一種青蒿bZIP類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列及克隆方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種青蒿AabZIP9基因編碼序列的克隆及其應(yīng)用。具體包括基因AabZIP9的克隆、含有該基因的植物表達(dá)載體的構(gòu)建、該基因?qū)η噍锼厣锖铣赏緩教赜谢騿?dòng)子的激活作用。上述青蒿AabZIP9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明還公開了AabZIP9基因具有能夠激活青蒿素生物合成途徑特異基因ADS和ALDH1表達(dá)的特性。本發(fā)明中AabZIP9基因可應(yīng)用于青蒿品質(zhì)改良，可提高青蒿中青蒿素的含量。
【專利說明】
一種青蒿bZ IP類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列及克隆方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種青蒿bZIP類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列 AabZIP9及其克隆方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物中新陳代謝分為初生代謝和次生代謝，初生代謝產(chǎn)物（如糖類、脂類和核酸） 存在于所有的植物中，是植物維持細(xì)胞生命活動(dòng)所必需的，而植物次生代謝產(chǎn)物是指植物 中一大類非植物生長發(fā)育所必需的小分子有機(jī)化合物，其合成與分布具有種屬、組織器官 和生產(chǎn)發(fā)育特異性。例如，治療瘧疾的特效藥物成分青蒿素只在植物青蒿（Artemisia annua L.)植株表面的分泌型腺毛中合成并儲(chǔ)存。近年來，隨著對(duì)中草藥成分研究的逐步深 入，發(fā)現(xiàn)許多中草藥的有效成分均為植物次生代謝產(chǎn)物，例如丹參中的丹參酮，長春花中的 長春生物堿等。
[0003] 大部分植物次生代謝產(chǎn)物其在天然植物中的含量極低，而使用化學(xué)合成的方法， 工藝流程復(fù)雜、成本太高，并且還有許多植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成途徑不清晰，無法實(shí) 現(xiàn)化學(xué)全合成。因此，研究人員開始探索其他的提高植物次生代謝產(chǎn)物含量的方法?？紤]到 植物次生代謝產(chǎn)物合成途徑復(fù)雜，參與反應(yīng)的基因數(shù)量多，且受到發(fā)育，環(huán)境等多種因素的 影響，對(duì)途徑上單個(gè)基因進(jìn)行修飾有時(shí)難以奏效。而轉(zhuǎn)錄因子通?？梢哉{(diào)控某個(gè)植物次生 代謝產(chǎn)物生物合成途徑上的多個(gè)酶基因的表達(dá)，從而調(diào)控該次生代謝產(chǎn)物的生物合成量。
[0004] 目前，在青蒿中已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子可以有效調(diào)控青蒿素合成途徑特有基因 的表達(dá)，從而調(diào)控青蒿素的生物合成，例如AaORAl轉(zhuǎn)錄因子，AabZIPl轉(zhuǎn)錄因子，AaMYC2轉(zhuǎn)錄 因子等等。因此，克隆能調(diào)控青蒿素生物合成途徑特有基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)于改良并提 高青蒿中青蒿素的含量具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種青蒿AabZIP9基因及獲得其核苷酸序列的方法，還提 供了該基因的蛋白編碼序列，并且提供了該基因生物學(xué)功能快速確定的方法。該基因編碼 一個(gè)bZIP類轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)其部分生物學(xué)功能進(jìn)行了確定。將含有目的AabZIP9基因的農(nóng)桿菌 和含有青蒿素生物合成途徑特異基因啟動(dòng)子的報(bào)告載體的農(nóng)桿菌，通過煙草注射侵染瞬時(shí) 表達(dá)的方法，經(jīng)雙熒光素報(bào)告分析發(fā)現(xiàn)，該基因能夠激活青蒿素生物合成途徑特異基因啟 動(dòng)子的表達(dá)，為青蒿素代謝工程改良提供了有效的候選基因。
[0006] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 本發(fā)明提供了一種青蒿bZIP類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列，該編碼序列記為AabZIP9， AabZIP9的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種青蒿bZIP類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列，AabZIP9編碼的氨基酸序列 如SEQ ID N0.2所示。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種多肽，該多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]本發(fā)明還提供了一種重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體包含如SEQ ID NO. 1所示的 核苷酸序列的開放閱讀框序列，所述開放閱讀框序列如SEQ ID NO.3所示。其構(gòu)建方法包括 以下步驟：
[0011] 步驟1、根據(jù)SEQ ID N0.1序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增AabZIP9基因開放閱讀框序列，擴(kuò)增引物如 下：
[0012] 正向引物P3:5 ' -CACCATGGCCGCAAACCCTGTCTGG-3 '
[0013] 反向引物P4:5 ' -AACGTTACGATGAGAATCCAAAGG-3 ' ；
[0014] 步驟2、將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后連接pENTR-TOPO載體；
[0015] 步驟3、將連接入AabZIP9基因的pENTR-TOPO載體與pEearlygatel04植物表達(dá)載體 通過LR反應(yīng)的方式構(gòu)建含有目的基因的pEearlygate104-AabZIP9植物表達(dá)載體。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，該重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體包含如SEQ ID NO. 1所 示的核苷酸序列的開放閱讀框序列，所述開放閱讀框序列如SEQ ID NO.3所示。
[0017] 進(jìn)一步地，上述重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體的宿主菌株為農(nóng)桿菌。
[0018] 本發(fā)明還提供了上述青蒿bZIP類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列AabZIP9在提高青蒿素含量中 的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明還提供了上述青蒿bZIP類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列AabZIP9的克隆方法，該克隆 方法包括以下步驟：
[0020] 步驟1、總RNA的提取與純化，采用各種通用的植物總RNA提取試劑盒提取并純化獲 得青高葉片總RNA;
[0021 ]步驟2、用反轉(zhuǎn)錄酶將青蒿葉片總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA;
[0022] 步驟3、以上述cDNA為模板，通過設(shè)計(jì)基因特異引物，采用PCR的方法擴(kuò)增，獲得PCR 產(chǎn)物，基因特異引物為：
[0023] 正向引物 Pl:5' -TTTCAAACTGTGGTGGAATGGC-3 '
[0024] 反向引物P2:5 ' -CAATAAGAGGCTTAGGAGAGGG-3;
[0025]步驟4、PCR產(chǎn)物回收純化測序，獲得如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
[0026]本發(fā)明還提供了一種快速檢測AabZIP9編碼的氨基酸序列的生物學(xué)功能的方法， 該方法包括以下步驟：
[0027] 步驟1、根據(jù)SEQ ID N0.1序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增AabZIP9基因開放閱讀框序列，擴(kuò)增引物如 下：
[0028] 正向引物P3:5 ' -CACCATGGCCGCAAACCCTGTCTGG-3 '
[0029] 反向引物P4:5 ' -AACGTTACGATGAGAATCCAAAGG-3 ' ；
[0030] 步驟2、將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后連接pENTR-TOPO載體；
[0031] 步驟3、將連接入AabZIP9基因的pENTR-TOPO載體與pEearlygatel04植物表達(dá)載體 通過LR反應(yīng)的方式構(gòu)建含有目的基因的pEearlygate104-AabZIP9植物表達(dá)載體；
[0032]步驟4、將青蒿中青蒿素合成途徑特有ADS基因的啟動(dòng)子ProADS連接入 pGreenII0800-LUC載體，構(gòu)建植物雙熒光素檢測報(bào)告載體pGreenII0800-ProADS;
[0033] 步驟5、將青蒿中青蒿素合成途徑特有CYP71AV1基因的啟動(dòng)子Pr〇CYP71AV1連接入 pGreenII0800-LUC載體，構(gòu)建植物雙熒光素檢測報(bào)告載體pGreenII0800-ProCYP71AVl;
[0034] 步驟6、將青蒿中青蒿素合成途徑特有DBR2基因的啟動(dòng)子Pr〇DBR2連接入 pGreenII0800-LUC載體，構(gòu)建植物雙熒光素檢測報(bào)告載體pGreenII0800-ProDBR2;
[0035] 步驟7、將青蒿中青蒿素合成途徑特有ALDH1基因的啟動(dòng)子ProALDHl連接入 pGreenII0800-LUC載體，構(gòu)建植物雙熒光素檢測報(bào)告載體pGreenII0800-ProALDHl;
[0036] 步驟8、將pEearlygatel04-AabZIP9植物表達(dá)載體和植物雙熒光素檢測報(bào)告載體 pGreenII0800-ProADS、pGreenII0800-ProCYP71AVl、pGreenII0800-ProDBR2和 pGreenII0800-Pr〇ALDHl分別轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌中，獲得包含目的載體的農(nóng)桿菌工程菌株； [0037] 步驟9、將包含pEearlygatel04_AabZIP9植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌工程菌株和包含 植物雙熒光素檢測報(bào)告載體的農(nóng)桿菌工程菌株混合后，通過注射侵染的方式注射到生長5 周的煙草葉片中；
[0038]步驟10、取注射后培養(yǎng)2天的煙草葉片，用液氮速凍后研磨成粉末；
[0039] 步驟11、采用Promega-Dual-Luciferase檢測試劑盒檢測焚光強(qiáng)度，確定AabZIP9 基因與青蒿素合成途徑特有基因啟動(dòng)子的激活作用。
[0040] 進(jìn)一步地，上述步驟8中，宿主菌為農(nóng)桿菌GV3101菌株；上述步驟9中，包含 pEearlygate104-AabZIP9植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌工程菌株和包含植物雙熒光素檢測報(bào)告 載體的農(nóng)桿菌工程菌株混合比例為按3:1濃度混合。
[0041] 在本發(fā)明中，克隆AabZIP9基因可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包 括質(zhì)粒、粘粒等。在本發(fā)明中構(gòu)建AabZIP9植物表達(dá)載體，也可選用本領(lǐng)域已知的各種載體， 如市售的PCAMBIA系列載體;在本發(fā)明中構(gòu)建啟動(dòng)子雙熒光素報(bào)告載體，也可選用本領(lǐng)域已 知的各種其他載體，如市售的Promega公司的載體;本發(fā)明中所涉及的農(nóng)桿菌為根癌農(nóng)桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101，該菌株可以從市場上公開購買。
[0042] 以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以充分說明本發(fā)明的目的、技術(shù)特征和 技術(shù)效果。
【附圖說明】
[0043]通過閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、 目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：
[0044]圖1示出了在一個(gè)較優(yōu)實(shí)施例中，煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化AabZIP9基因顯著提高ADS和ALDH1 這2個(gè)基因啟動(dòng)子的表達(dá)活性。
【具體實(shí)施方式】
[0045]下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明：本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施 例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如 Sambro〇k等分子克 ?。簩?shí)驗(yàn)室手冊（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press ,1989)中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。
[0046] 實(shí)施例1、實(shí)施例1青蒿AabZIP9基因的克隆
[0047] 1、青蒿在人工氣候室培養(yǎng)，生長條件為光周期18h/6h(光亮/黑暗），25°C;
[0048] 2、青蒿葉片總RNA的提取。取100毫克左右幼嫩的青蒿葉片組織材，置于液氮中充 分研磨至粉末狀，按照植物總RNA提取試劑盒(天根生化，北京)說明書的方法，提取葉片總 RNA。將獲得的植物總RNA取3yL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA的質(zhì)量，然后在NanoDrop (Thermo Fisher，美國）分光光度計(jì)上測定總RNA的濃度。
[0049] 3、基因的克隆。以提取的總RNA為模板（500ng)，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，大連）說明書的方法，反轉(zhuǎn)錄生產(chǎn)第一鏈cDNA; 通過設(shè)計(jì)的特異引物，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，特異引物序列如下：
[0050]正向引物P1:5 ' -TTTCAAACTGTGGTGGAATGGC-3 '
[0051 ]反向引物P2:5 ' -CAATAAGAGGCTTAGGAGAGGG-3
[0052] PCR反應(yīng)總體積為50yL，反應(yīng)體系為：5yL 10XK0D緩沖液，5yL dNTPs，4yL MgS04， lyL正向引物，lyL反向引物，lyL cDNA模板，lyL K0D酶，ddH20補(bǔ)齊至50yL。
[0053] PCR 擴(kuò)增條件，預(yù)變性 95°C3min，35 個(gè)循環(huán)：95°C，30sec;54°C，30sec;68°C， lOOsec，最后 68°C 延伸 5min。
[0054] 將PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，連接平末端載體pLB(天根生化有限公司產(chǎn)品）并測序， 獲得pLB-AabZIP9質(zhì)粒載體。
[0055] 通過上述步驟，獲得了青蒿中AabZIP9基因的序列如SEQ ID N0.1所示，并推導(dǎo)出 其蛋白編碼序列如SEQ ID N0.2所示。
[0056] 實(shí)施例2、包含AabZIP9基因的植物表達(dá)載體的構(gòu)建
[0057] 1、中間載體 pENTR-T0P0_AabZIP9 的構(gòu)建。
[0058] 根據(jù)SEQ ID N0.1序列信息設(shè)計(jì)擴(kuò)增AabZIP9基因開放閱讀框序列，擴(kuò)增引物如 下：
[0059] 正向引物P3:5 ' -CACCATGGCCGCAAACCCTGTCTGG-3 '
[0060] 反向引物P4:5 ' -AACGTTACGATGAGAATCCAAAGG-3 '
[0061 ] pENTR/D-T0P0載體購置于Invitrogen公司，為該公司Gateway克隆技術(shù)的入門載 體，按照該產(chǎn)品說明書的要求，在正向引物ATG堿基前添加 CACC四個(gè)堿基。以pLB-AabZIP9質(zhì) 粒為模板，用平末端高保真酶K0D進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物回收純化后通過Gateway克隆技術(shù) 的方法連接到pENTR-TOPO載體，具體方法按照Invitrogen公司pENTR/D-TOPO克隆試劑盒說 明書進(jìn)行。
[0062] 2、包含目的基因的植物表達(dá)載體構(gòu)建。按照Invitrogen公司LR Clonase II Enzyme試劑盒將將中間載體pENTR-T0P0-AabZIP9與pEearlygatel04植物表達(dá)載體進(jìn)行LR 反應(yīng)，反應(yīng)體系按試劑盒說明書配制，放置于25°C金屬浴反應(yīng)3小時(shí)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感 受態(tài)，進(jìn)行陽性克隆PCR驗(yàn)證，最終獲得包含有目的基因的pEearlygatel04_AabZIP9植物表 達(dá)載體。
[0063] 實(shí)施例3.青蒿素合成途徑特異基因啟動(dòng)子雙熒光素報(bào)告載體的構(gòu)建 [0064] 1、PCR擴(kuò)增青蒿素合成途徑特異基因的啟動(dòng)子。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中青蒿ADS基因的 啟動(dòng)子(GenBank: DQ448297.1)序列信息，設(shè)計(jì)ADS基因啟動(dòng)子擴(kuò)增特異引物，正反特異引物 分別含有Κρη I和Pst頂每切位點(diǎn)，引物序列如下：
[0065] ProADS F 5'-ggtaccACCGGGGACCTCTAGAGATC-3'，
[0066] ProADS R 5'-ctgcagGATTTTACAAACTTTGAA-3'〇
[0067] 同樣的，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中青蒿CYP71AV1基因的啟動(dòng)子(GenBank:FJ870128.1)序 列信息，設(shè)計(jì)分別含有Κρη I和Pst頂每切位點(diǎn)的CYP71AV1啟動(dòng)子特異引物，引物序列如下：
[0068] ProCYP F 5'-ggtaccATGGGTCAATTTCGGGTTG-3'，
[0069] ProCYP R 5'-ctgcagTGCTTTTAGTATACTCTTC-3'；
[0070] 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中青蒿DBR2基因的啟動(dòng)子(GenBank:KC118524.1)序列信息，設(shè)計(jì) 分別含有Κρη I和Pst頂每切位點(diǎn)的DBR2啟動(dòng)子特異引物，引物序列如下：
[0071] ProDBR2 F 5'-ggtaccAAGATGAGATAGGGAACTAAC-3'，
[0072] ProDBR2 R 5'-ctgcagTATTGAGTTTGATGTTGACC-3'；
[0073] 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中青蒿ALDH1基因的啟動(dòng)子(GenBank:KC118522.1)序列信息，設(shè) 計(jì)分別含有Κρη I和Pst頂每切位點(diǎn)的ALDH1啟動(dòng)子特異引物，引物序列如下：
[0074] ProALDHl F 5'-ggtaccATGAACCATTAGAAGGGAAGG-3'，
[0075] ProALDHl R 5,-ctgcagCTTTGTTTTTTATGAAA-3,；
[0076] 以青蒿基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增上述4個(gè)啟動(dòng)子片段，回收純化。
[0077] 2.啟動(dòng)子PCR產(chǎn)物連接入雙熒光素報(bào)告載體。將上述PCR產(chǎn)物用Κρη I和Pst I雙酶 切，回收酶切片段，將4個(gè)酶切回收后的片段連入用Κρη I和Pst I雙酶切后回收的 pGreenII0800-LUC載體片段，構(gòu)建植物雙熒光素檢測報(bào)告載體pGreenII0800-ProADS、 pGreenII0800-ProCYP71AVl、pGreenII0800-ProDBR2和pGreenII0800-ProALDHl〇
[0078] 實(shí)施例4.煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化檢測基因與啟動(dòng)子激活作用
[0079] 1、農(nóng)桿菌工程菌株的獲得，將 pEearlygatel04空載體、pEearlygatel04-AabZIP9 表達(dá)載體和4個(gè)啟動(dòng)子雙熒光檢測報(bào)告載體通過凍融法轉(zhuǎn)化入根癌農(nóng)桿菌GV3101菌株中， 獲得包含有空載體的農(nóng)桿菌工程菌株、包含有AabZIP9基因的農(nóng)桿菌工程菌株和4個(gè)包含有 啟動(dòng)子的農(nóng)桿菌工程菌株。
[0080] 2、農(nóng)桿菌工程菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)與處理。將上述6個(gè)農(nóng)桿菌工程菌株在包含50mg/L 利福平+20mg/L慶大霉素+50mg/L卡那霉素三種抗生素的LB培養(yǎng)液中擴(kuò)大培養(yǎng)(5mL)，28°C， 220轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)過夜。第二天測定菌液濃度，當(dāng)農(nóng)桿菌菌液濃度達(dá)到0D600值在20D~ 2.50D左右后停止培養(yǎng)。離心，收集農(nóng)桿菌，然后用10mM濃度MgCl 2溶液重懸浮菌體，調(diào)整重 懸浮菌液0D值為0.6。向重懸浮菌液中添加乙酰丁香酮，其濃度為200mM。將上述重懸浮農(nóng)桿 菌菌液靜置3小時(shí)。
[0081 ] 3、注射侵染法瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草。將上述靜置處理后的包含有空載體的農(nóng)桿菌工程菌 株與4個(gè)包含有啟動(dòng)子的農(nóng)桿菌工程菌株分別按3:1濃度比例混合，作為對(duì)照組;將包含有 目的基因 AabZIP9表達(dá)載體的農(nóng)桿菌工程菌株與4個(gè)包含有啟動(dòng)子的農(nóng)桿菌工程菌株也分 別按3:1濃度比例混合，作為實(shí)驗(yàn)組。通過lml的注射器，將混合后的農(nóng)桿菌菌夜注射到生長 5周左右的煙草葉片中，黑暗培養(yǎng)1天然后轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)。
[0082] 4、0皿1-1^1(^€6抑86檢測。用直徑為1.0〇11的圓形打孔器，取注射后培養(yǎng)2天的煙草 葉片，用液氮速凍后研磨成粉末;采用Promega Dual-Luciferase檢測試劑盒檢測焚光強(qiáng) 度，按Promega公司說明書的方法操作。
[0083] 本發(fā)明中AabZIP9基因能夠顯著激活青蒿素生物合成途徑中ADS和ALDH1這2個(gè)重 要的結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子的表達(dá)，與對(duì)照組相比，AabZIP9能顯著激活這ADS啟動(dòng)子的表達(dá)能力， 提高其活性至對(duì)照組的5.4倍左右;對(duì)ALDH1啟動(dòng)子也有一定激活能力，提高至對(duì)照組的1.6 倍左右。而對(duì)CYP71AV1和DBR2的啟動(dòng)子無顯著激活能力。通過本發(fā)明為進(jìn)一步利用該基因 在青蒿中過量表達(dá)進(jìn)而提高青蒿中青蒿素的含量提供了有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
[0084]以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)無需創(chuàng) 造性勞動(dòng)就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思做出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員 依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可以得到的技術(shù) 方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種青蒿bZIP類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列，其特征在于，所述編碼序列記為AabZIP9,所述 AabZIP9的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。2. -種青蒿bZIP類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列，其特征在于，所述AabZIP9編碼的氨基酸序列如 SEQIDN0.2**。3. -種多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。4. 一種重組表達(dá)載體，其特征在于，所述重組表達(dá)載體包含如SEQ ID NO. 1所示的核苷 酸序列的開放閱讀框序列，所述開放閱讀框序列如SEQ ID NO.3所示。5. -種重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體包含如SEQ ID NO. 1所示的 核苷酸序列的開放閱讀框序列，所述開放閱讀框序列如SEQ ID NO.3所示。6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的青蒿bZIP類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列AabZIP9在提高青蒿素含量 中的應(yīng)用。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的青蒿bZIP類轉(zhuǎn)錄因子編碼序列AabZIP9的克隆方法，其特征在 于，所述克隆方法包括以下步驟： 步驟1、總RNA的提取與純化，采用各種通用的植物總RNA提取試劑盒提取并純化獲得青 蒿葉片總RNA; 步驟2、用反轉(zhuǎn)錄酶將所述青蒿葉片總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA; 步驟3、以所述cDNA為模板，通過設(shè)計(jì)基因特異引物，采用PCR的方法擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn) 物，所述基因特異引物為： 正向引物PI: 5 '-TTTCAAACTGTGGTGGAATGGC-3 ' 反向引物P2:5 ' -CAATAAGAGGCTTAGGAGAGGG-3; 步驟4、PCR產(chǎn)物回收純化測序，獲得如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法包括以 下步驟： 步驟1、根據(jù)SEQ ID N0.1序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增AabZIP9基因開放閱讀框序列，擴(kuò)增引物如下： 正向引物P3:5 ' -CACCATGGCCGCAAACCCTGTCTGG-3 ' 反向引物P4:5 ' -AACGTTACGATGAGAATCCAAAGG-3 ' ； 步驟2、將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后連接pENTR-TOPO載體； 步驟3、將連接入AabZIP9基因的pENTR-TOPO載體與pEearlygatel04植物表達(dá)載體通過 LR反應(yīng)的方式構(gòu)建含有目的基因的pEearlygate104-AabZIP9植物表達(dá)載體。9. 一種快速檢測根據(jù)權(quán)利要求2所述的AabZIP9編碼的氨基酸序列的生物學(xué)功能的方 法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： 步驟1、根據(jù)SEQ ID N0.1序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增AabZIP9基因開放閱讀框序列，擴(kuò)增引物如下： 正向引物P3:5 ' -CACCATGGCCGCAAACCCTGTCTGG-3 ' 反向引物P4:5 ' -AACGTTACGATGAGAATCCAAAGG-3 ' ； 步驟2、將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后連接pENTR-TOPO載體； 步驟3、將連接入AabZIP9基因的pENTR-TOPO載體與pEearlygatel04植物表達(dá)載體通過 LR反應(yīng)的方式構(gòu)建含有目的基因的pEearlygate104-AabZIP9植物表達(dá)載體； 步驟4、將青蒿中青蒿素合成途徑特有ADS基因的啟動(dòng)子ProADS連接入pGreenII0800-LUC載體，構(gòu)建植物雙熒光素檢測報(bào)告載體pGreenII0800-ProADS; 步驟5、將青蒿中青蒿素合成途徑特有CYP71AV1基因的啟動(dòng)子Pr〇CYP71AVl連接入 pGreenII0800-LUC載體，構(gòu)建植物雙熒光素檢測報(bào)告載體pGreenII0800-ProCYP71AVl; 步驟6、將青蒿中青蒿素合成途徑特有DBR2基因的啟動(dòng)子Pr〇DBR2連接入 pGreenII0800-LUC載體，構(gòu)建植物雙熒光素檢測報(bào)告載體pGreenII0800-ProDBR2; 步驟7、將青蒿中青蒿素合成途徑特有ALDH1基因的啟動(dòng)子ProALDHl連接入 pGreenII0800-LUC載體，構(gòu)建植物雙熒光素檢測報(bào)告載體pGreenII0800-ProALDHl; 步驟8、將所述pEearlygate104-AabZIP9植物表達(dá)載體和所述植物雙熒光素檢測報(bào)告 載體 pGreenII0800-ProADS、pGreenII0800-ProCYP71AVl、pGreenII0800-ProDBR2 和 pGreenII0800-Pr〇ALDHl分別轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌中，獲得包含目的載體的農(nóng)桿菌工程菌株； 步驟9、將包含所述pEearlygatel04-AabZIP9植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌工程菌株和包含 所述植物雙熒光素檢測報(bào)告載體的農(nóng)桿菌工程菌株混合后，通過注射侵染的方式注射到生 長5周的煙草葉片中； 步驟10、取注射后培養(yǎng)2天的所述煙草葉片，用液氮速凍后研磨成粉末； 步驟11、采用Promega-Dual-Luciferase檢測試劑盒檢測焚光強(qiáng)度，確定AabZIP9基因 與青蒿素合成途徑特有基因啟動(dòng)子的激活作用。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述步驟8中，宿主菌為農(nóng)桿菌GV3101菌 株;所述步驟9中，包含所述pEearlygatel04_AabZIP9植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌工程菌株和包 含所述植物雙熒光素檢測報(bào)告載體的農(nóng)桿菌工程菌株混合比例為按3:1濃度混合。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK106086037SQ201610682249
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月17日 公開號(hào)201610682249.4, CN 106086037 A, CN 106086037A, CN 201610682249, CN-A-106086037, CN106086037 A, CN106086037A, CN201610682249, CN201610682249.4
【發(fā)明人】唐克軒, 沈乾, 黃華儀, 顏廷祥, 陳明慧, 何倩
【申請人】上海交通大學(xué)