假病毒顆粒的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種在大腸桿菌中表達(dá)MSJg病毒顆粒的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大腸桿菌MS2噬菌體屬于正極性單鏈RNA球形病毒,基因組全長(zhǎng)3659bp,由編碼成 熟酶蛋白(或A蛋白)、外殼蛋白、復(fù)制酶蛋白和裂解蛋白等4種蛋白質(zhì)分子的基因組成, 每個(gè)MS2噬菌體病毒顆粒中包含180拷貝的外殼蛋白,一拷貝的成熟蛋白,及一分子的基因 組RNA。研究發(fā)現(xiàn)將MS 2噬菌體的成熟酶蛋白和外殼蛋白的基因以及包含基因調(diào)控序列的 5'非編碼序列克隆到表達(dá)載體中,經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)后能夠得到和野生噬菌體形態(tài)相同的病 毒樣顆粒(virusal like particle, VLP),該顆粒內(nèi)部包裹有RNA分子,且具有耐核酸酶的 特性[2,3,4]。如果將外源基因片段插入到成熟酶包裝位點(diǎn)的下游,表達(dá)載體表達(dá)時(shí)將噬菌體 基因和外源基因轉(zhuǎn)錄成重組RNA,同時(shí)外殼蛋白進(jìn)行包裝,得到可以包裹重組RNA的病毒樣 顆粒,即Armored RNA病毒樣顆粒。Armored RNA病毒樣顆粒被廣泛應(yīng)用于RNA病毒檢測(cè) 中質(zhì)控品的構(gòu)建,此外該病毒外殼還被作為疫苗載體使用,被用于一些病原微生物抗原表 位表面展示的載體。研究人員在應(yīng)用該載體構(gòu)建高致病性H5N1禽流感病毒多肽疫苗時(shí)發(fā) 現(xiàn),按照現(xiàn)有技術(shù)(Pickett G G,Peabody D S. Encapsidation of heterologous RNAs by bacteriophage MS2Coat proein[J]. Nucleic Acids Res, 1993, 21(19):4621-4626. ;Cheng Yangjian, Niu Jianjun, Zhang Yongyou, et al. Preparation of His-Tagged armored RNA phage particles as a control for real-time reverse transcription-PCR detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus[J]. Journal of clinical microb iology, 2006, 44 (10) :3557-3561;竇敏,張國廣,于廣福,等。含口蹄疫病毒IRES RNA病毒 樣顆粒表達(dá)載體的構(gòu)建[J]。中國生物工程雜志,2007,27 (9) :31-35)構(gòu)建的載體在大腸 桿菌細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)假病毒顆粒時(shí)產(chǎn)量較低,上述文獻(xiàn)中均采用將噬菌體整個(gè)基因組 利用PCR擴(kuò)增后連接入原核表達(dá)載體pET32a或pET28a等原核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn),這 種載體在導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)候有幾個(gè)限制因素會(huì)影響假病毒顆粒相關(guān)蛋 白的表達(dá),首先從菌體基因組結(jié)構(gòu)分析外殼蛋白是位于成熟酶蛋白的下游,原核載體 蛋白表達(dá)時(shí)一般上游的基因先翻譯表達(dá),下游的基因后表達(dá),但位于上游的成熟酶蛋白一 個(gè)病毒顆粒中只需要一個(gè)拷貝,若其過多表達(dá)肯定對(duì)下游的外殼蛋白基因的表達(dá)有一定影 響,而每一個(gè)病毒顆粒的衣殼構(gòu)成中需要180個(gè)拷貝的外殼蛋白,成熟酶蛋白只需要一個(gè) 拷貝,顯然要使表達(dá)載體多表達(dá)出假病毒顆粒,則外殼蛋白基因的大量表達(dá)是前提,原文獻(xiàn) 這種構(gòu)建方式顯然影響了 pET32a等原核表達(dá)載體對(duì)克隆到其多克隆位點(diǎn)的噬菌體外殼蛋 白基因的表達(dá)能力。其次MS2噬菌體基因組插入的是原核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)處,而所 使用的原核表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)前都有較長(zhǎng)的引導(dǎo)肽序列,這些引導(dǎo)肽的合成會(huì)消耗掉原 核細(xì)胞的部分翻譯能力,也勢(shì)必影響其下游基因的合成。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷,提供一種在大腸桿菌中表達(dá)MS2假病毒顆 粒的方法。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0005] -種在大腸桿菌中表達(dá)MS2假病毒顆粒的方法,包括如下步驟:
[0006] (1)合成下列引物:
[0007] CP-F (SEQ ID NOl):
[0008] 5' -GCCATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTC-3'
[0009] CP-R (SEQ ID N02):
[0010] 5' -GCGGATCCTTAGTAGATGCCGGAGTTTGC-3,
[0011] MP-F (SEQ ID N03):
[0012] 5' -GCGGATCCTCCTAGGAGG TTTGACCTGT-3,
[0013] MP-R (SEQ ID N04):
[0014] 5' -GCAAGCTTGCTCTATCTAGAGAGCCGTTG-3'
[0015] Pac-F (SEQ ID N05):
[0016] 5' ~GCAAGCTTTAGACGCCGGCCATTCAAACATG~3,
[0017] Pac-R (SEQ ID N06):
[0018] 5' ~CGCGGCCGCCGAGAGAAAGATCGCGAGGAAG~3,;
[0019] (2)用引物CP-F和CP-R通過PCR擴(kuò)增出菌體的外殼蛋白基因序列;用引 物MP-F和MP-R通過PCR擴(kuò)增出MS 2噬菌體的成熟酶基因序列;用引物Pac-F和Pac-R通 過PCR擴(kuò)增出MS2噬菌體的包裝位點(diǎn)基因序列;
[0020] (3)將上述外殼蛋白基因序列、成熟酶基因序列和包裝位點(diǎn)基因序列依次連接到 沒有引導(dǎo)肽序列的原核表達(dá)載體中,得到重組載體;
[0021] (4)將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),再依次收集菌體、破碎菌體、離心、 取上清液、過濾及純化,即得所述MS 2假病毒顆粒。
[0022] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述步驟(3)具體包括如下步驟:
[0023] a、對(duì)所述沒有引導(dǎo)肽序列的原核表達(dá)載體和上述外殼蛋白基因序列用NheI和 BamHI雙酶切,再連接形成第一中間載體;
[0024] b、對(duì)上述第一中間載體和上述成熟酶基因序列用BamHI和HindIII雙酶切,再連 接形成第二中間載體;
[0025] c、對(duì)上述第二中間載體和上述包裝位點(diǎn)基因序列用HindIII和NotI雙酶切,再連 接形成所述重組載體。
[0026] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述沒有引導(dǎo)肽序列的原核表達(dá)載體為 pET21a〇
[0027] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述步驟(4)的大腸桿菌為BL21。
[0028] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述步驟(2)的PCR的模板為pMS27。
[0029] 本發(fā)明的有益效果是:
[0030] 本發(fā)明的方法將MS2噬菌體外殼蛋白基因序列、成熟酶基因序列和包裝位點(diǎn)基因 序列依次連接到?jīng)]有引導(dǎo)肽序列的原核表達(dá)載體中,得到重組載體,該重組載體能夠在大 腸桿菌中表達(dá)MS2噬菌體假病毒顆粒,且具有很高的表達(dá)量。
【附圖說明】
[0031] 圖1為本發(fā)明的實(shí)施例1構(gòu)建的重組載體的序列結(jié)構(gòu)圖,其中RBS為核糖體結(jié)合 位點(diǎn),pac指噬菌體包裝位點(diǎn);
[0032] 圖2為本發(fā)明的實(shí)施例2的SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖,其中1--對(duì)照載體pCPES未 加 IPTG誘導(dǎo),2--對(duì)照載體pCPES加 IPTG誘導(dǎo)(箭頭所示為誘導(dǎo)表達(dá)蛋白條帶),3-- pET2Ia-CMPc載體未加 IPTG誘導(dǎo),4--pET2Ia-CMPc載體加 IPTG誘導(dǎo)(箭頭所示為誘導(dǎo)表 達(dá)蛋白條帶),M-Marker ;
[0033] 圖3為本發(fā)明的實(shí)施例4中表達(dá)的MS2假病毒顆粒的掃描電鏡照片;
[0034] 圖4為本發(fā)明的實(shí)施例5中RNase和/或DNase消化pET21a_CMPc載體的電泳照 片。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 以下通過【具體實(shí)施方式】結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的說明和描述。
[0036] 下述實(shí)施例中的pCPES來自于文獻(xiàn)"竇敏,張國廣,于廣福,等。含口蹄疫病毒IRES RNA病毒樣顆粒表達(dá)載體的構(gòu)建[J]。中國生物工程雜志,2007,27 (9):31-35"構(gòu)建,該載 體是將大腸桿菌噬菌體的基因組構(gòu)建在載體pET32a中,同時(shí)在大腸桿菌基因組后插入了 口蹄疫的IRES片段基因。
[0037] pMS27質(zhì)粒參見中國發(fā)明專利ZL200710008843. 6。
[0038] BL21 購自 novagen 公司。
[0039] 實(shí)施例1
[0040] 采用PCR擴(kuò)增、酶切、連接等方法進(jìn)行表達(dá)載體的構(gòu)建;
[0041] (1)合成以下引物,引物由上海英駿生物公司合成,工具酶等購自大連寶生物公 司:
[0042] CP-F :5' ~GCCATATGGCTTCTAACTTTACTCAGTTC~3,
[0043] CP-R :5' -GCGGATCCTTAGTAGATGCCGGAGTTTGC-3'
[0044] MP-F :5' -GCGGATCCTCCTAGGAGG TTTGACCTGT-3'
[0045] MP-R :5' -GCAAGCTTGCTCTATCTAGAGAGCCGTTG-3'
[0046] Pac-F :5' -GCAAGCTTTAGACGCCGGCCATTCAAACATG-3;
[0047] Pac-R :5' -CGCGGCCGCCGAGAGAAAGATCGCGAGGAAG-3'
[0048] (2)以CP-F和CP-R為引物,以pMS27為模板(D. S. Pesbody教授惠贈(zèng)),擴(kuò)增出外 殼蛋白基因序列,預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為400bp左右,擴(kuò)增體系為10XPCR bufferl.OyL, CP-F 和 CP-R (10 μ mol/L)均為 0· 5 μ L,dNTPO. 5 μ L,TaqDNA 聚合酶(5U/ μ L) 0· 3 μ L,質(zhì) 粒pMS271. 0 μ L,超純水補(bǔ)足總體積為20 μ L,反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min ;然后94°C變性 45s,55°C退火45s,72°C延伸30s,共30個(gè)循環(huán),最后72°C延伸8min,4°C保存,PCR產(chǎn)物經(jīng) 1 %瓊脂糖凝膠電泳確定目的條帶。PCR擴(kuò)增出的特異性片段,用NheI和BamHI雙酶切,先 進(jìn)行他61酶切,酶切體系為?〇?產(chǎn)物2(^1^,10\]\11311冊(cè)^4以1^,他613以1^,超純水補(bǔ)足至 40μ L 體系,37°C 酶切 4h 后,65°C 15min 終止反應(yīng),然后加入 IOXK buffer6y L,BamHI4y L, 超純水10 μ L,37°C酶切4h。酶切產(chǎn)物1%凝膠電泳分離后,紫外箱內(nèi)切割目的條帶。凝膠回 收試劑盒回收酶切片段(上海華舜生物公司),凝膠回收步驟為1)在紫外燈下切取的相應(yīng)待 回收DNA片段,放入I. 5mL的Ep管中,按IOOmg瓊脂糖加入300 μ L Sl液的比例加入Sl液, 置50-60°C溫浴lOmin,為使膠充分溶解,每隔2min搖晃一次;若瓊脂糖重量低于lOOmg,用 水補(bǔ)齊至l〇〇mg。務(wù)必將瓊脂糖充分溶解;2)如果回收片段小于300bp,則加入1/3S1體積 的異丙醇,混勻,50-60°C放置lmin,如果回收片段大于300bp,此步可跳過;3)將溶解液體 加至吸附柱中,l〇〇〇〇g離心15s,倒掉收集管中的液體,將吸附管放置同一個(gè)收集管中;4) 在吸附柱中加入500 μ L Wl液,IOOOOg離心15s,倒掉收集管中的液體,將吸附管放于同一 個(gè)收集管中;5)在吸附柱中加入500 μ L Wl液,室溫靜置lmin,IOOOOg離心15s,倒掉收集 管中的液體,將吸附管放于同一個(gè)收集管中;6) IOOOOg離心lmin,將吸附柱放于另一個(gè)干 凈的1.5mLEP管中,在吸附膜的中間加30μLTl液,靜置lmin,10000g離心lmin,-2(rC 保存待用。如果室溫低于20°C,可延長(zhǎng)室溫放置時(shí)間,或在37°C溫浴lmin,以保證DNA充分 洗脫?;厥盏拿盖蠨NA片段與同樣酶切凝膠回收純化(按照上述酶切PCR擴(kuò)增DNA片段的 步驟操作)的原核表達(dá)載體pET21a連接(Novagen公司產(chǎn)品),連接反應(yīng)體系為(總體積為 10μL) :pET21a載體片段lμL,T4DNA連接酶lμL,10XT4DNAbuf?erlμL,目的片段7μ