毛竹轉(zhuǎn)錄因子nac基因cds序列的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及毛竹轉(zhuǎn)錄因子NAC基因⑶S序列的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] NAC(NAM/ATAF/CUC)轉(zhuǎn)錄因子家族是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，多數(shù)NAC蛋白的N 端具有高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域，而在C端則具有多元化的激活域。NAC轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與調(diào)控 許多生物學(xué)過程，如細(xì)胞分裂、細(xì)胞次生壁合成、器官邊界、開花和衰老等植物生長發(fā)育過 程，以及參與調(diào)控植物對高鹽、干旱、低溫等非生物逆境脅迫響應(yīng)過程。在擬南芥中過量表 達(dá)八財(cái)0)19、4財(cái)(：055、1?)26/^麻0)72和414?1/^麻(：002均能提高其抗旱能力 ；過量表達(dá) ATAF2/ANAC081的植物更容易感染枯萎病菌;過量表達(dá)JUB1/ANAC042和VNI2/ANAC083能夠 延遲植物衰老，提高對非生物脅迫的耐受能力。在水稻中過量表達(dá)0sNAC5、0sNAC9和 OsNACIO能夠顯著擴(kuò)大根系的分布范圍，從而提高抗旱能力實(shí)現(xiàn)高產(chǎn);過量表達(dá)0sNAC5提高 其抗旱、耐鹽的能力；SNAC1轉(zhuǎn)入水稻和小麥，能夠提高轉(zhuǎn)基因植株抵抗多種非生物脅迫的 能力。
[0003]竹子是僅次于木材的第二大森林資源，竹產(chǎn)業(yè)是我國林業(yè)四大朝陽產(chǎn)業(yè)之一，竹 子已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于建筑、家具、造紙、裝飾材料、食品保健、園林景觀、生態(tài)修復(fù)等領(lǐng)域，是 最具潛力的綠色資源之一。竹子以其生長速度快，繁殖能力強(qiáng)，一次造林，永續(xù)利用，適宜山 地造林的特點(diǎn)，在我國造林宜林地日趨減少的情況下，竹林優(yōu)勢更為明顯。尤其是目前我國 天然林商業(yè)采伐全面禁止的情況下，竹資源的開發(fā)利用在保障我國木材安全、生態(tài)安全以 及貧困山區(qū)農(nóng)民脫貧致富和新農(nóng)村建設(shè)中具有不可替代的作用。毛竹（Phyllostachys edulis)是我國最為重要的筍、材兩用經(jīng)濟(jì)竹種，現(xiàn)有面積443萬公頃，2014年年產(chǎn)毛竹 13.08億根，為彌補(bǔ)我國木材缺口做出了積極貢獻(xiàn)。以毛竹為材料進(jìn)行NAC轉(zhuǎn)錄因子研究，對 于更好地開發(fā)利用毛竹基因資源，開展抗逆分子育種具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供毛竹轉(zhuǎn)錄因子NAC基因⑶S序列的應(yīng)用。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供毛竹轉(zhuǎn)錄因子NAC基因CDS序列在促進(jìn)植物側(cè)根 生長發(fā)育中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明所述的毛竹轉(zhuǎn)錄因子NAC基因⑶S序列為：
[0007] i)SEQIDN0:1所示的核苷酸序列；或
[0008]ii)SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸且 表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核昔酸序列;或
[0009] iii)在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO: 1所示序列雜交且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸 序列，所述嚴(yán)格條件為在含〇. 1 %SDS的0.1XSSPE或含0.1 %SDS的0.1XSSC溶液中，在65°C 下雜交，并用該溶液洗膜;或
[0010] iv)與i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的 核苷酸序列。
[0011] 前述的應(yīng)用，其是將毛竹轉(zhuǎn)錄因子NAC基因⑶S序列構(gòu)建到植物雙元表達(dá)載體上， 轉(zhuǎn)化植物，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株側(cè)根生長發(fā)育。
[0012] 本發(fā)明述及的植物雙元表達(dá)載體包括PCAMBIA1301、改造的pCAMBIA1301等;其中， 所述改造的PCAMBIA1301是在載體pCAMBIA1301的多克隆位點(diǎn)引入花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng) 子和胭脂堿合酶終止子。
[0013] 攜帶有目的片段的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微 注射、電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞中（Weissbach，1998，MethodforPlant MolecularBiologyVIII，AcademyPress，NewYork，第411-463頁；Geiserson和Corey， 1998,PlantMolecularBiology,2ndEdition)〇
[0014] 本發(fā)明還提供毛竹轉(zhuǎn)錄因子NAC基因⑶S序列在提高植物對非生物逆境脅迫的耐 受能力中的應(yīng)用，所述非生物逆境脅迫包括高鹽、干旱等。
[0015] 前述的應(yīng)用，其是將毛竹轉(zhuǎn)錄因子NAC基因⑶S序列構(gòu)建到植物雙元表達(dá)載體上， 轉(zhuǎn)化植物，從而提高轉(zhuǎn)基因植株對非生物逆境脅迫的耐受能力。
[0016] 本發(fā)明所述的植物包括但不限于擬南芥。將毛竹轉(zhuǎn)錄因子NAC基因CDS序列構(gòu)建到 改造的載體PCAMBIA1301上，轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，從而提高轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的耐鹽、抗旱 能力。
[0017] 本發(fā)明優(yōu)選采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化植物。
[0018]本發(fā)明進(jìn)一步提供毛竹轉(zhuǎn)錄因子NAC基因⑶S序列在植物抗性育種中的應(yīng)用，所述 植物包括但不限于禾本科植物，例如竹子等。
[0019] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)毛竹NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物對抗非生物逆境脅迫中的功能，將毛竹 轉(zhuǎn)錄因子NAC基因CDS序列導(dǎo)入植物(例如擬南芥）中，得到側(cè)根明顯增多的轉(zhuǎn)基因植株，且 轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽、抗旱能力均明顯提高，為植物的抗性育種奠定了基礎(chǔ)。毛竹NAC轉(zhuǎn)錄因 子基因在竹子等禾本科植物抗性育種中具有廣泛的應(yīng)用前景，為植物速生育種提供了新的 基因資源。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中基因PeSNAC擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；其中，M:DNA分子量標(biāo)記；1: 擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0021] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中毛竹NAC轉(zhuǎn)錄因子基因結(jié)構(gòu)示意圖。
[0022] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中多物種NAC氨基酸序列比較分析;其中，A、B、C、D和Ε為Ν端 NAC保守域中的5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域。
[0023]圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中正義植物表達(dá)載體PeSNACsense的質(zhì)粒載體圖和酶切檢測 電泳圖；其中，(A):載體圖；（B):酶切檢測電泳圖，M:DNA分子量標(biāo)記;1:酶切產(chǎn)物。
[0024]圖5為本發(fā)明實(shí)施例2中反義植物表達(dá)載體PeSNACantisense的質(zhì)粒載體圖；其中， (A):載體圖；（B):酶切檢測電泳圖，M:DNA分子量標(biāo)記;1:酶切產(chǎn)物。
[0025] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例3中PeSNACsense單克隆菌落PCR電泳結(jié)果;其中，M:DNA分子量 標(biāo)記；1-6 :轉(zhuǎn)化PeSNACsense的單克隆菌落；7 :PeSNACsense重組表達(dá)載體質(zhì)粒；8: PCAMBIA1301載體質(zhì)粒。
[0026] 圖7為本發(fā)明實(shí)施例3中PeSNACantisense單克隆菌落PCR電泳結(jié)果;其中，M:DNA分 子量標(biāo)記；1_6:轉(zhuǎn)化PeSNACantisense的單克隆菌落;7:PeSNACantisense重組表達(dá)載體質(zhì) 粒;8:pCAMBIA1301載體質(zhì)粒。
[0027]圖8為本發(fā)明實(shí)施例4中轉(zhuǎn)基因擬南芥植株RT-PCR檢測結(jié)果；其中，（A):正義PeSNAC基因表達(dá)檢測，3-1、3-6、3-8、3-9為不同轉(zhuǎn)基因植株，11'為野生型植株；（8):反義 PeSNAC基因表達(dá)檢測，六-1^-2^-8^-9為不同轉(zhuǎn)基因植株，11'為野生型植株。
[0028]圖9為本發(fā)明實(shí)施例5中轉(zhuǎn)基因擬南芥表型；其中，1:正義PeSNAC基因表達(dá)轉(zhuǎn)基因 植株;2:野生型植株;3:反義PeSNAC基因表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。
[0029] 圖10為本發(fā)明實(shí)施例6中轉(zhuǎn)基因擬南芥根系表型及側(cè)根數(shù)量統(tǒng)計(jì);其中，WT:野生 型植株;S-1:正義PeSNAC基因表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株;A-2:反義PeSNAC基因表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。
[0030] 圖11為本發(fā)明實(shí)施例7中NaCl脅迫條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥表型、存活率統(tǒng)計(jì)、Fv/Fm的 變化趨勢;其中，WT:野生型植株;S-1:正義PeSNAC基因表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株;A-2:反義PeSNAC基 因表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株；（A) :NaCl處理7d后的表型；（B) :NaCl處理10d后存活率統(tǒng)計(jì)；（C):NaCl 處理過程中Fv/Fm的變化趨勢。
[0031] 圖12為本發(fā)明實(shí)施例8中干旱脅迫條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥表型、存活率統(tǒng)計(jì)、Fv/^的 變化趨勢;其中，WT:野生型植株;s-1:正義PeSNAC基因表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株;A-2:反義PeSNAC基 因表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株；（A):干旱處理14d后的表型；（B):干旱處理20d后存活率統(tǒng)計(jì)；（C):干旱 處理過程中Fv/Fm的變化趨勢。
【具體實(shí)施方式】
[0032]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例 均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊（SambrookJ&RussellDW, Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。 [0033]實(shí)施例1毛竹NAC轉(zhuǎn)錄因子基因⑶S序列的獲得
[0034] 以毛竹(Phyllostachysedulis)葉片為材料，提取葉片總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA作 為模板，從毛竹基因組數(shù)據(jù)庫中搜索，分析找到基因組中預(yù)測為編碼轉(zhuǎn)錄因子NAC的DNA序 列，根據(jù)該序列的編碼區(qū)設(shè)計(jì)如下引物：
[0035]上游引物：5' -ATGGTGGAGGCGAGGCTGC-3'
[0036]下游引物：5' -TCAATCGAGTGAGTTCCACATCTGTGA-3'
[0037] 對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1 )，切下目的條帶純化回收，將回收 的DNA片段連接到pGEM-Teasy載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Esherichiacoli)DH5a感受態(tài)細(xì)胞， 經(jīng)藍(lán)白斑篩選，提取陽性克隆質(zhì)粒并酶切圖譜分析后，再將單克隆測序，插入片段為867bp， 如SEQIDNo: 1所示。應(yīng)用Blast在線軟件，將測序的片段與已報(bào)道的基因序列進(jìn)行同源性 比較，發(fā)現(xiàn)該插入片段與預(yù)測的NAC基因編碼區(qū)完全一致，同時(shí)與基因組序列比對分析發(fā) 現(xiàn)，該編碼區(qū)對應(yīng)的基因組序列含有2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子（圖2)。將該基因命名為PeSNAC (即，毛竹NAC轉(zhuǎn)錄因子基因⑶S序列）。
[0038]通過Blast軟件在線比較分析，發(fā)現(xiàn)該基因編碼的氨基酸序列（SEQIDN〇:2)與其 它單子葉植物的NAC均具有較高的一致性，尤其與同是來自禾本科的水稻(Oryzasativa IndicaGroup)、二糖短柄草（Brachypodiumdistachyon)、谷子（Setariaitalica)、大麥 (Hordeumvulgaresubsp·vulgare)、小麥（Triticumaestium)、節(jié)節(jié)麥（Aegilops tauschii)和玉米（Zeamays)同源蛋白的一致性都在80 %以上，其中與水稻的NAC (EAZ02065)的一致性最高，達(dá)87.0%，N端NAC保守域包含A、B、C、D和E5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域（圖3)。 由此可見，克隆出的PeSNAC基因?yàn)槊裰械囊粋€(gè)全新的NAC轉(zhuǎn)錄因子基因。
[0039]實(shí)施例2攜帶毛竹PeSNAC基因的植物表達(dá)載體構(gòu)建
[0040]以毛竹cDNA為模板，根據(jù)SEQIDNo: 1設(shè)計(jì)引物，植物表達(dá)引物兩端分別引入位點(diǎn)Clal和BamHI酶切位點(diǎn)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列如