專利名稱：適于表達用于基因治療的編碼序列的表達載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于基因治療的表達載體，更特別地涉及包含轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(順式調(diào)控元件或者反式作用元件)新組合的用于基因治療的表達載體，其包括啟動子、增強子、內(nèi)含子、非翻譯區(qū)(UTR)和基因座控制區(qū)(locus control region, LCR),所述載體能夠支持靶基因在肝中以高水平持續(xù)表達。
背景技術(shù)：
肝的功能包括血液儲存、糖轉(zhuǎn)換和分泌多種細胞因子，以及表達影響許多疾病(如遺傳的、心血管的、代謝的、血液的和癌性疾病)的基因。已將多種肝特異性疾病(如感染性肝炎)作為基因治療的靶標(biāo)進行了研究。肝細胞在形成后擁有很長的壽命，具有大多數(shù)病毒基因轉(zhuǎn)運蛋白的受體而且直接與血流相連，使其易于接觸藥物，因此肝被認為是基因治療的重要候選器官。血友病是一種由位于X染色體上的因子VIII(FVIII、f8)或因子IX (FIX、f9)基因的缺陷所引起的退行性出血疾病，依據(jù)突變或缺失的基因?qū)⑵浞殖裳巡(FVIII缺陷)或B (FIX缺陷)。對用于治療血友病A或B的藥物，只有當(dāng)FVIII或FIX以其正常血液濃度的1-5% (分別為100-200ng/ml和500ng/ml)或更高水平持續(xù)表達時，治療效果才是可預(yù)期的。在最近的血友病B基因治療研究中，已報道的是，將帶有人FIX (hFIX)基因的腺相關(guān)病毒(AAV)引入血友病B小鼠模型中導(dǎo)致hFIX蛋白以高達1，500-1，800ng/ml的水平表達(Snyder, R. O.，Nat. Med.，5 :64-70 (1999) ；Manno, C. S.，Nat. Med.，12 :342-347 (2006))，而在血友病B的狗模型中以高達730ng/ml的水平表達hFIX蛋白(Arruda，V. R.，Blood,
105:3458-3464(2005))。然而，當(dāng)將這種在動物模型中高效表達的載體臨床應(yīng)用于人患者時，F(xiàn)IX的血液濃度僅為185ng/ml或更低，這低于有效臨床治療的閾值(500ng/ml)，另外的難題是在人受試者中的hFIX表達水平不是持續(xù)的而是瞬時的(Kay，M. A. ,Nat. Genet. ,24 257-261 (2000) ；Manno,C. S. ,Nat. Med. , 12 :342-347 (2006))。在血友病 A 的治療模型中發(fā)現(xiàn)了與上述相似的趨勢。針對遺傳疾病(如血友病)治療的臨床試驗結(jié)果表明，首要條件是開發(fā)能夠保持在特定組織(如肝組織)中持續(xù)高水平表達治療基因的高效組織特異性表達載體。此外，逃脫針對載體的體液及細胞免疫應(yīng)答以及誘導(dǎo)對所表達蛋白的免疫耐受被認為是成功的 基因治療的關(guān)鍵因素。例如，為了將正常FVIII或FIX的表達水平提高到有效用于成功的臨床治療的閾值，還必須考慮的是，注射高劑量的帶有FVIII或FIX基因的病毒并且抑制體內(nèi)的免疫應(yīng)答。然而為使這種方法獲得成功，首先要通過改進表達載體來提高基因表達的效率。
僅在肝中產(chǎn)生的脂蛋 白(a)是用于肝組織特異性表達載體開發(fā)的另一個重要靶標(biāo)。脂蛋白(a)是通過載脂蛋白(a)(—種糖蛋白)與apo B_100(低密度脂蛋白(LDL)的主要蛋白質(zhì)組分)結(jié)合而形成的(Fless，G.M.，J. Biol. Chem. ,261 :8712-8717 (1986))。載脂蛋白(a)負責(zé)膽固醇的體內(nèi)轉(zhuǎn)運，已報道血漿中脂蛋白(a)濃度的提高是動脈硬化和心臟病的主要風(fēng)險因子(Armstrong, V. W.等，Arteriosclerosis,62 :249-257 (1986)；Assmann, G.，Am. J. Cardiol. ,77 :1179-1184(1996))。載脂蛋白(a)含有與纖維蛋白溶酶原kringle IV和V相似的兩類kringle結(jié)構(gòu)域，以及無活性的蛋白酶樣結(jié)構(gòu)域。眾所周知的是，具有kringle結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)可抑制腫瘤的新血管形成及轉(zhuǎn)移(Folkman J. , N EngJ Med,285 :1182-1186(1971) ；Falkman J, Klagsbrun Μ· ， Science，235 :442-447(1987)；Scapaticci FA. , J Clin Oncol.，20 :3906-3927 (2002))。最近，本發(fā)明人及其他研究者發(fā)現(xiàn)，載脂蛋白(a)的kringle結(jié)構(gòu)域由于其顯著的抗血管發(fā)生活性而具有抗癌和抗轉(zhuǎn)移活性(Sculter V等，Arterioscler Thromb Vasc Biol, 21 433~438(2001) ；Trieu UN和UckunFM. , Biochem Biophys Res Commun.，257 :714-718(1999) ；Kim JS 等，J. Biol Chem.，278 29000-29008(2003) ；Yu HK 等，Cancer Res. ,64 :7092-7098(2004) ；Kim JS 等，BiochemBiophys Res Commun. ,313 :534-540(2004) ；Lee K等，Hepatology,43 :1063-1073(2006))。在抗轉(zhuǎn)移和抗癌治療中，公認的是，選擇性作用在患病位點上的治療方式會更有效。因此，開發(fā)用于抗癌治療(例如用于對肝癌或者轉(zhuǎn)移肝腫瘤的有效基因治療)的能組織特異性地持續(xù)進行基因表達的載體非常重要。如上所述，持續(xù)的組織特異性基因表達是有效基因治療的關(guān)鍵，這需要開發(fā)新的改良表達載體。這可通過改進這種表達載體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(順式調(diào)控元件或反式作用元件)來實現(xiàn)。常用轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的實例包括啟動子、增強子、內(nèi)含子、非編碼區(qū)、基因座控制區(qū)
坐坐寸寸O在這種肝組織特異性表達的表達載體中所使用的是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCK，為糖原異生酶)(Yang, Y. ff.，J.等，Gene Med. ,5(5) :417-424 (2003))、α I-抗胰蛋白酶、白蛋白、FVII、有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽C(OATP-C)、乙型肝炎病毒核心蛋白(Kramer，M.G.，等，Mol. Ther. ,7(3) :375-385(2003))和甲狀腺素結(jié)合球蛋白(Wang, L.，等，Proc.Natl. Acad. Sci.，96 :3906-3910 (1999))的啟動子；以及白蛋白(Kang, Y.，等，Blood,
106(5) =1552-1558 (2005))、苯丙氨酸羥化酶(PAH)和α I-微球蛋白/尿抑胰酶素(bikunin)前體(AMBP) (Wang, L.，等·，Mol. Ther.，I (2) :154-158(2000))的增強子。由于與肝中所富含的HNF_4(肝細胞核因子-4)結(jié)合，F(xiàn)VII啟動子(大小約為500bp)在肝中的轉(zhuǎn)錄活化水平是其他組織中的10倍或更高。已報道的是，大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子主要結(jié)合在 FVII 啟動子 3，端的 300bp 片段上(Greenberg, D.，等,Proc. Natl. Acad. Sci.，92 :12347-12351 (1995))。當(dāng)截短FVII啟動子(大小為501bp)5’端的315bp片段時，啟動子的肝特異性活性提高約30%，但當(dāng)截短210bp片段時活性降低大約20-30% (Poliak,W. S.，等，J. Biol. Chem.，271 (3) : 1738-1747 (1996))。由于與肝中所富含的HNF-Ia結(jié)合，有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽C(OATP-C)的啟動子(大小約為900bp)在肝中的轉(zhuǎn)錄活化水平是其他組織中的3倍或更高。已報道的是，大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在啟動子3’端的440bp片段上(Jung, D.，等，J. Biol. Chem.，276 37206-37214(2001))?？赏ㄟ^增強子的作用增強啟動子的活性。苯丙氨酸羥化酶(PAH)增強子(大小約為230bp，并具有HNF-I結(jié)合位點)位于PAH基因5’端上游-3. 5kb。已報道的是，由于存在肝富含的HNF-I的結(jié)合位點，PAH增強子使其所結(jié)合的啟動子的活性提高為4倍或更高(Lei, X. D.，等，Proc. Natl. Acad. Sci. ,95 :1500-1504(1998))。AMBP ( α I-微球蛋白/尿抑胰酶素前體)增強子大小約為400bp，其從AMBP基因5’端的-2945bp延伸到-2539bp。它主要包括HNF_1、2、3和4的結(jié)合位點，它的主要活性區(qū)域?qū)?yīng)于其-2802 到-2659bp 的片段(Route, P.，等，Biochem. J.，334 :577-584 (1998))。已報道的是，AMBP增強子一般使啟動子活性提高為兩倍或三倍。 位于基因5’和3’端的非翻譯區(qū)(UTR)負責(zé)基因mRNA的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定(Holcik，Μ.，Liebhaber S. A.，Proc Natl Acad Sci USA. ,94 :2410-2414 (1997) ；Chkheidze, A. N.,等,Mol Cell Biol.，19 :4572-4581 (1999))。已報道的是，3’UTR中的多腺苷酸化信號序列也明顯有助于 mRNA 的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定(Kolev, N. G.，等，Genes Dev.，19 =2583-2592 (2005)) 真核基因包括外顯子(被翻譯成蛋白質(zhì))和內(nèi)含子(在外顯子之間的非翻譯序列)。通過剪接去除這些內(nèi)含子，使由DNA首先轉(zhuǎn)錄得到的mRNA前體轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓膍RNA。這些內(nèi)含子包括以GT(U)開始的剪接供體和以AG結(jié)尾的剪接受體。此外，出現(xiàn)在內(nèi)含子3’端的是多聚嘧啶片段、剪接因子、snRNP結(jié)合分支序列、三鳥嘌呤重復(fù)序列(3重G基序)等，它們在形成剪接體(RNA與內(nèi)含子剪接酶的復(fù)合物)的過程中起關(guān)鍵作用(Pagani，F(xiàn).，等，Nat. Rev. Genet.，5 :389-396 (2004))。當(dāng)與啟動子和增強子組合時，內(nèi)含子可作為用于持續(xù)高效基因表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。內(nèi)含子通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而參與提高基因表達效率和轉(zhuǎn)錄效率(Liu，K.，等，Proc.Natl. Acad. Sci.，92 :7724-7728 (1995) ；LeBlanc, S. E.，等，J. Biol. Chem.，(2005))，還參與提高轉(zhuǎn)錄后的蛋白質(zhì)翻譯效率(Moore，M. J.，Cell, 108 :431-434(2002))。已報道的是，hFIX的內(nèi)含子I引起hFIX蛋白表達的增加(Kurachi, S.,等，J. Biol. Chem. , 270 5276-5281(1995)).抗凝血蛋白(如抗凝血酶和纖維蛋白溶酶原)和凝血因子(如凝血酶原)都在肝中表達。通過分析這些蛋白為缺陷型的血栓形成或血友病患者的基因內(nèi)含子，發(fā)現(xiàn)了多種錯義突變和/或無義突變，這提示這些蛋白質(zhì)的內(nèi)含子對肝中的基因表達起關(guān)鍵作用(Jochmans, K.，等，Blood, 84 :3742-3748 (1994))。已發(fā)現(xiàn)在至少36種哺乳動物(包括人、大鼠、兔、山羊等等)中存在基因座控制區(qū)(LCR)。LCR是含有DNase I敏感區(qū)(其對轉(zhuǎn)錄因子具有組織特異性)的核苷酸序列。人β -珠蛋白 LCR 的功能是眾所周知的(Harju S.等，Exp. Biol. Med. 227 =683-700 (2002))。肝細胞控制區(qū)(hepatocyte control region, HCR)因其增強肝特異性基因表達的能力而眾所周知，該區(qū)發(fā)現(xiàn)于載脂蛋白E(ApoE)基因的下游。HCR具有與肝特異性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNase I敏感區(qū)域。HCR作為ApoE基因的肝特異性表達的LCR。ApoE HCR具有在與多種因子(如HNF3a、HNF4、GATA-1、C/EBP、TF-LF2和Alu家族)結(jié)合時被活化的位點。在這些位點中，表現(xiàn)出DNase I超敏感性的HNF3a結(jié)合位點具有TGTTTGC基序，DNase I可切開第一個 G 和第二個 T 之間的連接(Dang Q.，等，J. Biol. Chem. 270 :22577-22585 (1995))。事實上，已報道了向表達載體中引入ApoE HCR導(dǎo)致動物模型中hFIX表達提高(Miao C. H.，等·，Mol. Ther. I :522-532(2000))。已報道了具有與人ApoE基因的HCR(包含TGTTTGC基序)、人的載脂蛋白A-I、載脂蛋白B、轉(zhuǎn)鐵蛋白、甲胎蛋白、α I-抗胰蛋白酶等、以及小鼠中的甲胎蛋白、白蛋白等相似的序列的蛋白(Dang Q.，等·，J. Biol. Chem. 270 :22577-22585(1995))。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個目的是提供可用作轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的多核苷酸，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件用于以高水平持續(xù)表達肝組織特異性基因。本發(fā)明的另一目的是提供用于以高水平持續(xù)表達肝組織特異性基因的表達載體。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供具有SEQ ID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供多核苷酸，其包含具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸以及與SEQ ID NO :42之多核苷酸有效連接的至少一個多核苷酸，后者選自具有SEQ ID NO :44和45之核苷酸序列的多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供多核苷酸，其選自具有SEQ ID NO :46到57之核苷酸序列的多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供多核苷酸，其選自具有SEQ ID NO :58到61之核苷酸序列的多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供表達載體，其包含轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和與所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接并受其控制的編碼序列，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件包括I)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；2)具有SEQ ID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸以及與SEQ ID NO :42之多核苷酸有效連接的至少一個多核苷酸，后者選自具有SEQ IDNO :44和45之核苷酸序列的多核苷酸；3)具有SEQ ID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸以及與SEQ ID NO :42之多核苷酸有效連接的至少一個多核苷酸，后者選自具有SEQ IDNO :46到57之核苷酸序列的多核苷酸；4)具有SEQ ID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸以及與SEQ ID NO :42之多核苷酸有效連接的至少一個多核苷酸，后者選自具有SEQ IDNO :58到61之核苷酸序列的多核苷酸；5)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；選自具有SEQ IDNO 44和45之核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；以及選自具有SEQ ID NO 46到57之核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效連接；6)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；選自具有SEQ IDNO 44和45之核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；以及選自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效連接；7)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；選自具有SEQ IDNO 46到57之核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；以及選自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效連接；或者
8)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；選自具有SEQ IDNO 44和45之核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；選自具有SEQ ID NO 46到57之核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；以及選自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效連接。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供表達載體，其包含轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和與所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接并受其控制的編碼序列，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件包含啟動子和與所述啟動子有效連接的多核苷酸，所 述多核苷酸選自選自具有SEQ ID NO :46到57之核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；選自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；以及與選自具有SEQ ID NO 58到61核苷酸序列之多核苷酸的至少一個多核苷酸有效連接的選自具有SEQ ID NO :46到57核苷酸序列之多核苷酸的至少一個多核苷酸。


通過對本發(fā)明的下述描述結(jié)合下述附圖，本發(fā)明上述的和其他的目的和特征將變得顯而易見，所述附圖分別顯示圖IA :包含F(xiàn)VII啟動子的pCR-FVII Pro質(zhì)粒、包含有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽C(OATP-C)啟動子的pCR-OATP-C Pro質(zhì)粒和包含α-抗胰蛋白酶(AAT)啟動子/增強子的PCR-AAT Enh/Pro質(zhì)粒的示意圖；圖 IB mRLuc 螢光素酶表達載體 pmRL-FVII Pro、pmRL-FVII Δ Pro 和 pmRL-OATP-CPro的示意圖，其分別含有FVII啟動子、截短的FVII (FVIIA)啟動子和OATP-C啟動子；圖2A:直方圖，其顯示FVII啟動子和OATP-C啟動子在人臍靜脈內(nèi)皮細胞系(HUVEC)、人肝細胞癌細胞系(Huh-7)、人腎細胞系(HEK293)、人肺腺癌上皮細胞系(A549)和人宮頸癌細胞系(HeLa)中的表達效率；圖2B :含有FVII啟動子和FVII Δ啟動子的螢光素酶表達盒的示意圖，以及比較所述啟動子表達效率的直方圖；圖2C :直方圖，其通過與CMV啟動子比較的方式顯示FVII Λ啟動子、OATP-C啟動子、乙型肝炎病毒核心蛋白(HBcP)啟動子、內(nèi)皮糖蛋白(Endoglin)啟動子、細胞粘附分子(ICAM2)啟動子和酪氨酸激酶受體(Tie2)啟動子的表達效率；圖3A pCR-PAH enh和pCR-AMBP enh質(zhì)粒的示意圖，其分別含有苯丙氨酸羥化酶(PAH)增強子和α I-微球蛋白/尿抑胰酶素前體(AMBP)增強子；圖 3Β :pmRL-PF、pmRL-AF、pmRL-PAF、pmRL-P0、pmRL-A0 和 pmRL-PAO 表達載體的示意圖，其通過向含有FVII Λ啟動子的pmRL-FVII Δ Pro表達載體或者含有OATP-C啟動子的pmRL-OATP-CPro表達載體中插入選自PAH增強子和AMBP增強子中的至少一種構(gòu)建而成；圖4A :直方圖，其顯示根據(jù)PAH增強子和AMBP增強子與FVII Δ、0ATP_C、Tie_2和ICAM2啟動子組合方式的不同，在A549、HeLa和Huh_7中的體外螢光素酶表達水平；圖4B :直方圖，其通過與CMV啟動子比較的方式顯示當(dāng)AMBP增強子與FVII啟動子組合時在HEK293、A549、HeLa、Huh-7、人肝癌細胞系0fep3B)和HUVEC中螢光素酶表達效率；圖4C :直方圖，其顯示在將每種表達載體與聚乙烯亞胺(PEI)或體內(nèi)jetPEI的混合物注射入小鼠尾靜脈之后，帶有表達盒的表達載體在肝組織中的螢光素酶表達效率，所述表達盒含有PAH增強子、AMBP增強子、CMV增強子和SV40增強子以及圖4A中顯示的啟動子；
圖5 :不含有UTR的hFIX表達質(zhì)粒(FIX)和含有UTR的hFIX表達質(zhì)粒(FIXUTR)((a))以及含有多種內(nèi)含子的FIXUTR質(zhì)粒((b)、(c)和⑷)的示意圖(SD，剪接供體；SA，剪接受體；(G)3，三鳥嘌呤基序；BS，分支序列);圖6A =ELISA結(jié)果，其顯示從小鼠中獲得的血漿樣品中的hFIX蛋白表達水平，所述小鼠通過尾靜脈注射了帶有 CMV-hFIXUTR-Synlint、CMV_hFIXUTR-Syn2int、CMV-hFIX 和CMV-hFIXUTR表達盒的表達載體；圖6B =ELISA結(jié)果，其顯示在每周從免疫缺陷型小鼠獲得的血漿樣品中的hFIX蛋白表達水平，所述小鼠中注射了帶有CMV-hFIXUTR-Synlint表達盒的重組腺相關(guān)病毒的I X IO9個感染性顆粒(IP)；圖7A :螢光素酶表達盒的示意圖，所述表達盒在受TK啟動子控制的RLuc螢光素酶基因中含有內(nèi)含子；圖7B:直方圖，其顯示在用帶有表達盒(其含有圖7A中多種內(nèi)含子)的表達載體轉(zhuǎn)染的H印3B、HEK293和A549細胞中的螢光素酶表達水平；圖8A :逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)結(jié)果，其顯示在總RNA (從用圖7B表達載體轉(zhuǎn)染的A549細胞中提取)中RLuc和β -肌動蛋白的mRNA表達水平；圖8B:直方圖，其顯示用肌動蛋白對圖8A中所獲得的RLuc和β-肌動蛋白mRNA條帶強度進行歸一化的RLuc mRNA表達水平；圖9A :ELISA結(jié)果，其顯示從小鼠中獲得的血漿樣品中的hFIX蛋白表達水平，所述小鼠通過尾靜脈注射了帶有 CMV-hFIXUTR-SynlAT、CMV-hFIXUTR-Syn2AT、CMV-hFIXUTR-NA、CMV-hFIXUTR- Δ NAL, CMV-hFIXUTR- Δ NAS 表達盒以及作為對照帶有 CMV-hFIXUTR-Ο. 3kbFIXint (CMV-hFIXm2)表達盒(含O. 3kb FIX內(nèi)含子)的表達載體；圖9B =Western印跡分析結(jié)果，其顯示在用帶有CMV-hFIX、CMV-hFIXUTR和CMV-hFIXUTR- Δ NAL表達盒的表達載體轉(zhuǎn)染的ΗΕΚ293Τ中的hFIX蛋白表達水平；圖10 :不意圖,其顯不甲胎蛋白、AAT和白蛋白基因的5’端側(cè)翼區(qū)中，與在Apo E基因的LCR中所發(fā)現(xiàn)TGTTTGC基序相同或相似的基序的分布；圖IlA pCR-HCR和pCR-HCRm質(zhì)粒(分別含有HCR(已知為Apo E基因的肝細胞控制區(qū))和HCRm (已知為截短TGTTTGC基序的最小HCR結(jié)構(gòu)))以及pCR_AAT78001 cr/pCR-AAT1081cr、pCR-AFP38001cr和pCR_E61cr質(zhì)粒(分別含有甲胎蛋白、AAT和白蛋白的TGTTTGC基序)的示意圖；圖IlB pBS-HCRm-AATenh/pro (HmA)質(zhì)粒(通過向 pBluescriptll 載體中插入HCRm, AAT增強子和AAT啟動子構(gòu)建而成)和pBS-HCR-AATpro (HA)質(zhì)粒(通過向pBluescript II載體中插入HCR和AAT啟動子構(gòu)建而成)的示意圖；圖12A :表達盒的示意圖，其通過向含有PAH增強子、FVIIA啟動子和內(nèi)含子SynlPLA 的 hFIX 表達盒中引入多種 LCR(HCR、HCRm、AFP3800、AAT7800、AAT108 和 E6)而獲得;圖12B =ELISA結(jié)果，其顯示從小鼠中獲得的血漿樣品中hFIX蛋白表達水平，所述小鼠通過尾靜脈注射了帶有圖12A表達盒的表達載體和CMV-hFIXUTR-SynlPLA表達載體；
圖13A :示意圖，其顯示含有PAH增強子與FVII Λ啟動子(PF)的組合或者PAH增強子、AMBP增強子與FVII Δ啟動子(PAF)的組合、NAL內(nèi)含子以及AAT108LCR的表達盒；HmA (HCRm-AAT enh/pro) -hFIXUTR- Δ NAL 表達盒；以及 HA (HCR-AATpro) -hFIXUTR-1. 4kbFIXint表達盒；圖13B =ELISA結(jié)果，其顯示從小鼠中獲得的血漿樣品中hFIX蛋白表達水平，所述小鼠通過尾靜脈注射了帶有圖13A表達盒的表達載體以及CMV-hFIXUTR-Λ NAL表達載體；圖13C和13D:使用圖13Β中獲得的血漿樣品，通過活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time, APTT)方法所測得的凝血時間和活性；
圖14A和14B :分別顯示從血友病B小鼠中獲得的血漿樣品中的hFIX蛋白表達水平(通過ELISA測量)和凝血活性(通過APTT方法測量)的結(jié)果，所述小鼠通過門靜脈施用了 帶有 AAT108-PF-hFIXUTR- Δ NAL 和 AAT108-PAF_hFIXUTR- Δ NAL 表達盒以及作為對照帶有普通HA-hFIXUTR-1. 4kbFIXint和CMV-hFIXUTR-1. 4kbFIXint表達盒的重組腺相關(guān)病毒的2X IO9個傳染性顆粒(IP)；圖15A :表達載體的示意圖，其通過向PF-LK68-ANAL-UTR表達盒中引入多種LCR(HCR、HCRm、AFP3800、AAT7800、AAT108 和 E6)構(gòu)建而成；圖15B AAT108-PF/PAF-LK68 表達載體、AAT108-PF/PAF-LK68-UTR 表達載體和AAT108-PF/PAF-LK68- Δ NAL-UTR 表達載體的示意圖；圖16A :顯示從小鼠中獲得的血漿樣品中LK68蛋白表達水平的ELISA結(jié)果，所述小鼠通過尾靜脈注射了帶有引入多種LCR(HCR、HCRm、AFP3800、AAT7800、AAT108和E6)的PF-LK68-Λ NAL-UTR表達盒的表達載體；圖16Β :顯示從小鼠中獲得的血漿樣品中LK68蛋白表達水平的ELISA結(jié)果，所述小鼠通過尾靜脈注射了帶有已引入UTR或UTR和內(nèi)含子ANAL的AAT108-PF/PAF-LK68表達盒的表達載體；圖17Α :在ΗΕΚ293細胞及其培養(yǎng)基中LK68蛋白表達水平的Western印跡分析結(jié)果，所述細胞用帶有CMV-LK68和CMV-LK68-Λ NAL-UTR表達盒的復(fù)制缺陷型腺病毒以不同的感染復(fù)數(shù)比率(MOI)進行了轉(zhuǎn)染；以及圖17Β :從圖17Α的Western印跡分析結(jié)果中獲得的條帶強度的直方圖，以顯示UTR和內(nèi)含子對基因表達的影響。
具體實施例方式除非另行定義，否則本文中所用的科技術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所了解的相同意義。此外，本文中所提到的所有文件均通過參考以其整體并入本文。本文中所用的術(shù)語“表達載體”旨在理解為集合體(表達盒或構(gòu)建體)或包含該集合體的載體，所述集合體包含編碼序列、啟動子，并任選地包含與編碼序列有效連接的一個或多個轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。本文中所用的術(shù)語“編碼序列”指編碼氨基酸或者功能性RNA的DNA序列。本文中所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(順式調(diào)節(jié)元件或順式作用元件)”指位于編碼序列上游、內(nèi)部或下游的核苷酸序列，其控制RNA轉(zhuǎn)錄，以及所轉(zhuǎn)錄RNA的加工、穩(wěn)定性和隨后的翻譯。轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件包括啟動子、增強子、內(nèi)含子、5’和3’非翻譯區(qū)(UTR)和基因座控制區(qū)(LCR)。
本文中所用的術(shù)語“啟動子”和“增強子”是將編碼序列轉(zhuǎn)錄成RNA所需的DNA序列代表片段。通常，啟動子是指與聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA區(qū)段，增強子是指與聚合酶活化結(jié)構(gòu)域結(jié)合的DNA區(qū)段。本文中所用的術(shù)語“非翻譯區(qū)(UTR) ”是位于編碼序列3’端和5’端的序列，其包含作為轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的多腺嘌呤化信號等。本文中所用的術(shù)語“內(nèi)含子”是位于外顯子(轉(zhuǎn)錄后被翻譯為蛋白質(zhì))之間的非翻譯核苷酸序列。在通過剪接移除內(nèi)含子后，轉(zhuǎn)錄的mRNA前體轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒靘RNA。本文中所用的術(shù)語“內(nèi)含子”也旨在理解為剪接供體、剪接受體、三鳥嘌呤重復(fù)序列(三重G基序)和/或分支序列。本文中所用的術(shù)語“基因座控制區(qū)(LCR) ”指具有DNase I敏感性位點的核苷酸序列。組織特異性的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合于LCR。本文中所用的術(shù)語“有效連接”指一個或多個核酸序列與單個核酸片段偶聯(lián)，以影響所述單個片段的功能。例如，啟動子與編碼序列有效連接以增強所述編碼序列的表達。在下文中對本發(fā)明進行詳細描述。如前所述，對有效的基因療法，應(yīng)當(dāng)在特定組織或細胞中以持續(xù)方式特異性表達靶標(biāo)基因，以使靶標(biāo)基因替代致病基因。為實現(xiàn)組織特異性持續(xù)基因表達，需要包含改進的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的表達載體。因此，本發(fā)明提供截短的FVII(FVIIA)啟動子，其具有如SEQ IDN0:42所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列通過從SEQ ID NO 41之核苷酸序列中缺失XhoI (5’端)和BamHI (3’端)限制性位點而截去504bp FVII啟動子的5’端上游207bp片段而產(chǎn)生。下述實施例顯示所述FVII Δ啟動子具有的活性是未截短FVII啟動子的2. 5倍或更高。FVII Δ啟動子可與合適的增強子(例如選自具有如前所述SEQ IDNO 44中核苷酸序列的PAH增強子和具有如前所述SEQ ID NO :45中核苷酸序列的AMBP增強子中的至少一種)組合。本發(fā)明也提供內(nèi)含子，其選自具有如前所述SEQ ID NO 46到57中核苷酸序列的
多核苷酸。SEQ ID NO :46、47和48的內(nèi)含子分別由截短人抗凝血酶、纖維蛋白溶酶原和凝血酶原的內(nèi)含子I而產(chǎn)生。SEQ ID NO :49、50和51的內(nèi)含子是合成的內(nèi)含子，其分別包含SEQID NO :46、47和48之核苷酸序列，并共有剪接受體序列、來源于人α-珠蛋白內(nèi)含子2的三鳥嘌呤重復(fù)序列(三重G基序)、人纖維蛋白溶酶原的分支序列以及共有的剪接受體序列。SEQ ID NO :52、53和54的內(nèi)含子是合成的內(nèi)含子，其分別缺少SEQ ID Ν0:49、50和51之核苷酸序列的三重G基序和分支序列。SEQ ID NO :55的內(nèi)含子是合成內(nèi)含子，其包含抗凝血酶的全長內(nèi)含子I、剪接供體序列和共有的剪接受體序列；SEQ ID NO :56和57的內(nèi)含子是合成的內(nèi)含子，其由截短SEQ ID NO :55之核苷酸序列而產(chǎn)生。在上述內(nèi)含子中，更優(yōu)選SEQ ID NO 57的內(nèi)含子。本發(fā)明還提供基因座控制區(qū)(LCR)，其選自具有如SEQ ID NO 58到61所示核苷酸序列的多核苷酸。SEQ ID NO :58、59、60和61的LCR分別位于人α I-抗胰蛋白酶基因上游_108bp和-7. 8kb處、人甲胎蛋白上游-3. 8kb處和人白蛋白基因上游-6kb處，其中優(yōu)選SEQ ID NO:58 的 LCR。與本發(fā)明中所提到的序列基本相同且功能相似的多核苷酸也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。術(shù)語“基本相同且功能相似的多核苷酸”指某一多核苷酸與另一多核苷酸至少有70%、優(yōu)選80%、更優(yōu)選90%、最優(yōu)選95%的同一性，其中所述同一性由計算機算法或軟件所確定。本發(fā)明還提供表達載體，其包含轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和與所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接并受其控制的編碼序列，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件包括I)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；2)具有SEQ ID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸以及與SEQ ID NO :42之多核苷酸有效連接的至少一個多核苷酸，后者選自具有SEQ IDNO :44和45之核苷酸序列的多核苷酸；3)具有SEQ ID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸以及與SEQ ID NO :42之多核苷酸有效連接的至少一個多核苷酸，后者選自具有SEQ IDNO :46到57之核苷酸序列的多核苷酸；4)具有SEQ ID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸以及與SEQ ID NO :42之多核苷酸有效連接的至少一個多核苷酸，后者選自具有SEQ IDNO :58到61之核苷酸序列的多核苷酸；5)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；選自具有SEQ IDNO 44和45之核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；以及選自具有SEQ ID NO 46到57之核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效連接；6)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；選自具有SEQ IDNO 44和45之核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；以及選自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效連接；7)具有SEQ ID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸；選自具有SEQ IDNO :46到57之核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；以及選自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效連接；或者8)具有SEQ ID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸；選自具有SEQ IDNO :44和45之核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；選自具有SEQ ID NO 46到57之核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；以及選自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效連接。本發(fā)明還提供表達載體，其包含轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和與所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接并受其調(diào)控的編碼序列，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件包含啟動子和與所述啟動子有效連接的多核苷酸，所述多核苷酸選自選自具有SEQ IDNO 46到57之核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；選自具有SEQ ID NO :58到61之核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；以及與選自具有SEQ ID NO :58到61核苷酸序列之多核苷酸的至少一個多核苷酸有效連接的選自具有SEQ ID NO 46到57核苷酸序列之多核苷酸的至少一個多核苷酸。
優(yōu)選地，表達載體還可包含在編碼序列5’和3’端具有SEQ ID NO 62和63之核苷酸序列的多核苷酸。SEQ ID NO 62和63的核苷酸序列可來自FIX基因的5’和3’ UTR0
編碼序列可選自編碼肝特異性蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述蛋白質(zhì)包括但不限于白蛋白、甲胎蛋白、α-葡萄糖苷酶、α I-抗胰蛋白酶、抗凝血酶、脂蛋白、血漿銅藍蛋白、FVII, FVIII、FIX、紅細胞生成素、纖維蛋白原、葡糖腦苷脂酶、觸珠蛋白、IGF-1、胰島素、纖維蛋白溶酶原、凝血酶原和轉(zhuǎn)鐵蛋白。編碼序列與啟動子、增強子、內(nèi)含子、UTR和LCR有效且可控地連接。如上所述，本發(fā)明轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的適當(dāng)組合能夠?qū)崿F(xiàn)靶標(biāo)編碼序列的肝組織特異性表達，并有助于mRNA穩(wěn)定，因此使編碼序列的表達被提高。包含上述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的各種組合的表達盒或載體能夠使靶標(biāo)編碼序列在肝組織中以高水平持續(xù)表達，因此可廣泛應(yīng)用于血栓形成、血友病、肝癌 等的治療。下述實施例旨在舉例說明本發(fā)明而不限制其范圍。實施例I :肝組織特異性表達啟動子和增強子的分離和活性分析<步驟1>肝組織特異性表達啟動子的分離和活性分析使用DNeasy Tissue Kit (Qiagen)從人肝細胞系(Chang細胞)的細胞裂解物中提取基因組DNA。為了分離FVII啟動子，使用作為模板的基因組DNA、SEQ ID NO :1和2的引物組和DNA聚合酶(Ex-Taq、Takara)進行PCR，以獲得具有SEQ ID NO 41之核苷酸序列的DNA片段。具體地，PCR按照如下條件進行首先在94°C變性5分鐘；94°C變性30秒、56°C退火30秒和72°C延伸I分鐘的30個循環(huán)；72°C最終延伸3分鐘。將PCR產(chǎn)物通過凝膠提取進行純化，并插入到PCR2. 1-T0P0質(zhì)粒載體中。具有SEQ ID NO 41之核苷酸序列的FVII啟動子通過限制性酶切圖譜和序列分析進行鑒定。含有FVII啟動子的質(zhì)粒命名為“pCR-FVI Ipro”。此外，如前文所述進行PCR(但使用OATP-C啟動子的引物組(SEQ ID NO :3和4)和AAT啟動子的引物組(SEQ ID NO 5和6)之外，將PCR產(chǎn)物插入到pCR2. I-TOPO質(zhì)粒載體中。OATP-C啟動子(具有SEQ ID NO 43之核苷酸序列)和AAT啟動子通過限制性酶切圖譜和序列分析進行鑒定。含有OATP-C啟動子和AAT啟動子的質(zhì)粒分別命名為“pCR-OATP-Cpro” 和 “pCR-AAT enh/pro”。pCR-FVII pro、pCR-OATP-C pro 和 pCR-AATenh/pro 的不意圖顯不于圖IA中。將表達Renilla螢光素酶的phRL-null載體(Promega)中的SV40晚期poly (A)替換成人生長激素的Poly(A)，并且從其中去除T7啟動子和內(nèi)含子，以構(gòu)建pmRL-null載體。將所述pmRL-null載體用限制性酶BglII進行消化并用蝦堿性磷酸酶進行處理。用BamHI消化pCR-FVII pro和pCR-OATP-C pro質(zhì)粒。所得到的DNA片段通過凝膠提取進行純化，并插入到預(yù)先制備好的pmRL-null載體中。通過限制性酶切圖譜在每個質(zhì)粒載體中鑒定所需DNA片段。所述質(zhì)粒載體命名為“pmRL-FVII Pro”和“pmRL-0ATP-CPro”。同時，用EcoRI限制性酶截掉pmRL-FVII Pro中FVII啟動子5，端約200bp的片段，然后通過連接來構(gòu)建帶有截短FVII (FVIIA)啟動子(具有SEQ ID NO :42之核苷酸序列)的 pmRL-FVII ΔPro 質(zhì)粒。pmRL-FVII Pro、pmRL-OATP-C Pro 和 pmRL-FVII Δ Pro 的示意圖顯示于圖 IB 中。在人肝細胞系(Huh-7、H印G2、H印3B)、腎細胞系(HEK293)、肺癌細胞系(A549)和宮頸癌細胞系(HeLa)中測量 pmRL-FVII Pro、pmRL-FVII Λ Pro 和 pmRL-OATP-C Pro 的螢光素酶表達水平。具體地，用聚乙烯亞胺(PEI)試劑(Polyplus, Illkirch, France)在六孔板的每一個孔中培養(yǎng)細胞，以達到70到80%的匯合。將培養(yǎng)的細胞用2 μ g的pmRL-FVIIPro、pmRL-FVII Δ Pro 和 pmRL-OATP-C Pro 質(zhì)粒中每一種和 pcDNA-lacZ 質(zhì)粒 Iyg 進行轉(zhuǎn)染，并于37°C培養(yǎng)24小時。對細胞進行收集，并以3，OOOrpm離心5分鐘以分離細胞和培養(yǎng)基。在 100 μ I 裂解緩沖液(25mM Tris-磷酸、pH 7. 8、2mM DTT (二硫蘇糖醇)、2mM 1，2_ 二氨基環(huán)己烷ν,ν,ν,ν'-四乙酸、10%甘油、i%Triton x-ioo)中重懸細胞，然后凍融(3次)以完全裂解細胞。細胞裂解物以10，OOOrpm離心I分鐘。對所得上清液進行半乳糖苷酶測定和Bradford測定，以使轉(zhuǎn)染效率歸一化，啟動子活性通過螢光素酶活性分析進行測定。結(jié)果顯不于圖2A中。 如圖2A中所示，F(xiàn)VII啟動子和OATP-C啟動子在肝細胞系Huh_7中誘導(dǎo)更高水平的螢光素酶表達。在Huh-7細胞中，F(xiàn)VII Λ啟動子表現(xiàn)出的活性為FVII啟動子的2. 5倍(見圖2Β)。在Huh-7細胞中，F(xiàn)VII Λ啟動子表現(xiàn)出的表達效率為CMV啟動子的I. 4%，在來源于肝組織之外的其他組織的細胞系中平均為CMV啟動子表達效率的0. 07%。然而，與CMV啟動子不同，F(xiàn)VII Λ啟動子對肝組織的特異性是其他組織的20倍(見圖2C)。這一結(jié)果顯示，F(xiàn)VIIA啟動子提高靶標(biāo)基因的表達效率而對肝組織特異性無不利影響，因此其適用于在肝組織中選擇性作用的表達載體。在圖2C，(-)代表陰性對照(缺少啟動子)，ICAM2代表細胞內(nèi)粘附分子的啟動子，Tie2代表酪氨酸激酶受體的啟動子，內(nèi)皮糖蛋白代表內(nèi)皮糖蛋白的啟動子，HBcP代表乙型肝炎核心蛋白啟動子。<步驟2>分離增強子為了分離PAH增強子，如〈步驟1>所述進行PCR，但使用PAH增強子的弓丨物組(SEQID NO 7和8)。將PCR產(chǎn)物通過凝膠提取進行純化，并插入到pCR2. 1-T0P0質(zhì)粒載體中。具有SEQ ID NO :44之核苷酸序列的PAH增強子通過限制性酶切圖譜和序列分析進行鑒定。所述質(zhì)粒命名為“pCR-PAHenh”。此外，重復(fù)上述步驟，但使用AMBP增強子的引物組(SEQ IDNO 9和10)，以構(gòu)建帶有AMBP增強子(具有SEQ ID NO 45之核苷酸序列)的pCR-AMBPenh質(zhì)粒。pCR-PAHenh和pCR-AMBPenh質(zhì)粒的不意圖顯不于圖3A中。將PAH 和 AMBP 增強子通過用 SpeI 和 XbaI 消化 pCR-PAHenh 和 pCR-AMBPenh 質(zhì)粒加以分離，通過凝膠提取進行純化，并插入到〈步驟1>中所制備的pmRL-FVII APr0和pmRL-OATP-C Pro 載體的 SpeI 位點。與 PAH 增強子組合的 pmRL-FVII Δ Pro 和 pmRL-OATP-CPro分別命名為“pmRL-PF”和“pmRL-ΡΟ”。與AMBP增強子組合的pmRL-FVII Δ Pro和pmRL-OATP-C Pro 分別命名為 “pmRL-AF” 和 “pmRL-AO”。使用 SpeI 和 XbaI 從 pmRL-PF中提取PAH增強子，并將其插入到pmRL-AF和pmRL-ΑΟ的SpeI位點。所得的載體命名為“pmRL-PAF” 和 “pmRL-PAO”。pmRL-PF、pmRL-PO、pmRL-AF、pmRL-AO、pmRL-PAF 和 pmRL-PAO載體的示意圖顯示于圖3B中。根據(jù)上述步驟，向OATP-C和FVlI啟動子的上游插入能以非組織特異性的方式增強啟動子活性的CMV和SV40增強子。〈步驟3>根據(jù)啟動子與增強子的組合分析靶標(biāo)基因的表達效率〈3-1>體外測試在人肝細胞系(Huh-7)和對照細胞系(即人肺細胞系(A549)和人宮頸癌細胞系(HeLa))中，以與〈步驟1>中相同的方式測量〈步驟2>中所構(gòu)建的載體的基因表達效率。結(jié)果顯示于圖4A中。
如圖4A中所示，帶有PAH增強子和FVII Λ啟動子的載體在肝細胞系Huh-7中的特異性平均為其他細胞系的28. 4倍。這顯示PAH增強子使FVII Δ啟動子的組織特異性提高了 I. 42倍。AMBP增強子使FVII Λ啟動子的組織特異性提高了 213. 7倍或更多，這大約是由AMBP增強子引起的OATP-C啟動子組織特異性提高￠5. 6倍)的3倍。上述結(jié)果顯示，增強子可顯著提高FVII Λ啟動子的肝選擇性。為了測量AMBP增強子和FVII Λ啟動子控制下的表達載體相對于CMV啟動子控制下的表達載體的活性，在人肝細胞系(Huh-7、Hep3B)和對照細胞系(即腎細胞系(HEK293)、肺癌細胞系(A549)、宮頸癌細胞系(HeLa)和血管內(nèi)皮細胞系(HUVEC))中測量了螢光素酶的表達水平。結(jié)果顯示于圖4B中。如圖4B中所示，在肝細胞系中，含有AMBP增強子和FVII Λ啟動子的表達載體表現(xiàn)出的螢光素酶表達效率為含有CMV啟動子的表達載體的8. 7% ;在其他細胞系中，其平均為含有CMV啟動子的表達載體的螢光素酶表達效率的O. 14%。這顯示含有AMBP增強子和FVII Δ啟動子的表達載體的肝組織特異性約為其他組織的62倍高。〈3-2>體內(nèi)測試為了測量在肝中的體內(nèi)基因表達效率，向小鼠尾靜脈中注射〈步驟2>的pmRL質(zhì)粒與聚乙烯亞胺(PEI) (Polyplus, Illkirch,France)或體內(nèi) jetPEI (Polyplus, Illkirch,France)的每種復(fù)合物。兩天后，從所述小鼠中取出肝，并測量螢光素酶表達水平。具體而言，在5%葡萄糖溶液中將 40 μ g 的 pmRL-ΡΟ>pmRL-PF>pmRL-AO 和 pmRL-AF質(zhì)粒中每一種和pcDNA-LacZ質(zhì)粒10μ g以與PEI或體內(nèi)jetPEI的復(fù)合物的形式注射入小鼠(六周齡)尾靜脈中。兩天后，將肝、腎、心臟、脾和肺組織從小鼠中分離，并在PBS溶液中用勻漿器進行勻漿。然后，將500 μ I所得組織溶液與500 μ 12X裂解緩沖液(50mMTris-磷酸、pH 7. 8、4mM DTT (二硫蘇糖醇)、4mM 1，2-二氨基環(huán)己烷N，N，N，N'-四乙酸、20%甘油、2%Triton x-ioo)混合，其后進行凍融(3次)以完全裂解細胞。細胞裂解物以10，OOOrpm離心I分鐘。所得上清進行半乳糖苷酶測定和Bradford測定以使轉(zhuǎn)染效率歸一化，基因表達效率通過螢光素酶活性測定進行測量。結(jié)果顯示于圖4C中。如圖4C中所示，在肝組織中，由含有FVII Λ啟動子/PAH增強子的表達載體與PEI的復(fù)合物誘導(dǎo)的螢光素酶表達水平等于由CMV啟動子誘導(dǎo)的14%，這是螢光素酶表達體外測定的14倍或更高。由FVII △啟動子/AMBP增強子誘導(dǎo)的肝特異性螢光素酶表達水平等于由CMV啟動子誘導(dǎo)的80%，這是螢光素酶表達體外測定的10倍或更高。用體內(nèi)jetPEI代替PEI提高了肝中的基因表達效率。具體地，由含有OATP-C啟動子/PAH增強子的表達載體與體內(nèi)jetPEI的復(fù)合物誘導(dǎo)的肝特異性螢光素酶表達水平等于由CMV啟動子誘導(dǎo)的約38%，由FVII Λ啟動子/PAH增強子誘導(dǎo)的螢光素酶表達水平等于由CMV啟動子誘導(dǎo)的約80%。由FVII Λ啟動子/AMBP增強子和體內(nèi)jetPEI的復(fù)合物誘導(dǎo)的肝特異性螢光素酶表達水平與由CMV啟動子誘導(dǎo)的相似。這些結(jié)果顯示，本發(fā)明啟動子和增強子的活性在體內(nèi)優(yōu)于體外。實施例2 :分離hFIX UTR和肝特異性基因的內(nèi)含子，并分析UTR和內(nèi)含子的基因表達效率<步驟1>鑒定hFIX的UTR并構(gòu)建包含UTR的表達載體
使用RNA提取試劑盒(Pharmacia Biotech)從Ig人肝組織中提取了 I. 2mg的總RNA,預(yù)先用勻漿器對所述組織進行勻漿。使用作為模板的所提取RNA、M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Takara)和oligo_dT17引物(Takara)合成單鏈DNA,使用DNA聚合酶I(Takara)由單鏈DNA合成雙鏈cDNA。為了評估FIX UTR對基因表達效率的影響，使用作為模板的cDNA、從FIX核苷酸序列(Genbank登錄號ΝΜ000133)設(shè)計的引物組(SEQ ID NO : 11和12)和Ex-Taq進行PCR，以獲得具有 5’UTR(SEQ ID NO 62)和 3’UTR(SEQ ID NO :63)的 FIX cDNA。PCR 條件如下:首先94°C變性5分鐘；94°C變性I分鐘、56 °C退火I分鐘、72 °C延伸I分鐘的30個循環(huán)；最后72 °C延伸3分鐘。 除了使用SEQ ID NO 13和14的引物組之外，重復(fù)上述步驟，以獲得不含UTR的FIX cDNA作為對照。將擴增的DNA片段用限制性酶NotI和SalI進行消化，通過凝膠提取進行純化，并插入到pBluescript SK(+)載體的NotI和SalI限制性位點。包含所需UTR的FIX和不含UTR的FIX通過限制性酶切圖譜和序列分析進行鑒定。所述載體分別命名為“pBS-hFIXUTR”和 “pBS-hFIX”(見圖 5(a))。<步驟2>分離肝特異性基因的內(nèi)含子并構(gòu)建包含內(nèi)含子的表達載體〈2-1> 構(gòu)建 pCR-int首先，進行PCR以獲得包含人抗凝血酶、纖維蛋白溶酶原和凝血酶原內(nèi)含子I中5'端約300bp的片段。具體而言，使用實施例I〈步驟1>中所述的基因組DNA(作為模板)以及人抗凝血酶內(nèi)含子(SEQ ID N0:15和16)、人纖維蛋白溶酶原內(nèi)含子(SEQ ID N0:17和18)和人凝血酶原酶內(nèi)含子(SEQ ID NO :19和20)的引物組在下述條件下進行PCR:首先94°C變性5分鐘；94°C變性I分鐘、60°C退火I分鐘、72°C延伸2分30秒的30個循環(huán)；最后72°C延伸3分鐘。將PCR產(chǎn)物通過凝膠提取進行純化，并插入到pCR2. 1-T0P0載體中。SEQ IDNO 46,47和48的內(nèi)含子通過限制性酶切圖譜和序列分析進行鑒定。所述質(zhì)粒分別命名為“pCR-ATint”、“pCR-PLAint” 和 “pCR-PTint”。進一步地，為了分離Kurachi S所報道的FIX內(nèi)含子1，重復(fù)上述PCR步驟，但使用FIX內(nèi)含子I的引物組(SEQ ID NO :21和22)，并將所獲得的PCR產(chǎn)物插入到pCR2. I-TOPO載體中。所產(chǎn)生的質(zhì)粒載體用限制性酶PvuI或ScaI進行消化，并進行自連。具有不同大小的FIX內(nèi)含子通過限制性酶切圖譜和序列分析進行鑒定。所述質(zhì)粒分別命名為“pCR-1. 4kbFIXint”和“pCR-0. 3kbFIXint”。<2-2> 構(gòu)建 pBS-FIX-Synlint在FIX的外顯子I和2之間插入〈2-1>中所制備的pCR-ATint、pCR-PLAint和pCR-PTint內(nèi)含子片段。具體而言，重復(fù)〈2-1>的PCR，但使用FIX 5’ UTR的有義引物(SEQ ID NO 11)和共有剪接供體序列GTAA和三重G基序(來源于人α-珠蛋白的內(nèi)含子2)的反義引物(SEQID NO :23)，以獲得包含F(xiàn)IX的5’UTR和外顯子I、剪接供體和人α-珠蛋白三重G基序的DNA片段。進一步地，重復(fù)上述PCR，但使用人纖維蛋白溶酶原的分支序列和共有剪接受體序列TCGA的有義引物(SEQ ID NO 24)和FIX3，UTR的反義引物(SEQ ID NO 12),以獲得包含分支序列、剪接受體、外顯子2至8和FIX 3’UTR的DNA片段。將PCR產(chǎn)物通過凝膠提取進行純化，并插入到PCR2. I-TOPO載體中。所需的DNA片段通過限制性酶切圖譜和序列分析進行鑒定。所述質(zhì)粒分別命名為“pCR-5’ hFIX”和“pCR-3’ hFIX”。將pCR-5’hFIX和pCR_3’hFIX分別用限制性酶NotI和NdeI以及NdeI和SalI進行消化，均插入到pBluescript的NotI和SalI限制性位點。所得質(zhì)粒用NdeI進行消化，并插入用相同的酶(NdeI)預(yù)處理的 〈2-1>的pCR-ATint、pCR-PLAint和pCR-PTint中。所需的SEQ IDN0:49、50和51內(nèi)含子通過限制性酶切圖譜和序列分析進行鑒定。所述質(zhì)粒分別命名為 “pBS-hFIXUTR-SynlAT” “pBS-hFIXUTR-SynlPLA” 和 “pBS-hFIXUTR-SynlPT”。所述質(zhì)粒的示意圖顯示于圖5(b)中。<2-3> 構(gòu)建 pBS-FIX_Syn2int將〈2-2>的pBS-FIXUTR-SynlPLA質(zhì)粒用XhoI和AatII進行消化(針對與剪接供體和受體相鄰的XhoI和AatII限制性位點)，并插入用相同的酶(XhoI和AatII)預(yù)處理的〈2-1> 的 pCR-ATint、pCR-PLAint、pCR-PTint、pCR-1. 4kbFIXint 和 pCR-0. 3kbFIXint中。Syn2AT、Syn2PLA 和 Syn2PT(SEQ ID NO :52、53 和 54)的內(nèi)含子以及 I. 4kbFIXint和0.3kbFIXint的內(nèi)含子通過限制性酶切圖譜進行鑒定。所述質(zhì)粒分別命名為“pBS-hFIXUTR-Syn2AT”、“pBS-hFIXUTR-Syn2PLA”、“pBS-hFIXUTR-Syn2PT”、“pBS-hFIXUTR-I. 4kbFIXint (hFIXml) ”和“pBS-hFIXUTR-Ο. 3kbFIXint (hFIXm2) ”。所述質(zhì)粒的示意圖顯示于圖5 (c)中。<2-4>分離抗凝血酶全長內(nèi)含子I并構(gòu)建縮短的抗凝血酶內(nèi)含子重復(fù)〈2-1>的PCR，但使用SEQ ID NO :15和25的引物組，以擴增包含抗凝血酶全長內(nèi)含子I的片段。將大約2. 3kb的PCR產(chǎn)物插入到pCR2. 1-T0P0載體中，其命名為“pCR-NAint”。所得的質(zhì)粒用XhoI和AatII進行消化，并根據(jù)〈2_3>的步驟插入到pBS-hFIXUTR 中，以獲得包含 SEQ ID NO 55 內(nèi)含子的 pBS-hFIXUTR-ΝΑ。使用Kilo-Sequence Deletion Kit (Takara)從 PvuII 位點截短在pBS-hFIXUTR-ΝΑ中所插入的內(nèi)含子。具體地，將pBS_FIXUTR_NA用PvuII進行消化，用核酸外切酶III在25°C降解15秒、30秒、45秒和I分鐘，用綠豆核酸酶和klenow酶進行末端補平，最后進行自連。將所得的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。將所得的轉(zhuǎn)化體在氨芐青霉素平板上進行培養(yǎng)并從其中篩選單菌落，來源于所述菌落的質(zhì)粒中內(nèi)含子的大小使用限制性酶通過電泳進行鑒定。對帶有正確大小內(nèi)含子的質(zhì)粒進行純化和測序，以獲得包含SEQID NO 56 的 81 Ibp 內(nèi)含子的質(zhì)粒 pBS-hFIXUTR-Λ NAL 以及包含 SEQ ID NO 57 的 640bp內(nèi)含子的質(zhì)粒 pBS-hFIXUTR-ANAS。所述質(zhì)粒 pBS-hFIXUTR-ΝΑ、pBS-hFIXUTR-ΔNAL 和pBS-hFIXUTR-ANAS的示意圖顯示于圖5(d)中。<步驟3>分析UTR和內(nèi)含子對FIX表達的影響將〈步驟1>和〈步驟2>中所制備的pBS-hFIX、pBS-hFIXUTR、pBS-hFIXUTR-Synlint(AT, PLA, PT)和 pBS_hFIXUTR-Syn2int(AT、PLA, PT、I. 4kbFIXint、0. 3kbFIXint)質(zhì)粒用NotI和Sail進行消化，并插入到含有CMV啟動子和牛poly (A)的pTRUF6腺相關(guān)病毒載體中，以獲得hFIX表達載體CMV-hFIX、CMV-hFIXUTR、CMV-hFIXUTR-Synlint (AT、PLA, PT)和 CMV_hFIXUTR-Syn2int (AT、PLA, PT、I. 4kbFIXint、0.3kbFIXint)。
將25 μ g上述表達載體的質(zhì)粒DNA注射到C57BL/6小鼠尾靜脈中。第二天，收集血液樣品用于下述ELISA。將所得血液樣品在HBS-BSA-EDTA-T20 緩沖液(O. 1MHEPES-0. IM NaCl-I %BSA-IOmM EDTA-0. I % Tween-20)中稀釋100倍。將稀釋的血液樣品加入到包被了人FIX (hFIX)抗體(AffinityBiologicals)的 96 孔板中，于室溫培養(yǎng) 90 分鐘，用 PBS-0. 1%Tween-20洗滌，并與過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育。將平板再次用PBS-0. I % Tween-20進行洗滌，并向其中加入溶有O-苯二胺和H2O2的底物緩沖液。將平板孵育5分鐘，并用2. 5MH2SO4 終止反應(yīng)。用分光光度計(Spectra Shell Microplate Reader, STL Spectra,Milan,Italy)在490nm測量吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)吸光度對標(biāo)準(zhǔn)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的hFIX濃度。結(jié)果顯示于圖6A中。如圖6A中所示，注射后第二天，由CMV-hFIXUTR所誘導(dǎo)的hFIX蛋白的血液濃度約為910ng/ml，是由不含UTR的CMV-hFIX所誘導(dǎo)蛋白(540ng/ml)的約I. 7倍。這表明UTR有助于hFIX的表達。CMV-hFIXUTR-SynlPLA 的 hFIX 表達水平(1，480ng/ml)高至 CMV_hFIXUTR(910ng/ml)的 I. 6 倍，CMV-hFIXUTR-Syn2AT 的 hFIX 表達水平(2，170ng/ml)高至CMV-hFIXUTR(910ng/ml)的2. 4倍。這表明該內(nèi)含子參與hFIX基因表達及最初的hFIX蛋白誘導(dǎo)。同時，使用表達載體 CMV-hFIX、CMV-hFIXUTR 和 CMV-hFIXUTR-Synlint (AT、PLA, PT)產(chǎn)生重組腺相關(guān)病毒 rAAV-CMV-hFIX、rAAV-CMV-hFIXUTR 和rAAV-CMV-hFIXUTR-Synlint (AT、PLA, PT)。具體地，在 500mlSpinner 瓶中制備 200ml 的HEK293T細胞，用低鈣DMEM培養(yǎng)基(O. ImM Ca++、0. I % PL-68U % FBS)將所述細胞調(diào)整成I X IO6個細胞/ml的濃度。向細胞中載入包含33 μ g的表達載體中每一種、167 μ g的腺病毒輔助質(zhì)粒PDG和650 μ I的10 μ M PEI的DNA-PEI混合物，并將所述細胞在5% CO2培養(yǎng)箱中以30rpm懸浮培養(yǎng)6小時。然后，將培養(yǎng)基更換成100 μ g硫酸葡聚糖低鈣DMEM。培養(yǎng)48小時后，收集細胞，對其進行凍融(3次)并以2000rpm離心5分鐘。所得上清液通過碘克沙醇梯度超速離心法進行純化(Zolotukhin, S.等，Gene Ther，6 :973-985 (1999))。將I X IO9個感染性顆粒(IP)注射到免疫缺陷型裸鼠(Japan SLC Inc)的尾靜脈中。兩周后，每周收集一次血液樣品，并將其用于上文所描述的ELISA。結(jié)果顯示于圖6B中。如圖6B中所示，病毒注射后14周時，包含本發(fā)明內(nèi)含子的病毒的hFIX表達水平是不含內(nèi)含子的病毒的10到20倍。具體地，帶有CMV-hFIXUTR-SynlAT的病毒的hFIX蛋白濃度為19，996pg/ml，而帶有CMV-hFIXUTR的病毒的hFIX蛋白濃度為2，024pg/ml。這表明本發(fā)明內(nèi)含子在增強基因表達方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。<步驟4>分析內(nèi)含子對螢光素酶表達效率及mRNA穩(wěn)定性的影響<4-1>向由TK啟動子控制的螢光素酶表達載體中引入內(nèi)含子將pRL-TK表達載體(promega)用Hindlll/Nhel消化以去除SV40內(nèi)含子，其后進行末端補平及自連。內(nèi)含子截短的PRL-TK載體命名為“pRL-Aint”，含有SV40內(nèi)含子的pRL-TK 載體命名為 “pRL-SV40”。
將〈2-2>和〈2-3> 中得到的 pBS-hFIXUTR-SynlAT、pBS-hFIXUTR-SynlPLA和pBS-hFIXUTR-Ο. 3kbFIXint用Xhol/Aatll進行消化及末端補平。將所得片段插入到上述表達載體pRL- Δ int。所得載體分別命名為“pRL-SynlAT”、“pRL-SynlPLA”和“pRL-hFIXm2”(見圖 7A)?！?-2>分析螢光素酶表達效率如實施例I〈步驟1>中所述，將2μ8〈4-1>的螢光素酶表達載體、I μ g β _半乳糖苷酶表達載體和6yg PEI (polyplus)的復(fù)合物注射到肝細胞系0fep3B)、腎細胞系(HEK293)和肺細胞系(A549)中。48小時后，收集細胞并根據(jù)與實施例1〈步驟1>中相同的方法測量螢光素酶表達效率。結(jié)果顯示于圖7B中。如圖7B中所示，由含有內(nèi)含子的表達載體所誘導(dǎo)的螢光素酶表達高達由不含內(nèi)含子的表達載體所誘導(dǎo)的200倍(SynlAT在Hep3B肝細胞系中表達的情況)。特別地，SynlAT表達載體明顯有助于螢光素酶活性的誘導(dǎo)以及如〈步驟3>中所述的FIX表達的誘 導(dǎo)。<4-3>分析mRNA表達穩(wěn)定性根據(jù)與〈4-2>中相同的方法，將〈4-1>的螢光素酶表達載體轉(zhuǎn)染到A549肺細胞系中，48小時后收集細胞。使用FastPure RNA試劑盒(Takara)從所述細胞中提取總RNA。使用500ng每種總RNA (作為模板)和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Takara)制備單鏈DNA。然后，使用上述單鏈DNA(作為模板)以及檢測螢光素酶和β_肌動蛋白的引物組進行PCR。結(jié)果顯示于圖8Α和8Β中。如圖8Α和8Β中所示，由pRL-SynlAT載體所誘導(dǎo)的RLuc mRNA相對量是由PRL-Aint所誘導(dǎo)的RLuc mRNA的I. 7倍。這表明，本發(fā)明內(nèi)含子導(dǎo)致了 mRNA的更高穩(wěn)定性，這種更高的穩(wěn)定性導(dǎo)致增強的基因表達。<步驟5>分析抗凝血酶內(nèi)含子對FIX表達的影響為了確定抗凝血酶內(nèi)含子對hFIX蛋白表達的影響，根據(jù)與〈步驟3>中相同的方法，將〈2-4> 中所制備的 pBS-hFIXUTR-ΝΑ、pBS-hFIXUTR- Δ NAL 和 pBS_hFIXUTR_NAS 質(zhì)粒插入到pTRUF6腺相關(guān)病毒中，以獲得表達載體CMV-hFIXUTR-ΝΑ、CMV-hFIXUTR-ΔNAL和CMV-hFIXUTR- Δ NAS。根據(jù)與〈步驟3>中相同的方法，將表達載體CMV_hFIX、CMV_hFIXUTR、CMV-hFIXUTR-Ο. 3kbFIXint (CMV_hFIXm2)、CMV-hFIXUTR-SynlAT、CMV_hFIXUTR-Syn2AT、CMV-hFIXUTR- Δ NA、CMV-hFIXUTR- Δ NAL 和 CMV-hFIXUTR- Δ NAS 的質(zhì)粒 DNA 注射到小鼠尾靜脈中，并通過ELISA測量受試者血液hFIX濃度。結(jié)果顯示于圖9A中。如圖9A中所示，含有合成或天然抗凝血酶內(nèi)含子的表達載體的hFIX蛋白濃度是 CMV-hFIXUTR 的 I. 7 到 3. 5 倍(I, 730 到 3，540ng/ml 對 I, 000ng/ml)。特別地，CMV-hFIXUTR- Δ NAL表達載體表現(xiàn)出的表達效率是以前所構(gòu)建的CMV_hFIXm2表達載體的約I. 7倍(2，010ng/ml對1，000ng/ml)。這表明ANAL內(nèi)含子非常適于hFIX的過表達。同時，為了在體外評估內(nèi)含子ΛNAL對hFIX表達的影響，將表達載體CMV-hFIX、CMV-hFIXUTR和CMV-hFIXUTR- Δ NAL轉(zhuǎn)染到ΗΕΚ293Τ腎細胞系中。轉(zhuǎn)染后兩天，收集細胞及培養(yǎng)基并進行裂解。裂解物中hFIX蛋白水平通過使用hFIX抗體的電泳法進行測量，結(jié)果顯示于圖9B中。如圖9B中所示，CMV-hFIXUTR- Δ NAL表達載體誘導(dǎo)的hFIX表達水平是CMV-hFIX和CMV-hFIXUTR表達載體的I. 55倍。這一結(jié)果表明Λ NAL內(nèi)含子對于hFIX過表達是很有效的。
實施例3 :分離肝特異性LCR并分析LCR的基因表達效率
<步驟1>分離肝特異性LCR并構(gòu)建包含LCR的質(zhì)粒載體在僅表達于肝組織中的α I-抗胰蛋白酶、甲胎蛋白和白蛋白基因的下游分析TGTTTGC基序的位置。結(jié)果顯示于圖10中。如圖10中所示，七個TGTTTGC基序分布在α I-抗胰蛋白酶基因的_7. 8kb，六個基序為正向的，一個基序為反向的；還有一個正向的基序位于α I-抗胰蛋白酶基因的_108bp位點。在甲胎蛋白-3. 8kb位點，兩個TGTTTGC基序以正向分布，一個基序為反向；在白蛋白基因的-6kb位點，一個基序為反向。此外，TGTTTGC基序在α I-抗胰蛋白酶基因_800bp位點、甲胎蛋白基因-I. 5kb和-500bp位點以及白蛋白基因-IOkb, -3. 5kb和-2. 6kb位點聚簇。在這些位點中，對α I-抗胰蛋白酶基因-7. 8kb和_108bp位點、甲胎蛋白基因的-3. 8kb位點和白蛋白基因_6kb位點進行分離。具體而言,為了分離位于α I-抗胰蛋白酶基因_108bp位點的LCR,使用實施例1〈步驟1>的基因組DNA (作為模板)、SEQ ID NO 26和27的引物組和DNA聚合酶(Ex-Taq、Takara)根據(jù)與實施例1〈步驟1>中相同的方法進行PCR。將PCR產(chǎn)物通過凝膠提取進行純化，并插入到PCR2. 1-T0P0載體中。所需具有SEQ ID NO :58之核苷酸序列的α I-抗胰蛋白酶LCR通過限制性酶切圖譜和序列分析進行鑒定。所述質(zhì)粒命名為“pCR-AAT1081cr”。相似地，重復(fù)上述PCR步驟，但使用引物組SEQ ID NO: 28和29、SEQ ID NO : 30和31以及SEQ ID NO :32和33，以分別擴增位于人α I-抗胰蛋白酶的-7. 8kb位點、人甲胎蛋白的-3. 8kb位點和人白蛋白基因的_6kb位點的LCR。將PCR產(chǎn)物插入到pCR2. 1-T0P0載體中。所需具有SEQ ID NO :59、60和61之核苷酸序列的LCR通過限制性酶切圖譜和序列分析進行鑒定。所述質(zhì)粒分別命名為 “pCR-AAT78001cr”、“pCR-AFP38001crm“pCR-E61cr”。同時，為了分離Dang Q.所報道的人載脂蛋白E (ApoE)基因的肝細胞控制區(qū)(HCR)和最小結(jié)構(gòu)HCR(HCRm)，使用引物組SEQ IDN0:34和35以及SEQ ID NO :34和36進行PCR，并將所得的PCR產(chǎn)物插入pCR2. 1-T0P0載體中。人ApoE基因的HCR和HCRm通過限制性酶切圖譜和序列分析進行鑒定。所述質(zhì)粒分別命名為“pCR-ApoEHCR”和“pCR-ApoEHCRm”。這些質(zhì)粒的示意圖顯示于圖IlA中。進一步地，將AAT基因的增強子和啟動子與HCRm的組合插入到pBluescript II載體中以構(gòu)建pBS-HCRm-AATenh/pro (HmA)，將AAT基因的啟動子與HCR的組合插入到pBluescript II載體中以構(gòu)建pBS-HCR-AATpro (HA)。這些質(zhì)粒的示意圖顯示于圖IlB中?！床襟E2>分析LCR的基因表達效率對〈步驟1>中所分離的LCR與啟動子、增強子及內(nèi)含子的組合，對FIX表達效率的影響進行評估。具體而言，將〈步驟1> 中所制備的 pCR-AAT 1081 cr、pCR_AAT7800cr、pCR-AFP38001cr、pCR_E61cr、pCR-HCR 和 pCR-HCRm 質(zhì)粒用 HindIII/EcoRV 進行消化，并插入到實施例1〈步驟2>中所制備的pBS-PF的HindIII/EcoRI (稍后補平)限制性位點，以分別獲得 pBS-AAT108-PF、pBS-AAT7800_PF、pBS-AFP3800_PF、pBS_E6_PF、pBS-HCR-PF和pBS-HCRm-PF。將這些質(zhì)粒用KpnI和NotI再次進行消化，并插入到實施例2〈步驟5>中所制備的pBS-CMV-hFIXUTR-SynlPLA的KpnI/Notl限制性位點，以獲得 pBS-AAT108-PF-hFIXUTR-SynlPLA、pBS-AAT7800-PF-hFIXUTR-SynlPLA、pBS—AFP3800—PF—hFIXUTR—SynlPLA、pBS_E6_PF_hFIXUTR_SynlPLA、pBS-HCR-PF-hFIXUTR-SynlPLA 和 pBS-HCRm-PF-hFIXUTR-SynlPLA。這些質(zhì)粒的示意圖顯示于圖12A中。將所述質(zhì)粒用KpnI和SalI進行消化，并插入到pTRUF6腺相關(guān)病毒的KpnI/Sall 限制性位點，以獲得表達載體AAT108-PF-hFIXUTR-SynlPLA、AAT7800-PF-hFIXUTR-SynlPLA、AFP3800-PF_hFIXUTR-SynlPLA、E6-PF_hFIXUTR-SynlPLA、HCR-PF-hFIXUTR-SynlPLA 和 HCRm-PF_hFIXUTR-SynIPLA。將所述表達載體的質(zhì)粒 DNA 根據(jù) 與實施例2〈步驟3>中的相同方法注射到小鼠尾靜脈中，通過ELISA測定hFIX蛋白的表達水平。結(jié)果顯示于圖12B中。如圖12B中所示，注射兩天后，包含LCR的表達載體表現(xiàn)出的hFIX表達水平高達 CMV-hFIXUTR-SynlPLA 的 I 倍(AAT7800-PF_hFIXUTR-SynlPLA7, 640ng/ml 對 CMV-hF I XUTR-Syn IPLA 1，090ng/ml)。特別地，直到注射后 4 周，AAT108-PF-hFIXUTR-SynlPLA仍持續(xù)表達390ng/ml或更高的hFIX，這ー表達水平高達HCR-PF-FIX-SynlPLA (250ng/ml)的I. 6倍。該結(jié)果表明AAT108內(nèi)含子非常適于hFIX的持續(xù)表達。實施例4 :評估本發(fā)明表達載體對血友病B的治療效果根據(jù)與實施例3〈步驟2>中相同的方法，用實施例I〈步驟2>中所制備的pBS-PAF構(gòu)建表達載體AAT108-PAF-hFIXUTR-SynlPLA。然后，將實施例2〈2_4>中所構(gòu)建的pBS-CMV-hFIXUTR- A NAL用NotI和SalI進行消化，并插入到實施例3く步驟2>中所構(gòu)建的AAT108-PF-hFIXUTR-SynlPLA 和 AAT108-PAF_hFIXUTR-SynlPLA 的 Notl/Sall 限制性位點，以獲得 AAT108-PF-hFIXUTR- A NAL 和 AAT108-PAF_hFIXUTR- A NAL。同時，將實施例I〈步驟1>的pCR-AAT enh/pro用SpeI (稍后補平末端)/NotI進行消化，并插入到實施例3く步驟2>的pCR-HCRm的EcoRV/Notl限制性位點，以獲得pCR-HCRm-AATenh/pro 表達載體(HmA)。將 pCR-HCRm-AATenh/pro (HmA)表達載體用 KpnI和NotI進行消化，并插入到實施例2く步驟5>中所構(gòu)建的CMV-hFIXUTR-A NAL的KpnI和NotI限制性位點，以獲得HmA-hFIXUTR-NAL表達載體。將實施例Iく步驟1>中所描述的pCR-AAT enh/pro用BglII (稍后補平)/NotI進行消化，并插入到實施例3く步驟2>中所描述的pCR-HCR的EcoRV/Notl限制性位點，以獲得 pBS-HCR-AATpro (HA)表達載體。將 pBS-HCR-AATpro (HA)表達載體用 KpnI/Notl 進行消化，并插入到實施例2く步驟3>中所描述的CMV-hFIXUTR-1. 4kbFIXint的KpnI/Notl限制性位點，以獲得HA-hFIXUTR-1. 4kbFIXint表達載體。所述表達載體的示意圖顯示于圖13A中。將25 u g 的 AAT108-PF-hFIXUTR-ANAL、AAT108-PAF-hFIXUTR-ANAL、HmA-hFIXUTR- A NAL和CMV-hFIXUTR-A NAL(實施例2く步驟5>中所制備)表達載體的每一種質(zhì)粒DNA注射到血友病B小鼠的尾靜脈中，并通過ELISA測定hFIX蛋白濃度和凝血活性。如圖13B中所示，相對于由HmA-hFIXUTR-ANAL表達載體所誘導(dǎo)的hFIX表達水平，由AAT108-PAF-hFIXUTR-ANAL表達載體所誘導(dǎo)的hFIX表達水平在注射后第I天為9.8%，第2天為30.6%、第7天為82%，第2周為108%，第9周為208%。此外，相對于由HmA-hFIXUTR- A NAL表達載體所誘導(dǎo)的hFIX表達水平，由AAT108_PF_hFIXUTR- A NAL表達載體所誘導(dǎo)的hFIX表達水平在注射后第I天為9 %，第2天為19. 2 %，第7天為41. 9 %，第2周為56. 9%，第9周為73. 0%。用hFIX表達載體注射的血友病B小鼠和正常小鼠的凝血活性通過如下的活化部分凝血活酶時間(APTT)方法進行測定。將FIX缺陷型血漿、10倍稀釋的小鼠血漿、活化的肌動蛋白(各50 ill)相混合，并在37°C孵育3分鐘。向其中加入CaCl2，用血液凝集檢測器KClOA (Amelung)測定樣品凝結(jié)所消耗的時間。正常小鼠的凝血時間約為44秒，血友病B小鼠約為65秒。如圖13C中所示，直到注射后3天，施用了 hFIX表達載體的血友病B小鼠才顯示出正常凝血時間的約80 %。7天后，施用了 CMV-hFIXUTR- A NAL的小鼠的凝血時間回復(fù)到注射前的水平，而施用了 AAT108-PF -hFIXUTR- A NAL 和 AAT108-PAF_hFIXUTR- A NAL的小鼠表現(xiàn)出凝血時間改善為50到60秒。進ー步地，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)活性對標(biāo)準(zhǔn)凝血時間的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算所述樣品的凝血活性。如圖 13D 中所示，用 AAT108-PF-hFIXUTR- A NAL 和 AAT108-PAF_hFIXUTR- A NAL 表達載體處理的血友病B小鼠的凝血活性在注射后8周分別為正常小鼠的34. 1%和29. 3%0特別地，用AAT108-PAF-hFIXUTR-ANAL表達載體處理的小鼠的凝血活性在注射后8周為正常小鼠的 31. 9%。同時，根據(jù)與實施例2く步驟3>中相同的方法，將使用HA-hFIXUTR-1. 4kbFIXint、AAT108-PF-hFIXUTR-ANAL、AAT108-PAF_hFIXUTR-ANAL 和 CMV-hFIXUTR-l. 4kbFIXint 的2X IO9IP的重組腺相關(guān)病毒注射到血友病B小鼠的門靜脈中，并通過如前所述的ELISA和APTT方法測定hFIX蛋白濃度和凝血活性。結(jié)果顯示于圖14A和14B中。如圖14A中所示，帶有AAT108-PF-hFIXUTR- A NAL的病毒誘導(dǎo)高達2，379ng/ml 的 hFIX 蛋白，帶有 AAT108-PAF-hFIXUTR-ANAL 的病毒誘導(dǎo)高達 1，431ng/ml 的hFIX蛋白。另ー方面，對照病毒(即，帶有CMV-hFIXUTR-1. 4kbFIXint的病毒和帶有HA-hFIXUTR-1. 4kbFIXint的病毒)所誘導(dǎo)的hFIX表達水平分別為1，542ng/ml和380ng/ml。特別地，含AAT 108-PF-hFIXUTR- A NAL的病毒到注射后68周還誘導(dǎo)500ng/ml或更高的hFIX表達。這ー結(jié)果表明，本發(fā)明含有LCR的表達載體適用于需要長期基因表達的基因治療。如圖14B中所示，施用了帶有AAT108-PF-hFIXUTR-ANAL的rAAV的小鼠到注射后7周表現(xiàn)出正常小鼠凝血活性的59. 1%或更高。上述結(jié)果表明，本發(fā)明的基因表達系統(tǒng)對于血友病治療所需的穩(wěn)定而持續(xù)的表達是有效的。實施例5 :構(gòu)建包含抗血管發(fā)生蛋白Apo(a)kringle結(jié)構(gòu)域KIV9-KIV10_KV(LK68)基因的肝特異性表達載體并評估LK68蛋白表達效率為了向LK68表達載體中引入ANAL內(nèi)含子和FIX UTR，首先使用作為模板的pAAV-LK68(專利號 KR10-0681762)、引物組 SEQ IDNO 37 和 38、SEQ ID NO 39 和 40 以及Ex-Taq進行PCR，以獲得FIX 5’UTR信號序列片段和LK68-FIX 3’UTR片段。PCR條件如下首先94 V變性5分鐘；94 V變性I分鐘、60 V退火I分鐘、72 °C延伸I分鐘的30個循環(huán)；72 °C最后延伸3分鐘。將所述5 ’ UTR信號序列片段和LK68-3 ’ UTR片段分別插入到實施例2〈2_4>中所制備的pBS-hFIXUTR- A NAL載體的Notl/Xhol和Aatll/Sall限制性位點。所需DNA片段通過限制性酶切圖譜和序列分析進行鑒定，所述質(zhì)粒命名為“PBS-LK68- ANAL-FUTR”。將通過用限制性酶NotI和Sal I處理pBS-LK68- A NAL-FUTR質(zhì)粒所得到的LK68- A NAL-FUTR片段插入到實施例4中所制備的AAT108-PF-hFIXUTR-NAL的Notl/Sal I限制性位點，以獲得表達載體AAT108-PF-LK68- A NAL-FUTR。在存在不同LCR或者缺少LCR時重復(fù)上述步驟，以獲得表達載體 E6-PF-LK68- A NAL-FUTR、AAT7800-PF-LK68- A NAL-FUTR、AFP3800-PF-LK68- A NAL-FUTR、HCRm-PF_LK68- A NAL-FUTR, HCR-PF-LK68- A NAL-FUTR 和PF-LK68-A NAL-FUTR。所述表達載體的酶切圖譜顯示于圖15A中。根據(jù)與實施例2く步驟3>中相同的方法，將所述表達載體注射到小鼠尾靜脈中。從小鼠中收集血液樣品，并通過ELISA測量LK68蛋白的表達水平。
如圖16A中所示，在不同LCR中，AAT108顯示出最高的基因表達效率。特別地，相對于 PF-LK68- A NAL-FUTR 表達載體的 LK68 表達效率，AAT108-PF-LK68- A NAL-FUTR 表達載體的LK68表達效率在注射后第I天為158.4%，第2天為104.8%，第7天為155.8%，第2周為160. 2%，第3周為162. 7%，第4周為144. 1%0進ー步地，重復(fù)上述步驟以獲得包含表達盒AAT108-PF-LK68、AAT108 — PF — LK68 — FUTR、AAT 108 — PF — LK68— A NAL — FUTR、AAT 108 — PAF — LK68、AAT108-PAF-LK68-FUTR 和 AAT108-PAF-LK68- A NAL-FUTR 的表達載體。所述表達載體的示意圖顯不于圖15B中。根據(jù)與實施例2く步驟3>中相同的方法，將所述表達載體注射到小鼠尾靜脈中。從小鼠中收集血液樣品，并通過ELISA測量LK68蛋白的表達水平。如圖16B中所示，相對于AAT108-PF-LK68表達載體的LK68表達效率，AAT108-PF-LK68-FUTR 和 AAT108-PF-LK68- A NAL-FUTR 表達載體的 LK68 表達效率分別在注射后第I天為197. 7%和425. 4%，第2天為478. 6%和891. 2%，第7天為233. 2%和319. 3%，第 2 周為 203. 0%和 253. 7%，第 3 周為 113. 8%和 243. 3%，第 4 周為 170. 4%和277. 6%。相對于 AAH08-PAF-LK68 表達載體的 LK68 表達效率，AAT108-PAF-LK68-FUTR 和AAT108-PAF-LK68-ANAL-FUTR表達載體的LK68表達效率分別在注射后第I天為147. 0%和 344. 6%，第 2 天為 351. 0%和 824. 5%，第 7 天為 220. 2%和 260. 3%，第 2 周為 140. 8%和 203. 0%，第 3 周為 146. 5%和 288. 4%，第 4 周為 177. 8%和 323. 8% 0這些結(jié)果表明，與不存在內(nèi)含子和UTR的情況相比，基因表達在內(nèi)含子和/或UTR存在下是持續(xù)高水平的。實施例6 :評估細胞內(nèi)由UTR和內(nèi)含子引起的抗血管發(fā)生蛋白Apo(a)kringle結(jié)構(gòu)域KIV9-KIV10-KV(LK68)的表達效率將通過用NotI和SalI消化實施例5所述AAT108-PF-LK68和AAT108-PF-LK68-A NAL-FUTR 載體所得到的 LK68 和 LK68-A NAL-FUTR 片段插入到腺病毒穿梭載體 pENTR2B(Invitrogen，Carlsbad, CA)中，以獲得 pENTR_LK68和pENTR-LK68-ANAL-FUTR載體。將這些穿梭載體和靶標(biāo)載體pAd/CMV/V5-DEST (Invitrogen, Carlsbad, CA)用 Clonase (Invitrogen, Carlsbad, CA)進行體外同源重組，以獲得 pAd-CMV-LK68 和 pAd-CMV_LK68- A NAL-FUTR載體。將所述pAd-CMV_LK68 和pAd-CMV-LK68-A NAL-FUTR載體用PacI限制性酶進行線性化，并轉(zhuǎn)染到HEK 293腎細胞系中，以分別獲得帶有CMV-LK68和CMV-LK68-ANAL-FUTR的復(fù)制缺陷型腺病毒rAd_LK68和rAd-LK68UN0將所述rAd_LK68和rAd_LK68UN注射到HEK 293腎細胞系中，并測量LK68蛋白的表達水平。以0. 1,0. 5、2和10的多種感染復(fù)數(shù)(MOI)感染HEK 293腎細胞系。在腺病毒感染后2天收集細胞和培養(yǎng)基。使用抗LK68抗體，通過電泳測定LK68蛋白的表達水平。結(jié)果顯示于圖17A和17B中。如圖17A和17B中所示，當(dāng)MOI為0. 1、0. 5和2時，LK68蛋白的表達水平很低且相等，然而當(dāng)MOI為10時，與由rAd-LK68所誘導(dǎo)的相比，由rAd-LK68UN所誘導(dǎo)的LK68蛋白表達水平在細胞內(nèi)提高了 420%，在培養(yǎng)基中提高了 242%。這些結(jié)果表明，UTR和內(nèi)含子存在下細胞和培養(yǎng)基中的基因表達效率都高于缺少UTR和內(nèi)含子的情況。 盡管通過上述具體實施方案對本發(fā)明進行了描述，但應(yīng)當(dāng)理解，可以進行多種修改和改變，而仍屬于由下述權(quán)利要求書所定義的本發(fā)明范圍。以下內(nèi)容對應(yīng)于母案申請中的原始權(quán)利要求書，現(xiàn)作為說明書的一部分并入此處項I.具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸。項2.多核苷酸，其包含具有SEQ ID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸；以及與所述SEQ ID NO :42之多核苷酸有效連接的至少ー個多核苷酸，后者選自具有SEQ ID NO :44和45之核苷酸序列的多核苷酸。項3.多核苷酸，其選自具有SEQ ID NO :46至57之核苷酸序列的多核苷酸。項4.多核苷酸，其選自具有SEQ ID NO :58至61之核苷酸序列的多核苷酸。項5.表達載體，其包含轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和與所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接并受其控制的編碼序列，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件包含I)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；2)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸，以及與所述SEQID NO 42之多核苷酸有效連接的至少ー個多核苷酸，后者選自具有SEQ ID NO 44和45之核苷酸序列的多核苷酸；3)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸，以及與所述SEQID NO 42之多核苷酸有效連接的至少ー個多核苷酸，后者選自具有SEQ ID NO 46到57之核苷酸序列的多核苷酸；4)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸，以及與所述SEQID NO 42之多核苷酸有效連接的至少ー個多核苷酸，后者選自具有SEQ ID NO :58到61之核苷酸序列的多核苷酸；5)具有SEQ ID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸，選自具有SEQID NO :44和45之核苷酸序列的多核苷酸的至少ー個多核苷酸，以及選自具有SEQ ID NO 46到57之核苷酸序列的多核苷酸的至少ー個多核苷酸，所述多核苷酸彼此有效連接；6)具有SEQ ID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸，選自具有SEQID NO :44和45之核苷酸序列的多核苷酸的至少ー個多核苷酸，以及選自具有SEQ ID NO :58到61之核苷酸序列的多核苷酸的至少ー個多核苷酸，所述多核苷酸彼此有效連接；7)具有SEQ ID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸，選自具有SEQID NO :46到57之核苷酸序列的多核苷酸的至少ー個多核苷酸，以及選自具有SEQ ID NO :58到61之核苷酸序列的多核苷酸的至少ー個多核苷酸，所述多核苷酸彼此有效連接；或者
8)具有SEQ ID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸，選自具有SEQID NO :44和45之核苷酸序列的多核苷酸的至少ー個多核苷酸，選自具有SEQ ID NO :46到57之核苷酸序列的多核苷酸的至少ー個多核苷酸；以及選自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸序列的多核苷酸的至少ー個多核苷酸，所述多核苷酸彼此有效連接。項6.表達載體，其包含轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件以及與所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件有效連接并受其控制的編碼序列，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件包含啟動子和與所述啟動子有效連接的多核苷酸，所述多核苷酸選自選自具有SEQ ID NO 46到57之核苷酸序列的多核苷酸的至少ー個多核苷酸；選自具有SEQID NO :58到61之核苷酸序列的多核苷酸的至少ー個多核苷酸；以及與選自具有SEQ ID NO :58到61核苷酸序列之多核苷酸的至少ー個多核苷酸有效連接的選自具有SEQ ID NO 46到57核苷酸序列之多核苷酸的至少ー個多核苷酸。項7.項5或6的表達載體，其中所述編碼序列是編碼肝特異性蛋白質(zhì)的序列，所述蛋白質(zhì)選自白蛋白、甲胎蛋白、a-葡萄糖苷酶、a I-抗胰蛋白酶、抗凝血酶、脂蛋白、血漿銅藍蛋白、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、紅細胞生成素、纖維蛋白原、葡糖腦苷脂酶、觸珠蛋白、IGF-1、胰島素、纖維蛋白溶酶原、凝血酶原和轉(zhuǎn)鐵蛋白。項8.項5或6的表達載體，其還包含分別位于所述編碼序列5'和3'端的具有SEQ ID NO :62和63之核苷酸序列的多核苷酸。
權(quán)利要求
1.多核苷酸，其具有SEQID NO :52所示核苷酸序列。
2.表達盒，其包含 啟動子； 與所述啟動子有效連接并受其控制的編碼序列；和 與所述編碼序列有效連接的內(nèi)含子，其具有SEQ ID NO :52所示核苷酸序列。
3.權(quán)利要求2的表達盒，其還含有與所述編碼序列有效連接的 至少一個增強子，其具有SEQ ID NO 44和45所示核苷酸序列。
4.權(quán)利要求2的表達盒，其還含有與所述編碼序列有效連接的至少一個基因座控制區(qū)，其具有SEQ ID NO 58到61所示核苷酸序列。
5.權(quán)利要求2的表達盒，其還含有與所述編碼序列有效連接的非翻譯區(qū)，其在所述編碼序列的5'和3'端分別具有SEQ ID NO :62和63所示的核苷酸序列。
6.權(quán)利要求3的表達盒，其還含有與所述編碼序列有效連接的至少一個基因座控制區(qū)，其具有SEQ ID NO 58到61所示核苷酸序列。
7.權(quán)利要求6的表達盒，其還含有與所述編碼序列有效連接的非翻譯區(qū)，其在所述編碼序列的5'和3'端分別具有SEQ ID NO :62和63所示的核苷酸序列。
8.權(quán)利要求3的表達盒，其還含有與所述編碼序列有效連接的非翻譯區(qū)，其在所述編碼序列的5'和3'端分別具有SEQ ID NO :62和63所示的核苷酸序列。
9.權(quán)利要求4的表達盒，其還含有與所述編碼序列有效連接的非翻譯區(qū)，其在所述編碼序列的5'和3'端分別具有SEQ ID NO :62和63所示的核苷酸序列。
10.權(quán)利要求I至9中任一項的表達盒，其中所述啟動子選自具有SEQID NO:41、42和43所示核苷酸序列的多核苷酸。
11.權(quán)利要求I至9中任一項的表達盒，其中所述編碼序列是編碼肝特異性蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述蛋白質(zhì)選自白蛋白、甲胎蛋白、α-葡萄糖苷酶、α I-抗胰蛋白酶、抗凝血酶、脂蛋白、血漿銅藍蛋白、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、紅細胞生成素、纖維蛋白原、葡糖腦苷脂酶、觸珠蛋白、IGF-1、胰島素、纖維蛋白溶酶原、凝血酶原和轉(zhuǎn)鐵蛋白。
12.表達載體，其含有權(quán)利要求I至9中任一項的表達盒。
全文摘要
提供了用于基因治療的表達載體，其含有轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的新組合，包括啟動子、增強子、內(nèi)含子、非翻譯區(qū)(UTR)和基因座控制區(qū)(LCR)。所述表達載體能夠持續(xù)表達肝組織特異性基因，因而能有效地用于治療血栓形成、血友病、肝癌等等。
文檔編號C12N15/85GK102628041SQ201210084499
公開日2012年8月8日 申請日期2008年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月14日
發(fā)明者尹成泰, 李圭鉉, 李賢 , 趙義哲, 高垡經(jīng) 申請人:財團法人牧巖生命工學(xué)研究所