專(zhuān)利名稱(chēng)：截短的細(xì)粒棘球蚴eg95蛋白重組畢赤酵母高密度發(fā)酵工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組酵母的發(fā)酵工藝，確切講本發(fā)明涉及一種截短的細(xì)粒棘球蝴EG95蛋白的tEG95重組畢赤酵母高密度發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
棘球蝴病(Echinococcosis)又稱(chēng)包蟲(chóng)病(Hydatid disease),是對(duì)人畜危害極為嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲(chóng)疾病。該病呈世界性分布，我國(guó)是包蟲(chóng)病發(fā)病最高的國(guó)家之一。在我國(guó)以囊型包蟲(chóng)病(cystic echinococcosis, CE)為主。CE對(duì)人畜危害極為嚴(yán)重,人可因誤食蟲(chóng)卵感染該病，在肝、肺等器官形成占位性病灶。各種動(dòng)物(包括人)都可因囊泡破裂而產(chǎn)生嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)而突然死亡。該病可導(dǎo)致我國(guó)畜牧業(yè)每年直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)30多億 元，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅我國(guó)流行區(qū)農(nóng)、牧民身體健康和畜牧業(yè)的發(fā)展，是“健康中國(guó)2020行動(dòng)計(jì)劃”規(guī)劃防治的五大寄生蟲(chóng)病之一。由于對(duì)中間宿主接種疫苗可控制包蟲(chóng)病的流行，因此通過(guò)免疫預(yù)防途徑控制和消滅包蟲(chóng)病是一項(xiàng)有效的措施和較為理想的途徑。研究證實(shí)，棘球絳蟲(chóng)六鉤蝴分泌抗原具有較好的保護(hù)作用，但無(wú)法使其在體外培養(yǎng)中大量增殖，抗原來(lái)源量有限，限制了其在免疫預(yù)防中的廣泛應(yīng)用。如何找到一種可大量增殖棘球絳蟲(chóng)六鉤蝴分泌抗原是現(xiàn)階段的要解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供對(duì)重組的細(xì)粒棘球蝴EG95蛋白進(jìn)行高效表達(dá)的高密度發(fā)酵方法以大量增殖并獲得棘球絳蟲(chóng)六鉤蝴分泌抗原，特別是一種對(duì)截短的細(xì)粒棘球蝴EG95蛋白的tEG95重組畢赤酵母進(jìn)行高密度發(fā)酵方法。本發(fā)明上述內(nèi)容是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)挑取I個(gè)重組酵母工程菌單克隆EG95-1到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至菌液0D_為5. 0左右，得到一級(jí)種子培養(yǎng)液；再將上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接BMGY培養(yǎng)基，培養(yǎng)至菌液濃度OD6tltl達(dá)到40. 0左右，得到發(fā)酵工作種子液，上述培養(yǎng)過(guò)程均在28°C下進(jìn)行。本發(fā)明所使用的重組酵母工程菌單克隆EG95-1菌株系發(fā)明人構(gòu)建并鑒定，并于2012年02月16日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No5764(北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏號(hào)為CGMCC No5764,分類(lèi)命名巴斯德赤畢酵母(Pichia pastoris)。本發(fā)明的截短的細(xì)粒棘球蝴EG95蛋白(tEG95)重組畢赤酵母高密度發(fā)酵方法是將由前述的將發(fā)酵工作種子液按I : 10的體積比轉(zhuǎn)接于2000mL BSM液體培養(yǎng)基，調(diào)整培養(yǎng)基pH到5. 5開(kāi)始增菌，增菌過(guò)程補(bǔ)加含50% (W/V)甘油和I. 2% (V/V)PTM1的水溶液的補(bǔ)料I溶液，待菌液0D_達(dá)到90. 0左右，即重組酵母菌濕重達(dá)到140mg/mL左右，停加補(bǔ)料I溶液并繼續(xù)培養(yǎng)至耗盡甘油(，此時(shí)菌液OD6tltl約為72. 00，濕重約為150mg/mL)，再在培養(yǎng)體系中分階段加入含I. 2% (V/V)PTM1的甲醇溶液的補(bǔ)料2溶液進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，第一階段的補(bǔ)料2的補(bǔ)加流速為10mL/h，補(bǔ)加3h，停加補(bǔ)料2約lh，至誘導(dǎo)后4h ;第二階段的補(bǔ)料2的補(bǔ)加流速為15mL/h,補(bǔ)加5h,停加2h,至誘導(dǎo)后Ilh ;第三階段的補(bǔ)料2的補(bǔ)加流速為20mL/h,補(bǔ)加IOh,停加3h,至誘導(dǎo)后24h ;第四階段的補(bǔ)加流速為25mL/h,補(bǔ)加72h,至誘導(dǎo)后96h，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的溫度均為28°C。相關(guān)研究表明，EG95蛋白具有良好的免疫保護(hù)作用，可以通過(guò)基因工程技術(shù)生產(chǎn)。在現(xiàn)有的真核表達(dá)系統(tǒng)中，畢赤酵母表達(dá)體系具有幾大優(yōu)勢(shì)，包括可以在高細(xì)胞密度發(fā)酵罐培養(yǎng)基培養(yǎng)，蛋白表達(dá)成本低，蛋白表達(dá)量高，蛋白可以分泌表達(dá)，表達(dá)蛋白純度高，也易于純化，并且可以使外源蛋白在發(fā)酵罐中的表達(dá)水平比普通搖瓶提高10 100倍，完全可以滿(mǎn)足大規(guī)模生產(chǎn)的需要。我們的相關(guān)發(fā)明中首次在酵母表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)對(duì)EG95蛋白進(jìn)行了分泌表達(dá)。本發(fā)明主要提供一種對(duì)表達(dá)EG95目的蛋白的重組畢赤酵母進(jìn)行高密度發(fā)酵的工藝，這為細(xì)粒棘球蝴EG95基因工程疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)和最終應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明中所用的重組畢赤酵母為重組了細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)EG95蛋白基因的畢赤酵母。經(jīng)相關(guān)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明為首次用重組畢赤酵母菌在發(fā)酵罐內(nèi)對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng) EG95蛋白進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)。本發(fā)明的蛋白表達(dá)過(guò)程具有操作簡(jiǎn)單，蛋白表達(dá)成本低，蛋白可溶性表達(dá)，蛋白表達(dá)量高的優(yōu)點(diǎn)。其目的蛋白在發(fā)酵上清液中的濃度高達(dá)4. 62g/L。


圖I為高效表達(dá)細(xì)粒棘球蝴EG95-1蛋白的重組畢赤酵母EG95-1高密度發(fā)酵上清液的SDS-PAGE電泳圖譜，圖中M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1. EG95-1重組菌未誘導(dǎo)時(shí)的菌上清液蛋白；2. EG95-1重組菌誘導(dǎo)72h的發(fā)酵上清液蛋白；3. EG95-1重組菌誘導(dǎo)96h的發(fā)酵上
清液蛋白。圖2是本發(fā)明中為測(cè)定發(fā)酵上清液中蛋白濃度所做的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
權(quán)利要求
1.截短的細(xì)粒棘球蝴EG95蛋白的tEG95重組畢赤酵母高密度發(fā)酵方法中發(fā)酵前的工作種子培養(yǎng)方法，其特征在于挑取I個(gè)重組酵母工程菌EG95-1的單克隆于YPD液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至菌液OD6tltl為5. 0左右，得到一級(jí)種子培養(yǎng)液；再將上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接BMGY培養(yǎng)基，培養(yǎng)至菌液濃度0D_達(dá)到40. 0左右，得到發(fā)酵工作種子液，上述培養(yǎng)過(guò)程均在28°C下進(jìn)行，其中的重組酵母工程菌EG95-1單克隆菌株于2012年02月16日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No5764。
2.截短的細(xì)粒棘球蝴EG95蛋白tEG95重組畢赤酵母高密度發(fā)酵方法，其特征在于將由權(quán)利要求I所述的將發(fā)酵工作種子液按I : 10的體積比轉(zhuǎn)接于2000mL BSM液體培養(yǎng)基，調(diào)整培養(yǎng)基PH到5. 5開(kāi)始增菌，增菌過(guò)程補(bǔ)加含重量體積比為50%甘油和體積比為I. 2%PTMl的水溶液的補(bǔ)料I溶液，待菌液0D_達(dá)到90. 0左右，即重組酵母菌濕重達(dá)到140mg/mL左右，停加補(bǔ)料I溶液并繼續(xù)培養(yǎng)至耗盡甘油，再在培養(yǎng)體系中分階段加入含體積比為I.2% PTMl的甲醇溶液的補(bǔ)料2溶液進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，第一階段的補(bǔ)料2的補(bǔ)加流速為 10mL/h,補(bǔ)加3h,停加補(bǔ)料2約Ih,至誘導(dǎo)后4h ;第二階段的補(bǔ)料2的補(bǔ)加流速為15mL/h,補(bǔ)加5h，停加2h，至誘導(dǎo)后Ilh ;第三階段的補(bǔ)料2的補(bǔ)加流速為20mL/h，補(bǔ)加10h，停加3h，至誘導(dǎo)后24h ;第四階段的補(bǔ)加流速為25mL/h，補(bǔ)加72h，至誘導(dǎo)后96h，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的溫度均為28°C。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種截短的細(xì)粒棘球蚴EG95蛋白的tEG95重組畢赤酵母高密度發(fā)酵方法。本發(fā)明所使用的重組酵母工程菌單克隆EG95-1菌株系發(fā)明人構(gòu)建并鑒定，并于2012年02月16日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No5764。本發(fā)明的發(fā)酵方法是將發(fā)酵工作種子液轉(zhuǎn)接于BSM液體培養(yǎng)基，調(diào)整培養(yǎng)基pH到5.5開(kāi)始增菌，增菌過(guò)程補(bǔ)加含甘油和PTM1的水溶液，再在培養(yǎng)體系中分階段加入含PTM1的甲醇溶液的溶液進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。
文檔編號(hào)C12N1/16GK102732436SQ201210103719
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月10日
發(fā)明者倪興維, 婁忠子, 李宏民, 賈萬(wàn)忠, 閆鴻斌 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所