專利名稱：一種利用里氏木霉纖維素酶制備殼寡糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用里氏木霉纖維素酶制備殼寡糖的方法。
背景技術(shù)：
低聚糖也叫寡糖，過去把雙糖到十糖稱之為寡糖，現(xiàn)在一般把這個(gè)范 圍擴(kuò)大到二十糖，稱作低聚糖。低聚甲殼素可叫甲殼寡糖，低聚殼聚糖可叫殼寡糖。對(duì)于甲殼素和殼聚糖來說，相對(duì)分子量低于ioooo的殼聚糖，具有許多優(yōu)于高分子量殼聚糖的功能，尤其是具有生物活性的甲殼素和殼 聚糖的五-九糖，特別是六糖和七糖在抑制腫瘤方面的作用令人鼓舞，是當(dāng) 今國(guó)內(nèi)外研究、開發(fā)的重點(diǎn)領(lǐng)域。低聚殼聚糖和低聚甲殼素的制備，大體有3類方法酸水解法、氧化 法和酶解法。酸水解法有鹽酸法、乙酸法、磷酸法和氫氟酸法；氧化法包 括過氧化氫法、過硼酸鈉法和次氯酸鈉法；酶解法可分為專一性酶降解法 和非專一性酶降解法兩種。盡管用化學(xué)和物理降解也能得到低聚殼聚糖，但這些方法由于反應(yīng)條 件和分離條件的控制難度大，并且聚合度在6-10的殼聚糖的產(chǎn)率低，降解 得到產(chǎn)物的分子量不均一，分布寬，成本高；酶解法由于具有特異性，可 選擇性地切斷特定鏈，從而制得特定的低聚糖，并且反應(yīng)條件溫和，不采 用強(qiáng)酸強(qiáng)堿，避免了寡聚體的破壞，不會(huì)造成環(huán)境污染，被認(rèn)為是殼聚糖 降解的最理想方法。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用里氏木霉纖維素酶制備殼寡糖的方法， 利用來源于里氏木霉(T^'c力OGfe/7a3 reese2')的纖維素酶降解殼聚糖。本發(fā)明的目的是這樣來實(shí)現(xiàn)的，其步驟方法如下(1) 殼聚糖的純化取殼聚糖，先加入少許水溶脹后，再加入1%的乙 酸溶液使之充分溶解，進(jìn)行減壓抽濾，棄除雜質(zhì)(主要是金屬粉末)，取其 濾液，加入lmol/L的氫氧化鈉溶液，使殼聚糖沉淀出來，用水漂洗至中性， 減壓抽濾干燥后，力卩200mL無水乙醇，4(T50。C水浴加熱2小時(shí)，放在干燥 箱里烘干后，碾成粉末備用。(2) 殼聚糖的酶解量取一定量的經(jīng)步驟1純化的殼聚糖溶液倒入三 角瓶中，置于水浴振蕩器中至恒溫5(TC后，再加入相應(yīng)比例的纖維素酶液， 搖晃均勻，轉(zhuǎn)速100r/min，反應(yīng)結(jié)束后立刻取出，煮沸10min使酶滅活， 然后減壓抽濾移走酶。(3) 降解在溫度50°C、 pH5.0、殼聚糖酶為5:1的條件下，酶解 1-24h。(4) 丙酮-水分級(jí)萃取殼聚糖水解后的濾液在減壓條件下濃縮直到 最后體積為初始體積的10%，然后與等體積丙酮混合得到沉淀，在4000轉(zhuǎn)/ 分離心30分鐘收集該沉淀，使用50%丙酮洗脫幾次，然后在真空干燥箱中 干燥，得A部分。剩余的溶液在減壓蒸餾下濃縮到約原體積的5%，然后加 入9體積丙酮使之充分混合產(chǎn)生沉淀，離心收集形成的沉淀，用90%丙酮洗 滌，減壓干燥，得B部分。殼聚糖(Chitosan，)，來源于蟹殼，脫乙酰度> 80%，表觀粘度333mPa 's (2%殼聚糖溶液，乙酸濃度1%，用旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)測(cè)定)，購(gòu)于青島海生生物工 程有限公司；纖維素酶(Cellulase)，由里氏木霉發(fā)酵培養(yǎng)并經(jīng)純化而得的酶粉。 分子量是根據(jù)特性粘度法推算，使用烏氏粘度計(jì)(上海玻璃儀器一廠)測(cè)特性粘度，用NDJ-9S型數(shù)顯粘度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)測(cè)定表觀粘度，兩種粘度的測(cè)定溫度為25度；采用基質(zhì)輔助激光去離子時(shí)間飛行(MALDI-T0F MS， Bruker， American)分析水解產(chǎn)物及其分級(jí)沉淀產(chǎn)物。 在本發(fā)明中使用的殼聚糖是從甲殼類的外殼中提取的甲殼質(zhì)經(jīng)酸堿處理后得到的產(chǎn)物，例如利用水產(chǎn)加工的廢棄物，能夠降低成本。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)條件溫和，不采用強(qiáng)酸強(qiáng)堿，避免了寡聚體的破壞，不會(huì)造成環(huán)境污染，是殼聚糖降解的理想方法。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l在溫度5(TC、 pH5.0、殼聚糖酶為5:1的條件下，分別酶解 lh、 4h、 8h、 24h，測(cè)特性粘度，算出分子量。結(jié)果表明隨著殼聚糖與酶 的比值增大和反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，殼聚糖的平均分子量分別降解到32949、 9770、 3831和1848，降解效果明顯增強(qiáng)。實(shí)施例2同實(shí)施例l步驟，酶解28hr，殼聚糖酶解后的濾液在減壓條 件下濃縮直到最后體積為初始體積的10%，然后與等體積丙酮混合得到沉 淀，在4000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘收集該沉淀，使用50%丙酮洗脫幾次，然后在 真空干燥箱中干燥，得A部分(平均分子量約為1200)。剩余的溶液在減壓 蒸餾下濃縮到約原體積的5%，然后加入9體積丙酮使之充分混合產(chǎn)生沉淀， 離心收集形成的沉淀，用90%丙酮洗滌，減壓干燥，得B部分(平均分子量 約為650)。
權(quán)利要求
1. 一種利用里氏木霉纖維素酶制備殼寡糖的方法，其特征是方法步驟為(1)以里氏木霉菌種經(jīng)培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)出纖維素酶；(2)殼聚糖的純化稱取20g殼聚糖，先加入少許水溶脹后，再加入1％的乙酸溶液使之充分溶解，進(jìn)行減壓抽濾，棄除雜質(zhì)，取其濾液，加入1mol/L的氫氧化鈉溶液，使殼聚糖沉淀出來，用水漂洗至中性，減壓抽濾干燥后，加200mL無水乙醇，40-50℃水浴加熱2小時(shí)，放在干燥箱里烘干后，碾成粉末備用；(3)殼聚糖的酶解量取一定量的經(jīng)步驟2純化的殼聚糖溶液倒入三角瓶中，置于水浴振蕩器中至恒溫50℃后，再加入相應(yīng)比例的纖維素酶液，搖晃均勻，轉(zhuǎn)速100r/min，反應(yīng)結(jié)束后立刻取出，煮沸10min使酶滅活，然后減壓抽濾移走酶；(4)降解在溫度50℃、pH5.0、殼聚糖∶酶為5∶1的條件下，酶解1-24h；(5)丙酮-水分級(jí)萃取殼聚糖水解后的濾液在減壓條件下濃縮直到最后體積為初始體積的10％，然后與等體積丙酮混合得到沉淀，在4000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘收集該沉淀，使用50％丙酮洗脫幾次，然后在真空干燥箱中干燥，得A部分，剩余的溶液在減壓蒸餾下濃縮到約原體積的5％，然后加入9體積丙酮使之充分混合產(chǎn)生沉淀，離心收集形成的沉淀，用90％丙酮洗滌，減壓干燥，得B部分。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用里氏木霉纖維素酶制備殼寡糖的方 法，其特征在于，所述的乙酸濃度為0. l-2wt%，所述的乙酸氨或乙酸納水 溶液的pH為4-7，濃度為0. 001M-0. 5M。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種利用里氏木霉纖維素酶制備殼寡糖的方 法，其特征在于采用不同體積比的丙酮-水對(duì)酶解后的產(chǎn)物進(jìn)行分子量分 級(jí)。
全文摘要
一種利用里氏木霉纖維素酶制備殼寡糖的方法，純化的殼聚糖粉末用水溶脹后，加入乙酸溶液使之充分溶解，用乙酸氨或乙酸鈉水溶液溶解黑曲酶纖維素酶，配制成濃度為0.5-2mg/ml的酶液；在溫度為40-55℃下，加入酶液進(jìn)行酶解反應(yīng)，得到低分子量殼聚糖，通過丙酮-水分級(jí)沉淀后，濃縮干燥可得到不同分布范圍的低聚殼聚糖產(chǎn)品。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)條件溫和，不采用強(qiáng)酸強(qiáng)堿，避免了寡聚體的破壞，不會(huì)造成環(huán)境污染，是殼聚糖降解的理想方法。
文檔編號(hào)C12R1/885GK101280330SQ20081010684
公開日2008年10月8日 申請(qǐng)日期2008年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月8日
發(fā)明者李明俊, 宇 謝 申請(qǐng)人:南昌航空大學(xué)