(yōu)化以增強在里氏木霉中的表達。例如。可采用里氏木霉的偏愛密碼子進行優(yōu)化來合成多核苷酸以增強在里氏木霉中的表達。更進一步的，可以將本發(fā)明所分離的TrTFl轉(zhuǎn)錄因子cDNA多核苷酸序列作為探針應(yīng)用于尋找里氏木霉中其它受TrTFl的調(diào)控基因；此外，還可以本發(fā)明TrTFl轉(zhuǎn)錄因子cDNA所編碼的蛋白為目的蛋白在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索其它真菌中具有相似功能的蛋白，如鐮刀菌(Fusarium oxysporum),小麥赤霉菌 (Gibberella zeae)，米曲霉(Aspergillus oryzae)，黑曲霉(Aspergillus niger)等。本發(fā)明所涉及到的術(shù)語定義除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。雖然在本發(fā)明的實踐或測試中可使用與本文所述者類似或等效的任何方法、裝置和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選方法、裝置和材料。術(shù)語“嚴謹雜交條件”意指在所屬領(lǐng)域中已知的低離子強度和高溫的條件。通常，在嚴謹條件下，探針與其靶序列雜交的可檢測程度比與其它序列雜交的可檢測程度更高(例如超過本底至少2倍。嚴謹雜交條件是序列依賴性的，在不同的環(huán)境條件下將會不同，較長的序列在較高溫度下特異性雜交。通過控制雜交的嚴謹性或洗滌條件可鑒定與探針100%互補的靶序列。對于核酸雜交的詳盡指導(dǎo)可參考有關(guān)文獻(Tijssen， Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes， " Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays. 1993)。更具體的，所述嚴謹條件通常被選擇為低于特異序列在規(guī)定離子強度 PH下的熱熔點(Tm)約5-10°C。TmS在平衡狀態(tài)下50%與目標互補的探針雜交到目標序列時所處的溫度(在指定離子強度、PH和核酸濃度下)(因為目標序列過量存在，所以在^下在平衡狀態(tài)下50%的探針被占據(jù))。嚴謹條件可為以下條件其中在pH 7.0到8.3下鹽濃度低于約I. OM鈉離子濃度，通常為約0. 01到I. OM鈉離子濃度(或其它鹽)，并且溫度對于
5短探針(包括(但不限于)10到50個核苷酸)而言為至少約30°C，而對于長探針(包括 (但不限于)大于50個核苷酸)而言為至少約60°C。嚴謹條件也可通過加入諸如甲酰胺的去穩(wěn)定劑來實現(xiàn)。對于選擇性或特異性雜交而言，正信號可為至少兩倍的背景雜交，視情況為10倍背景雜交。例示性嚴謹雜交條件可如下50%甲酰胺，5\33(和1% SDS，在42°C 下培養(yǎng)；*5XSSC，1% SDS，在65°C下培養(yǎng)，在O. 2XSSC中洗滌和在65°C下于O. 1% SDS中洗滌。所述洗滌可進行5、15、30、60、120分鐘或更長時間。術(shù)語“重組宿主細胞”或“宿主細胞”意指包含本發(fā)明多核苷酸的細胞，而不管使用何種方法進行插入以產(chǎn)生重組宿主細胞，例如直接攝取、轉(zhuǎn)導(dǎo)、f配對或所屬領(lǐng)域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持為例如質(zhì)粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組中。術(shù)語“多核苷酸”意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術(shù)語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結(jié)合特性并以類似于天然產(chǎn)生的核苷酸的方式進行代謝。除非另外特定限制，否則所述術(shù)語也意指寡核苷酸類似物，其包括 PNA(肽核酸)、在反義技術(shù)中所用的DNA類似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(包括(但不限于)簡并密碼子取代)和互補序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產(chǎn)生其中一個或一個以上所選(或所有)密碼子的第3位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現(xiàn)簡并密碼子取代(Batzer 等人,Nucleic Acid Res. 19 :5081(1991) ;0htsuka 等人,J. Biol. Chem. 260 :2605-2608(1985);和 Cassol 等人，(1992) ;Rossolini 等人，Mol Cell. Probes 8 :91-98(1994))。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互換使用以意指氨基酸殘基的聚合物。SP， 針對多肽的描述同樣適用于描述肽和描述蛋白且反之亦然。所述術(shù)語適用于天然產(chǎn)生氨基酸聚合物以及其中一個或一個以上氨基酸殘基為非天然編碼氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述術(shù)語涵蓋任何長度的氨基酸鏈，其包括全長蛋白(即抗原)，其中氨基酸殘基經(jīng)由共價肽鍵連接。


圖I用于T-DNA插入載體構(gòu)建不意圖。圖2T-DNA插入位置示意圖。圖3里氏木霉野生型QM9414 (A和C)和插入突變體ATMT-39 (B和D)菌落形態(tài)圖； 其中，A和B為PDA培養(yǎng)基上圖片，C和D為麗培養(yǎng)基上圖片。圖4普通光學(xué)顯微鏡下的里氏木霉野生型QM9414 (A)和插入突變體ATMT-39 (B) 菌絲形態(tài)圖；圖5里氏木霉野生型QM9414(A)和插入突變體ATMT-39 (B)菌絲形態(tài)掃描電鏡圖。圖6里氏木霉野生型QM9414和插入突變體ATMT-39在不同溫度下生長速率比較圖。圖7里氏木霉野生型QM9414和插入突變體ATMT-39在不同濃度NaCl條件下生長速率比較圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。實施例I適用于真菌ATMT轉(zhuǎn)化的載體pCAMBIA1300-l的構(gòu)建根據(jù)pCB1003 載體(Carroll et al. Fungal Genet. Newslett. (1994)41:22.) 中潮霉素的序列，設(shè)計引物，PCR擴增潮霉素片段，然后將該片段插入到PCAMBIA1300 載體(Chen et al. Appl. Environ. Microbiol. (2000)66 (10) :4510-4513)上構(gòu)建成 PCAMBIA1300-1。具體方法如下首先，采用高保真PCR法，利用pCB1003質(zhì)粒作為模板，擴增潮霉素片段，引物設(shè)計中上下游同時引入XhoI位點(斜體表示酶切位點)，以便下一步實驗操作。hphp 1:5，- CTCGA G TATTGAAGGAGGATTTTTGGGC-3，hphp2 :5 ’ - CTCGAG GCTCTTGTTCGGTCGGCAFCTA-3，PCR體系為模板pCB1003質(zhì)粒1μ 1，Taq plus聚合酶I μ 1，引物(IOOmM)各 O. 4 μ 1，Taq plus 緩沖液 5 μ I，dNTP (25mM) I μ I，其余用水補足至 50 μ I。PCR 反應(yīng)條件為94°C 5 分鐘，(94°C 30 秒，55°C 30 秒，68°C I 分 30 秒)共計 35 個循環(huán)，72 °C 10分鐘。PCR產(chǎn)物純化后連接到pUCM-T載體上，然后用XhoI酶切，切后連接到以同樣XhoI 酶切的PCAMBIA1300載體上，即構(gòu)建好pCAMBIA1300_l載體。構(gòu)建過程見圖I ;圖I中的簡寫酶切位點分別為Xh XhoI, E EcoRI, Sa SacI, K KpnI, S SmaI, B =BamHI, X XbaI, P PstI, H :HindIII。LB(left border)為左臂，RB(right border)為右臂。實施例2ATMT轉(zhuǎn)化pCAMBIA1300_l載體到里氏木霉主要采用凍融法轉(zhuǎn)化，將pCAMBIA1300-l載體轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌AGLl中。從新鮮培養(yǎng)的LB平板(含50 μ g/ml卡那霉素)上挑選一農(nóng)桿菌單菌落接種于5ml含卡那霉素的LB 中，28°C 200rpm過夜培養(yǎng)；第二天將200-400 μ I培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到5ml含200ymol/L AS和 50 μ g/ml Kna的誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基AIM中，OD值約0. 15，28°C培養(yǎng)5_6h使0D_達到0. 5-0. 6。里氏木霉孢子的收集用5ml滅菌蒸餾水從培養(yǎng)IOd的PDA平板上洗下孢子，在裝有無菌玻璃珠的試管中，渦旋振蕩后，三層擦鏡紙過濾后，5000rpm離心，用無菌水清洗兩次后,用血球計數(shù)板計數(shù)；將100 μ I培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌AGL-I菌液和100 μ I稀釋好的里氏木霉孢子懸浮液混合，然后均勻涂布混合液于鋪有硝酸纖維素膜(NC)的AM平板上，20°C共培養(yǎng)48h ;將膜剪成小片，在選擇性培養(yǎng)基PDA上25°C培養(yǎng)，直到轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。選擇性培養(yǎng)基中含200 μ g/ml潮霉素、400 μ g/ml頭孢霉素(cefotaxime)、60 μ g/ml鏈霉素。轉(zhuǎn)化子長出后，再在含有200 μ g/ml潮霉素的PDA平板上再次篩選。將長出的轉(zhuǎn)化子均挑至PDA平板上，觀察菌落形態(tài)。實施例3引起ATMT-39表型差異的基因的克隆及預(yù)測I. ATMT-39突變體插入位點的確定從突變體ATMT-39中提取基因組DNA，作為模板，進行NEST PCR擴增，獲得插入片段測序后確定插入位置。NEST PCR所使用引物序列根據(jù)pCAMBIA1300載體上T-DNA序列設(shè)計,序列如下
LB4:5，-GCGTTACCCAACTTAATCGC-3，
RB4:5，-AGCGCAACGCAATTAATGTG-3，
LB5:5，-GCCAGGGTTTTCCCAGTCAC-3，
RB5:5，-AGTTAGCTCACTCATTAGGC-3，
LB6:5，-CGTTGTAAAACGACGGCCAG-3，
RB6:5，-ACCCCAGGCTTTACACTTTA-3’
將提取后的QM9414基因組用EcoRI酶切后，用T4連接酶連接，4°C連接，然后以連
接產(chǎn)物作為模板進行后續(xù)PCR反應(yīng)。連接體系為基因組酶切產(chǎn)物4 μ 1，T4連接酶I μ 1，T4 連接酶緩沖液I μ I，其余用CldH2O補足10 μ I。NEST PCR擴增步驟及PCR反應(yīng)條件、體系第一次PCR以純化的自連DNA為模板進行PCR擴增，引物采用LB4/RB4 ;第二次PCR使用第一次PCR產(chǎn)物稀釋1000倍為模板，引物采用LB5/RB5，第三次PCR使用第二次PCR產(chǎn)物稀釋1000倍為模板，引物采用LB6/RB6，經(jīng)過上述一系列PCR擴增獲得T-DNA側(cè)翼序列。PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性45s，94°C變性30s， 55°C退火45s，72°C延伸4min，35個循環(huán)；最后一個循環(huán)結(jié)束后，于72°C下延伸lOmin。PCR 反應(yīng)體系為:0· 5 μ ILATaq(5U/μ I)，10XPCR 反應(yīng)緩沖液 5 μ 1，引物(IOOmM)各 0.4 μ 1， dNTP(25mM)ly 1，模板 lO-lOOng，其余用水補足至 50 μ I。將第三次PCR擴增所得到的PCR產(chǎn)物，膠回收后測序，所得到的測序結(jié)果在里氏木霉基因組數(shù)據(jù)(http://genome, jgi-psf. org/Trire2/Trire2. home, html)和 NCBI 數(shù)據(jù)庫中比對，確定T-DNA的插入位置(圖2)。2. TrTFl基因組DNA的克隆根據(jù)所測得序列，在里氏木霉基因組數(shù)據(jù)庫尋找對應(yīng)基因，根據(jù)基因組數(shù)據(jù)庫中信息，設(shè)計引物，擴增TrTFl基因組DNA。引物序列如下39pl :5，-AAGGATCCACCCCCGTACTCCCTATCTCCTGT-3’39p2 :5’ -AAGGATCCGTGCGGCCCTGTACCATTTTC-3’PCR 體系為模板 QM9414 基因組 DNA I μ 1，Taq plus 聚合酶 I μ 1，引物(IOOmM) 各 0.4 μ 1，Taq plus 緩沖液 5 μ 1，dNTP (25mM) I μ I，其余用水補足至 50 μ I。PCR 反應(yīng)條件為94°C 5 分鐘，(94°C 30 秒，55°C 30 秒，68°C I 分 30 秒)共計 35 個循環(huán)，72 °C 10分鐘。所得PCR產(chǎn)物膠回收后連接到pUCM-T載體上并測序，序列為SEQ IDNO :3。連接反應(yīng)條件PCR膠回收產(chǎn)物3μ 1，T4連接酶I μ 1，T4連接酶緩沖液I μ 1， pUCM-T載體I μ I，其余用ddH20補足10 μ I。3. TrTFlcDNA的克隆采用TRIZOL法提取QM9414中RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，PCR擴增獲得cDNA序列。 TRIZOL 法提取總 RNA 收集約Ig左右里氏木霉菌絲用液氮研磨至粉末狀，加入2ml Trizol，室溫放置 5min,使其充分裂解。8500rpm離心5min,棄沉淀；按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振蕩混勻15秒,室溫放置3min。4°C 8500rpm離心15min。吸取上層水相至另一離心管中；按 0. 5ml異丙醇/ml Trizol加入異丙醇混勻，室溫放置IOmin, 4。。8500rpm離心IOmin,棄上清，RNA沉于管底。按Iml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。4°C 6500rpm離心5min,盡量棄上清。冰上晾干lOmin。用適量H20(約IOOul)溶解RNA樣品，測O. D值定量RNA濃度。cDNA 合成米用First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒合成 cDNA。將 I μ g 總 RNA, I μ I oligo(dT) 18引物加入一支無菌無核酸污染的管中,加入無核酸ddH20定容至100 μ I, 混勻后冰上冷卻，如果RNA模板GC含量高或者包含二級結(jié)構(gòu)，需要65°C溫浴5min后再置于冰上。然后加入5X反應(yīng)緩沖液4μ 1，dNTP Mix (IOmM) 2 μ 1，M-MuLV Reverse Transcriptase (20u/ μ I) 2 μ I, RiboLock RNase Inhibitor (20u/ μ I) I μ I，使得總反應(yīng)體系為20 μ I ;輕柔混合后37°C溫浴60min，如果RNA模板GC含量高，可以將反應(yīng)溫度提高到45°C ;最后在70°C溫浴5min終止反應(yīng)。TrTFl 的 cDNA 序列擴增引物序列如下39cDNApl :5’ -ATGCCTACGAAAAGGTGAAGGA-3’39cDNAp2 :5’ -CGGCTCTGCATCAACCCGACC-3’PCR 體系為模板 cDNA I μ 1，Taq plus 聚合酶 I μ 1，引物(IOOmM)各 0. 4 μ 1，Taq plus緩沖液5 μ 1，dNTP(25mM)ly 1，其余用水補足至50 μ I。PCR 反應(yīng)條件為94°C 5 分鐘，(94°C 30 秒，55°C 30 秒，68°C I 分 30 秒)共計 35 個循環(huán)，72 °C 10分鐘。所得PCR產(chǎn)物膠回收后連接到pUCM-T載體上并測序。序列為SEQ IDNO :1。連接反應(yīng)條件PCR膠回收產(chǎn)物3μ 1，T4連接酶I μ 1，T4連接酶緩沖液I μ 1， pUCM-T載體I μ I，其余用ddH20補足10 μ I。4. TrTFl蛋白功能預(yù)測將TrTFl 蛋白序列在 http://www. ebi. ac. uk/ 上預(yù)測。實施例4ATMT-39菌落形態(tài)、孢子形態(tài)、產(chǎn)孢量及生長速率的測定I.菌落形態(tài)將ATMT-39突變體和QM9414分別接于PDA和麗平板上，30°C培養(yǎng)3天后拍攝菌落形態(tài)(圖3)。其中，PDA培養(yǎng)基配方為每升培養(yǎng)基中土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂20g ； MM 培養(yǎng)基配方為每升培養(yǎng)基中葡萄糖 20g，(NH4) 2S045g, KH2P0415g, MgSO4O. 6g, CaCl2O. 6g， FeSO4O. 005g, MnSO4O. 016g, ZnSO4O. 0014g, CoCl2O. 002g, pH5. 5。2.分生孢子梗和分生孢子形態(tài)光學(xué)顯微鏡下的觀察是將培養(yǎng)3天的平板用無菌水清洗，用涂布棒將平板表面的菌絲和孢子洗掉，然后將帶有基生菌絲的瓊脂切成大小約為1X0. 5cm的小塊，放置于載玻片上；后將載玻片放置于9cm平板中(保持平板內(nèi)一定濕度)，16h后取出，至于光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲，分生孢子梗及分生孢子形態(tài)(圖4)。將培養(yǎng)48h的平板邊緣用刀片切成大小約為1X0. 5cm的小塊，至于掃描電鏡載物臺上，后用液氮凍干30min以上后噴金，掃描電鏡觀察(圖5)。3.產(chǎn)孢量和生長速率的測定將ATMT-39突變體和QM9414接于PDA平板上，30°C培養(yǎng)3天后測量菌落直徑，計算生長速率。將培養(yǎng)3天的PDA平板用打孔器打3個孔，位置分別在靠近菌落中心，菌落中間位置和菌落邊緣；將打好的菌塊置于IOml離心管中，同時離心管里加入5個玻璃珠；漩渦振蕩器上震蕩5分鐘后，用血球計數(shù)板計數(shù)，測定結(jié)果見表I。
表 I

權(quán)利要求
1.一種從里氏木霉(Trichoderma reesei)中所分離的轉(zhuǎn)錄因子cDNA,其多核苷酸為 (a)、(b)或(C)所示(a)、SEQID No. I所示的多核苷酸；(b)、編碼SEQID No. 2所示氨基酸的多核苷酸；(C)、與SEQ ID NO :1的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的多核苷酸，該多核苷酸所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸為SEQ ID NO 2所示。
2.一種從里氏木霉(Trichoderma reesei)中所分離的轉(zhuǎn)錄因子基因，其多核苷酸序列為SEQ ID NO 3所示。
3.權(quán)利要求I所述轉(zhuǎn)錄因子cDNA所編碼的蛋白。
4.權(quán)利要求2所述轉(zhuǎn)錄因子基因所編碼的蛋白。
5.按照權(quán)利要求3或4所述的蛋白，其特征在于，其氨基酸為(a)或(b)所示(a)、SEQID No. 2所示的氨基酸；(b)jfSEQ ID No. 2所示的氨基酸通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有SEQ ID No. 2所示轉(zhuǎn)錄因子功能或活性的蛋白變體。
6.含有權(quán)利要求I所述轉(zhuǎn)錄因子cDNA的表達載體。
7.含有權(quán)利要求2所述轉(zhuǎn)錄因子基因的表達載體。
8.含有權(quán)利要求6或7所述表達載體的重組宿主細胞。
9.權(quán)利要求I所述轉(zhuǎn)錄因子cDNA或權(quán)利要求2所述轉(zhuǎn)錄因子基因在調(diào)控里氏木霉生長發(fā)育中的用途。
10.權(quán)利要求I所述轉(zhuǎn)錄因子CDNA或權(quán)利要求2所述轉(zhuǎn)錄因子基因在調(diào)控或提高里氏木霉抗逆性中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了源于里氏木霉的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明從里氏木霉(Trichoderma reesei)中分離得到了轉(zhuǎn)錄因子cDNA，其核苷酸序列為SEQ ID No.1所示，所編碼蛋白的氨基酸序列為SEQ ID No.2所示。本發(fā)明還提供了含有該轉(zhuǎn)錄因子cDNA的表達載體及重組宿主細胞，本發(fā)明進一步提供了該轉(zhuǎn)錄因子cDNA在調(diào)控里氏木霉生長發(fā)育及抗逆性中的用途。
文檔編號C12N1/21GK102586284SQ20121008220
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月15日
發(fā)明者赫榮琳, 陳樹林 申請人:天津工業(yè)生物技術(shù)研究所